Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Die Autoren erkennen dankbar, Förderung durch die DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 und TRR 241. Die Optical Imaging Zentrum Erlangen (Hauptsitz) und in bestimmten Ralf Palmisano, Philipp Tripal und Tina Fraaß (Projekt Z2 der DFG SFB 1181) sind anerkannt für kompetente technische Unterstützung für die Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung.

Experimente mit Tieren wurden gemäß Protokollen genehmigt von den zuständigen örtlichen Behörden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) durchgeführt. Mäuse wurden unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht. Die Sammlung von menschlichem Blut wurde durch die lokale Ethikkommission und der institutionellen Review Board der Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt. Jeder Patient hat schriftliche Einwilligungserklärung.
1. allergische Lungenentzünd...

Die hier beschriebenen experimentellen Einstellung bietet die Möglichkeit, homing Lungenkapazität von primären menschlichen Immunzellen unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen und damit einschlägig ergänzt klassisch überwachen in-vitro-Adhäsion und Chemotaxis durchgeführt Assays. Um die Berücksichtigung der spezifischen anatomischen Organ Merkmale der Lunge zu berücksichtigen, haben wir wichtige Aspekte der Immunzelle homing (einschließlich Chemotaxis und Zelle Verteilung in das ...

Klassische entzündliche Erkrankungen der Lunge, wie allergisches Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) sind bekannt durch eine verstärkte Rekrutierung von aktivierten Lymphozyten in der pulmonalen Gewebe1,2getrieben werden. Lymphozyten freigegeben Zytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ und TNF-α) fördern Chemotaxis von angeborenen und der adaptiven Immunzellen, induzieren fibrotische Atemwege Umbau oder direkt schädigen die Lunge Parenchym2. Bisher sind verantwortlich für die pathologische Ansammlung von Lymphozyten im Lungengewebe zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig verstanden. In Analogie zur Gewebe-selektive T-Zell-Prägung für Darm und Haut Homing beschrieben, pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind offensichtlich in der Lage, auf peripheren T-Zellen für bevorzugte Lung Infiltration, zumindest teilweise über die Induktion von CCR4 Ausdruck prime die Oberfläche von Lymphozyten3. Neben CCR4 zeichnen sich die Atemwege infiltrieren T-Zellen auch durch einen besonders erhöhten Ausdruck der Chemokin-Rezeptoren CCR5 und CXCR3 im Vergleich zu T-Zellen im peripheren Blut1,4,5. Insgesamt, vorhandene Daten stehen im Einklang mit dem Konzept, dass Lungenkrebs Homing von T-Lymphozyten unter physiologischen oder entzündlichen Bedingungen eine Reihe von verschiedenen Chemokin-Rezeptoren und ihrer jeweiligen Liganden beinhaltet und somit entscheidend abhängig ein eng Zusammenarbeit zwischen angeborenen und der adaptiven Immunzellen1gesteuert. Vor allem in der Anfangsphase der Erreger oder Allergen-Exposition reagieren Zellen des angeborenen Immunsystems TLR Stimulation oder IgE-vermittelten Vernetzung durch die sofortige Freilassung von verschiedenen Chemoattractants wie LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 und PID21,6,7. Als Paradebeispiel das Zusammenspiel von PID2 und der Lockstoffgradient-Rezeptor CRTh2 ist bekannt, dass für Chemotaxis von Th2-Zellen von besonderer Bedeutung und so erschien als vielversprechende therapeutische Ziel in die klinische Behandlung von Asthma. In der Tat zeigten Patienten mit moderaten Asthma eine Besserung der Symptome und eine deutliche Zunahme der erzwungenen exspiratorischen Volumen in einer Sekunde (FEV1) nach der Behandlung mit einem selektiven CRTh2-Antagonisten im Vergleich zu der Placebo-Gruppe8 ,9. Bereits rekrutierte T-Zellen können in einem mehr fortgeschrittenen Zustand der Entzündungsreaktion pulmonale Lymphozyten Akkumulation über die Freisetzung von IL-4 und IL-13 als potenter Stimulus für pulmonale DCs weiter verstärken. Anschließend, Regeln bis-diese myeloische abgeleitet angeborene Zellen die Expression von CCL17 und CCL22 in einem STAT6-abhängigen Weise1,10,11.  Obwohl die Komplexität des beschriebenen Szenarios noch ein vollständiges Verständnis der T-Zell-Lunge homing behindert, bietet es eine Fülle von molekularen Zielstrukturen für eine potenziell optimierte therapeutische Kontrolle der entzündliche oder allergische Lungenerkrankungen. Daher ist dringend innovative experimentelle Techniken, die sind in der Lage weiter zu vertiefen und ergänzen unser Wissen im Bereich der T-Zell-Chemotaxis und Lunge Homing.
Die Lunge Homing von Lymphozyten innerhalb des menschlichen Körpers durch mehrere zelluläre und humorale körperliche Parameter1beeinflusst wird, sind die meisten der vorhandenen experimentellen Methoden nicht in der Lage, die ganze Komplexität dieser immunologischen Prozess zu modellieren. Stattdessen konzentrieren sich viele standard-Protokolle für die Analyse der Lunge homing selektiv auf einen bestimmten Aspekt der Kaskade von Lymphozyten Attraktion, Adhäsion, Migration und Aufbewahrung beteiligt. Neben einer rein beschreibenden Bestimmung der mRNA oder Protein Expressionsmuster der Integrine und Chemokin-Rezeptoren auf periphere oder Lunge infiltrieren Lymphozyten und die ergänzende Messung des jeweiligen Chemokin-Spiegel im Blut, alvéolaire Lavage (BAL) oder pulmonale Gewebe12,13,14,15, etablierten in-vitro-Zelle-Kultur-Assays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung von Lymphozyten Haftung oder chemotaxis nach definierten Versuchsbedingungen16,17,18. Im Prinzip überwachen statische Haftung in-vitro-Tests die Bindungskapazität von kultivierten Lymphozyten eine endotheliale Monolage oder Glas-Objektträger beschichtet mit rekombinanten endothelialen Adhäsionsmoleküle (z. B. MAdCAM-1, VCAM-1), während der Standard in-vitro- Chemotaxis-Assays sind in der Regel angewendet, um die Fähigkeit von Lymphozyten, entlang eines Chemokin-Gradienten in ein Transwell System19migrieren zu quantifizieren. Sowohl in-vitro-Einstellungen ermöglichen eine kontrollierte Anpassung und Modulation der experimentellen Bedingungen, aber auf der anderen Seite fehlen wichtige Variablen, die bekanntermaßen kritisch Einfluss auf in-vivo Chemotaxis und Adhäsion von Lymphozyten. Überwiegend statische Zelle Kultur Assays missachten den Einfluss von Scherkräften verursacht durch die permanente Blut fließen19 und potenziell vernachlässigen die Einbeziehung der umliegenden immunologische Milieu und interagierenden-Lymphozyten Immunzellen, die beiden präsentieren in einem lebenden Organismus. Um diese Einschränkungen zu überwinden, die Interpretation der Ergebnisse erwarb statische in-vitro-Chemotaxis oder die Einhaltung von Untersuchungen benötigen weitere Validierung in dynamischen Adhäsion Experimente unter Strömung Bedingungen20,21 und in in Vivo Modelle von entzündlichen Orgel Pathologie19. In der Tat geändert wichtige Rückschlüsse auf die Regulierung der T-Zell-Lunge homing entzündliche oder allergische Bedingungen aus tierexperimentellen Studien gezogen werden könnten genetisch Analyse Mäuse in definierten Modelle von verschiedenen Lungenkrankheiten3, 22 , 23. der quantitativen Vergleich der Lunge infiltrieren Lymphozyten zwischen Wildtyp-Mäusen und Mäuse mit einem Mangel, denn ein bestimmtes Gen des Interesses, eine etablierte und allgemein verwendete Werkzeug zur Definition der Auswirkungen von bestimmten Mobilfunk dar Wege oder auf die Erkrankung ausgerichtete Verteilungsmuster T-Zell-Rezeptoren. Jedoch fehlt im Gegensatz zu vor in-vitro-Zelle-Kultur-Assays, diskutiert ein Studiendesign, basierend auf klassischen Tiermodellen die Möglichkeit, analysieren und überwachen der primären menschlichen T-Zellen direkt abgeleitet aus dem Blut oder BAL von Patienten mit einer entzündlichen Lunge Erkrankung. Somit bleibt es weiterhin schwierig, funktional zu überprüfen, ob eine diagnostisch angegebenen Lungenerkrankung ist in der Lage, Impressum menschliche Lymphozyten für bevorzugte Lunge Tropismus und wie weit klinische Parameter auf dieses Szenario auswirken könnte. Vor kurzem wurde ein sehr eleganter in-vivo-Ansatz im Zusammenhang mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) eingeführt, die war in der Lage, die meisten dieser Einschränkungen zu überwinden und eröffnet neue Wege für die translationale Hauptstudium am Darm Lymphozyten homing24 . Unter Ausnutzung der Protokolle für lösemittelhaltige Gewebe Clearing gefolgt von Cross-sectional Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie als eine leistungsfähige imaging-Tool, war es möglich, die Infiltration und die Verteilung der adoptively übertragenen menschlichen T-Zellen visualisieren im Darm von colitic immungeschwächte Mäuse24. Insbesondere diese experimentelle Einstellung implementiert zwei wesentliche Neuerungen: (1) primäre menschliche Immunzellen analysiert werden können, unter experimentell definierten in vivo Bedingungen; (2) eine ziemlich große Fläche des erkrankten Organs (ca. 1,5 x 1,5 cm) in hochauflösender Qualität, gefolgt von 3D-Rekonstruktion abgebildet werden können. Darüber hinaus stellte mehrere neuere Studien erfolgreich die Verwendung von lösungsmittelhaltigen Gewebe clearing und Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie als wichtige Werkzeuge für die fortgeschrittenen Lungenkrebs imaging25,26. Um von diesem technologischen Fortschritt auf dem Gebiet der pulmonalen Immunologie zu profitieren, haben wir nun das System für die Analyse der Lunge Homing angenommen.
Die hier vorgestellte Protokoll bietet einer schrittweisen Einführung wie zu reinigen und Eindringmittel Label primären menschlichen T-Zellen für den Transfer in Mäusen mit induzierten Lungenentzündung und darüber hinaus beschreibt im Detail den nachfolgenden Prozess der Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung, einschließlich Orgel Vorbereitung und Bildverarbeitung. Alles in allem hoffen wir, künftige translationale Studien auf dem Gebiet der entzündlichen oder allergischen Lungenerkrankungen zu unterstützen, durch die Einführung einer anspruchsvollen, aber dennoch machbar, experimentellen Modell für die Überwachung der menschlichen Lymphozyten Lunge Homing auf in-vivo-Bedingungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Überwältigend Gewebe Ansammlung von hoch aktivierten Immunzellen ist ein Markenzeichen der verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und erwies sich als ein attraktives therapeutische Ziel in die klinische Behandlung der betroffenen Patienten. Um Strategien zur therapeutischen Regulierung der pathologisch unausgewogen Gewebe eindringen von Pro-inflammatorischen Immunzellen weiter zu optimieren, wird es von besonderer Bedeutung für bessere Einblicke in Krankheit und organspezifischen zu erreichen sein. Homing Eigenschaften des peripheren Lymphozyten. Die hier beschriebenen experimentelle Protokoll ermöglicht, um Lunge Anhäufung von Eindringmittel beschriftet und adoptively übertragenen menschlichen Lymphozyten im Zusammenhang mit Papain-induzierten Lungenentzündung zu überwachen. Die jetzt eingeführte in-vivo-Einstellung berücksichtigt im Gegensatz zum standard in-vitro-Untersuchungen häufig verwendet für die Analyse der Immunzelle Migration und Chemotaxis Lunge-spezifische Aspekte der Gewebe-Organisation und der Einfluss des Komplexes entzündliche Szenario in murinen Lebewesen stattfindet. Darüber hinaus dreidimensionale Cross-sectional Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung bietet nicht nur quantitative Daten an Immunzellen zu infiltrieren, sondern zeigt auch das Muster der Immunzelle Lokalisierung innerhalb der entzündeten Lunge. Insgesamt sind wir in der Lage, eine innovative Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, einzuführen, die leicht anhand der zur Verfügung gestellten schrittweise Protokoll angewendet werden können.

Die vorgestellte Protokoll beschreibt einen experimentellen Mausmodell, die Überwachung und Quantifizierung der Ansammlung von adoptively übertragenen menschlichen T-Lymphozyten in der Lunge über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Abbildung 1 A stellt eine schematische Übersicht über die in-vivo Schritte des experimentellen Zeitplans. Um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren, es ist von wesentlicher Bedeutung, um eine gute Qualität von der isolierten u...

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Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Unsere Technik ermöglicht die präzise Abbildung von lungenakkumulierten menschlichen Immunzellen in in vivo entzündlichen Bedingungen und liefert spannende Einblicke in den Prozess der T-Zell-Lungenhoming. Dieses Protokoll unterstützt die translationale Forschung zur T-Zell-Lungenhoming und kann damit bei der Identifizierung neuer Ziele für eine optimierte Therapie von entzündlichen oder allergischen Lungenerkrankungen helfen. Insbesondere die Fähigkeit, den Einfluss von krankheitsspezifischen Immunzelleigenschaften, Lungengewebeorganisation und entzündlichem Milieu auf T-Zell-Lungenhoming zu berücksichtigen, macht diese Methode sehr vorteilhaft.Insgesamt ist unsere Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, die oft durch eine überwältigende Gewebeansammlung aktivierter Immunzellen angetrieben werden. Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einer mindestens 16-Gramm- und sechs Wochen alten, betäubten C57-Schwarz-6J-Maus bestätigt haben, verwenden Sie ein Mikropipet, um langsam 10 Mikroliter frisch zubereitete Papainlösung einmal täglich für drei aufeinander folgende Tage in ein Nasenloch der Maus zu liefern. Am Tag nach der letzten Papain-Verabreichung Schicht 10 Milliliter Ficoll Medium unter menschlichem peripherem Blut von einem gesunden Freiwilligen vorverdünnt mit einem Eins bis zwei Verhältnis in PBS für Dichte Gradiententrennung durch Zentrifugation.Übertragen Sie die periphere mononukleäre Blutzelle oder PBMC-Interphasenschicht in eine neue 50-Milliliter-Röhre und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Als nächstes führen Sie die magnetische Mikroperle-Isolierung von CD4-positiven Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll durch. Wiederaussetzung der perlenisolierten CD4-positiven T-Zellen bei bis zu einem mal zehnmal bis siebten T-Zellen pro mindestens 500 Mikroliter PBS-Konzentration.Beschriften Sie die Zellen mit einem geeigneten rotlichten erregbaren Zellproliferationsfarbstoff für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, halten Sie die Etikettierungsreaktion mit fünf Bänden RPMI Medium ergänzt mit 10%FBS für fünf Minuten auf Eis gefolgt von drei Wassin im Medium. Für die Adoptivübertragung der menschlichen CD4-positiven T-Zellen in papainexponierte Empfängermäuse die fluoreszierend beschrifteten T-Zellen auf ein mal 10 bis siebte Zelle pro Milliliter Konzentration in PBS wieder aufsetzen und 100 Mikroliter Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze laden, die mit einer 30-Spur-Nadel pro Empfängertier ausgestattet ist, und dann das gesamte Zellvolumen einer Spritze in die Schwanzvene eines mit Papain behandelten Tieres injizieren, das die Nadelspitze in der Vene für eine zusätzliche fünf Sekunden nach der Zellabgabe, um die Entladung der Zellsuspension zu verhindern.Drei Stunden nach der Adoptivzellübertragung durchstechen Sie den rechten Ventrikel jeder eingeschläferten Maus mit einer 21-Spur-Kanüle, die mit einem Katheter verbunden ist, und machen Sie einen Schnitt in der linken Herzkammer. Durchdringen Sie die Lunge langsam mit 20 Millilitern eiskaltem PBS, ergänzt durch fünf Millimolar EDTA, gefolgt von zwei Millilitern eiskaltem 4%Paraformaldehyd. Wenn alle Fixierungsmittel durch das Gewebe gespült wurde, entfernen Sie die Speicheldrüsen und schneiden Sie den Sternhyoidmuskel, damit eine Zange unter die Luftröhre geschoben werden kann, um das Luftrohrgewebe freizulegen.Führen Sie eine erste Punktion der freiliegenden Luftröhre mit einer 30-Spur-Nadel durch, bevor Sie die Nadel durch einen stumpfen 30-Spur-Katheter ersetzen, um weitere Schäden am Gewebe zu verhindern. Verwenden Sie einen Nadelhalter, um die Kreuzung zwischen dem eingelegten Katheter und der Luftröhre zu versiegeln, und füllen Sie die Atemwege vorsichtig mit ca. 37 Grad Celsius 0,75%Agarose bis zur vollständigen Entfaltung der Lunge. Eine enge Verbindung zwischen Katheter und Luftröhre ist entscheidend für die Erweiterung der Lunge auf ihre physiologische Größe und die Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur für die Bildgebung.Wenn die Agarose vollständig verfestigt ist, entfernen Sie den Katheter und übertragen Sie die Lunge vorsichtig in ein abgedunkeltes, zwei-Milliliter-Rohr, das mit 4%paraformaldehdye gefüllt ist. Als nächstes dehydrieren Sie das Gewebe mit sequenziellen Ethanol-Inkubationen unter kontinuierlicher Rotation bei 31 Rotationen pro Minute und vier Grad Celsius, wie für vier Stunden pro Inkubation angegeben. Nach vollständiger Austrocknung die Probe in Ethyl-Cinnamat für eine nächtliche Inkubation bei Raumtemperatur übertragen, bis das Gewebe lichtdurchlässig erscheint.Für eine Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie verwenden Sie einen kleinen Tropfen organischen lösungsmittelstabilen Klebers, um die Lunge an den Probenhalter des Mikroskops zu kleben und den Lungenlappen in aufrechter Position auf den Halter zu setzen. Legen Sie den Probenhalter in seine Kammer und wählen Sie die entsprechenden Laser für das Experiment in der Instrumentensoftware aus. Verwenden Sie als Nächstes die Schieberegler unter Optik, um eine Bogenbreite festzulegen, die eine numerische Blende aufweist, die das gesamte Organ oder einen bestimmten Interessenabschnitt gleichmäßig offenbaren.Verwenden Sie den Schieberegler, um die Laserintensität unter Laserübertragungssteuerung für jeden ausgewählten Laser einzustellen, und klicken Sie auf Anwenden. Verwenden Sie erweiterte Messeinstellungen, um die linken und rechten Lichtblätter zusammenzuführen, um ein homogen beleuchtetes Bild zu erstellen. Definieren Sie die Start- und Endpositionen des Zu messungswerten Z-Stacks unter Scanbereich, und legen Sie die Schrittgröße auf fünf Mikrometer fest, und wählen Sie dann AutoSave aus, um die Dateien automatisch zu speichern, und beginnen Sie mit der Messung, um die Bilder zu erfassen.Wenn alle Bilder erfasst wurden, aktivieren Sie die Surpass-Taste in der 3D-Software für die Post-Imaging-Analyse und laden Sie das erste Bild aus einem Z-Stack, um die Öffnung und automatische 3D-Rekonstruktion aller anderen Bilder des ausgewählten Z-Stacks zu initiieren, und passen Sie dann unter Anzeigeeinstellung die Intensität, den schwarzen Pegel und den Kontrast für jeden Kanal an. Um die Ansammlung menschlicher Zellen innerhalb des Lungengewebes über verschiedene Proben hinweg zu vergleichen, wählen Sie Bearbeiten und Zuschneiden von 3D aus, um einen Lungenwürfel mit einem bestimmten Volumen zu definieren. Um die beschrifteten Zellen innerhalb des definierten Lungenwürfels zu quantifizieren, öffnen Sie Neue Flecken in der Symbolleiste hinzufügen, klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten und den 640-Nanometer-Kanal auswählen.Legen Sie die Radiusskala auf 10,00 Mikrometer fest, klicken Sie auf Auswählen, und klicken Sie unter Bearbeiten, Umschalttaste mit der linken Maustaste, um jede Fluoreszenzzelle einzeln mit einem Punkt zu markieren. Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird in der Statistik angezeigt. Um ein Bild zu erfassen, verwenden Sie das Snapshot-Tool und verwenden Sie das Animationstool, um ein Video aufzunehmen.Mikroperlenbasierte Zellanreicherung und anschließende Fluoreszenzkennzeichnung, wie gezeigt, führen typischerweise zu einer CD4-positiven Reinheit von mindestens 95 % und einer erfolgreichen Kennzeichnung dieser Zellen, wie sie durch Durchflusszytometrie bestimmt wird. Die Gewebeclearingung auf Ethyl-Cinnamat-Basis erreicht eine hohe Organtransparenz, was auf einen erfolgreichen Brechungsindex-Abgleich hindeutet. Das autofluoreszierende Signal des Lungengewebes bietet ein hilfreiches Werkzeug, um die anatomische Struktur der Lunge durch Lichtbogenmikroskopie abzubilden, die als mittlere Intensitätsprojektion oder im Oberflächenmodus angezeigt werden kann.Im Vergleich zur konventionellen Mikroskopie bietet die Lichtbogenmikroskopie den Vorteil einer gesamten Organbildgebung und nachfolgenden 3D-Rekonstruktion, die die Identifizierung und Visualisierung von proliferationsgefärbten, übertragenen menschlichen T-Zellen im Kontext des gesamten Organs ermöglicht, darüber hinaus wird die Präferenz übertragener menschlicher T-Zellen für die selektive Akkumulation im entzündeten Lungengewebe von papainexponierten Tieren durch die Tatsache unterstützt, dass menschliche CD4-positive T-Zellen nicht aus der Darmschleimhaut des Tieres entnommen werden können. Für die Quantifizierung und den Vergleich der Lungenakkumulation menschlicher CD4-positiver T-Zellen zwischen verschiedenen Bedingungen können die markierten Zellen auch in mehreren Lungenwürfeln mit definiertem Volumen gezählt werden, wie gezeigt. Eine sorgfältige Gewebeaufbereitung einschließlich Lungenperfusion, Inflation und Gewebereinigung ist für eine optimierte Erzeugung hochauflösender lichtbogenmikroskopischer Bilder sehr wichtig.Um die erfolgreiche Diapedese übertragener menschlicher Lymphozyten weiter zu bestätigen, kann dieses Protokoll leicht mit der zytometrischen Durchflussquantifizierung menschlicher Lymphozyten innerhalb der murinen Bronchoalveolar-Lava gekombiniert werden. Die Fähigkeit, Immunzellen von einzelnen Patienten unter in vivo Bedingungen zu überwachen, unterstützt die Identifizierung funktioneller Veränderungen in Immunzellen, die durch eine bestimmte Krankheit oder Therapie geprägt sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medizin

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Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

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Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

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