Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

המחברים להכיר בהכרת תודה מימון על ידי 1181 SFB של מרכזי מחקר DFG שיתופי trr ב 241. אופטי הדמיה מרכז ארלאנגן (OICE) ואת מסוים ראלף Palmisano, פיליפ Tripal, טינה Fraaß (פרוייקט Z2 של 1181 CRC DFG) הם הכירו עבור מומחה תמיכה טכנית עבור הדמיה מיקרוסקופי אור גיליונות זריחה.

הניסויים המערבות בעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיים בארלנגן (Regierung פון Unterfranken, וירצבורג, גרמניה). עכברים שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. האוסף של דם אנושי אושרה על ידי הוועדה המקומית אתית מוסדית מועצת המנהלים של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג. כל מטופל ?...

ההגדרה ניסיוני שתואר כאן מספק ההזדמנות כדי לפקח על ביות ריאות של תאים חיסוניים האנושי הראשי תחת התנאים דלקתית ויוו, ובכך relevantly משלים בסגנון קלאסי הופיעה אדהזיה במבחנה כימוטקסיס מבחני. כדי לקחת בחשבון מאפיינים איבר אנטומי ספציפי של הריאה, היבטים חשובים של תאים חיסוניים ביו...

הפרעות דלקתיות קלאסי של הריאות, כגון אסטמה אלרגית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ידועים היטב כדי להיות מונע על ידי גיוס מוגבר לימפוציטים מופעל לתוך רקמת הריאה1,2. ציטוקינים שפורסמו לימפוציטים (למשל, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ ו- TNF-α) לקדם כימוטקסיס של תאים חיסוניים מולדת, גמישים, זירוז שיפוץ שהותירה דרכי הנשימה או ישירות לנזק parenchyma הריאה2. עד כה, המנגנון הבסיסי אחראי הצטברות פתולוגי של לימפוציטים בתוך רקמת הריאה אינם עדיין לגמרי מובנים. בהשוואה כדי החתמה תא T סלקטיבי רקמות המתוארות עבור יונת במעיים, עור, ריאות תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים כמובן פריים היקפיים בתאי T ריאות מועדף חדירה, לפחות חלקית דרך אינדוקציה הביטוי CCR4 על פני השטח של לימפוציטים3. חוץ CCR4, הסתננות דרכי הנשימה תאי T מאופיינים גם ביטוי מוגבר במיוחד של קולטני כימוקין CCR5, CXCR3 לעומת תאי T בתוך4,1,5דם היקפיים. באופן כללי, קיימים נתונים עקביים עם הרעיון כי הריאות יונת של לימפוציטים מסוג T בתנאים פיזיולוגיים או דלקתיים כרוך במספר רצפטורים שונים כימוקין ליגנדים בהתאמה שלהם, ובכך מכרעת תלוי מקרוב נשלט שיתוף פעולה בין תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת1. במיוחד, בשלב הראשוני של חשיפה פתוגן או אלרגן, תאים של מערכת החיסון המולדת להגיב TLR גירוי או cross-linking בתיווך IgE על ידי שחרור מיידי של chemoattractants שונים, כמו LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 ו- PGD21,6,7. בתור דוגמה, האינטראקציה בין PGD2 הקולטן chemoattractant CRTh2 ידוע שיש חשיבות מיוחדת עבור כימוטקסיס תאי Th2 והופיע ובכך מבטיח כמו מטרה טיפולית ניהול קליני של אסטמה. אכן, חולי אסטמה מתונה הראה שיפור בסימפטומים, עלייה משמעותית של אמצעי האחסון expiratory בכפייה בשנייה אחת (FEV1) לאחר הטיפול עם אנטגוניסט CRTh2 סלקטיבית לעומת פלסבו קבוצה8 ,9. במצב יותר שהתמשכו של תגובת דלקתית, תאי T וגייסנו כבר מסוגלים להגביר עוד יותר לימפוציטים ריאתי הצטברות באמצעות השחרור של IL-4 ו- IL-13 בתור לגירויים חזק עבור בקרי התחום ריאתי. לאחר מכן, אלו תאים מולדת מיאלואידית נגזר למעלה-לווסת את הביטוי של CCL17, CCL22 STAT6 תלויית האופן1,10,11.  למרות המורכבות של התרחיש המתואר מעכבת עדיין הבנה מלאה של תא T ריאות ביות, המלון מציע שפע של מטרות מולקולריות עבור פקד טיפולית פוטנציאל אופטימיזציה של מחלות דלקתיות או אלרגיות. לכן, יש צורך דחוף של טכניקות חדשניות ניסיוני, אשר מסוגלים להעמיק עוד יותר ולהשלים את הידע שלנו בתחום של תא T כימוטקסיס, יונת ריאות.
בשל העובדה כי יונת ריאות של לימפוציטים בתוך גוף האדם מושפע על ידי פרמטרים הסלולר, ההורמונאלית והפיזי מספר1, מרבית השיטות ניסיוני הקיימים אינם מסוגלים דגם כל המורכבות של תהליך אימונולוגי. במקום זאת, רבים פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח של הריאה ביות באופן סלקטיבי להתמקד על היבט מסוים מעורב המפל של לימפוציטים משיכה, הדבקות, העברה ושמירה. מלבד החלטה תיאורי גרידא של הדפוס ביטוי mRNA או חלבון של רצפטורים אינטגרינים ו כימוקין על לימפוציטים היקפיים או ריאות הסתננות ומדידה משלימים המתאימים כימוקין רמות בדם. bronchoalveolar שטיפה (BAL) או רקמת הריאה12,13,14,15, מבחני תרבות תא במבחנה ומבוססת לאפשר אפיון פונקציונלי של לימפוציטים אדהזיה או כימוטקסיס על הגדרת תנאים ניסיוני16,17,18. בעקרון, מבחני אדהזיה במבחנה סטטי לפקח הקיבולת איגוד של לימפוציטים בתרבית של טפט אנדותל או שקופיות זכוכית מצופה מולקולות אדהזיה אנדותל רקומביננטי (כגון MAdCAM 1, VCAM-1), תוך גופית רגילה מבחני כימוטקסיס חלים בדרך כלל על מנת לכמת את היכולת של לימפוציטים להעביר לאורך הדרגתי כימוקין מערכת transwell19. שתי ההגדרות במבחנה לאפשר התאמה מבוקרת עם אפנון של תנאי הניסוי, אך מאידך חסר משתנים חשובים ידוע באופן ביקורתי את ההשפעה על כימוטקסיס ויוו והצמדות של לימפוציטים. בעיקר, מבחני תרבות תא סטטי להתעלם השפעת כוחות הטיה הנגרמת על ידי זרימת דם קבוע19 , פוטנציאל להזניח את המעורבות של חצרו אימונולוגי שמסביב תאים חיסוניים אינטראקציה אי-לימפוציטים, שניהם מציגים אורגניזם חי. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הפרשנות של התוצאות שהושגו סטטי במבחנה מבחני כימוטקסיס או הדבקות צריך עוד יותר אימות בניסויים אדהזיה דינמי תחת זרימה תנאים20,21 וב ב מודלים vivo של פתולוגיה דלקתית איברים19. אכן, חשוב יכול ניתן להסיק מסקנות על התקנון של תא T ריאות ביות בתנאים דלקתית או אלרגי מחקרים בבעלי חיים ניתוח גנטית שונה עכברים מודלים מוגדרים של מחלות שונות3, 22 , 23. ההשוואה הכמותית הריאה שחדר לימפוציטים בין wildtype עכברים ועכברים עם מחסור עבור גנים ספציפיים עניין מייצג כלי ומבוססת ומשמש באופן נרחב עבור הגדרת את ההשפעה של סלולרי מסוים מסלולים או רצפטורים על התבנית מונחה-מחלה של התפלגות T cell. עם זאת, בניגוד ל לפני דנו תא במבחנה מבחני תרבות, עיצוב המחקר מבוסס על מודלים קלאסיים חסרה את היכולת לנתח ולנטר העיקרי בתאי T האדם נגזרת ישירות בדם או BAL של חולים הסובלים ריאה דלקתיות המחלה. לכן, זה עדיין נשאר מאתגר לאמת באופן פונקציונלי אם מחלת ריאות אבחונית שצוין הוא מסוגל להטביע לימפוציטים אנושיים tropism ריאות מועדף, עד כמה פרמטרים קליניים העלולים להשפיע על התרחיש הזה. לאחרונה, בגישה ויוו אלגנטי מאוד הוצג בהקשר של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר היה מסוגל להתגבר על רוב מגבלות אלה ופתח אפיקים חדשה השתלמות translational על לימפוציטים מעיים ביות24 . תוך ניצול פרוטוקולים עבור ניקוי רקמות ממס מבוסס ואחריו קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך הרוחב מיקרוסקופ הדמיה ככלי רב עוצמה, זה היה אפשר לדמיין את חדירה והפצה של תאי T אדם הועבר adoptively במעי של עכברים immunodeficient colitic24. בפרט, הגדרה ניסויית זו מיושמת שני חידושים עיקריים: (1) ראשי תאים חיסוניים האנושי ניתן לנתח בתנאים ויוו השפעול מוגדרים; (2) שטח די גדול של האיבר הפגוע (כ 1.5 ס מ x 1.5 ס מ) יכול לדימות באיכות ברזולוציה גבוהה, ואחריו 3D-שיקום. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מספר בהצלחה הקים השימוש ממס מבוסס רקמות ניקוי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות ככלים חשובים ריאה מתקדם הדמיה25,26. על מנת להפיק תועלת זו התקדמות טכנולוגית בתחום אימונולוגיה ריאתי, אנחנו עכשיו אימצו את השיטה לניתוח של יונת ריאות.
פרוטוקול שהוצגו כאן מספק הקדמה צעד אחר צעד איך לטהר ותווית fluorescently T אנושיים ראשי תאים עבור העברת לתוך עכברים עם דלקת ריאות המושרה, יתר על כן, מתאר בפירוט את התהליך עוקבות של אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיים, כולל עוגב הכנה ועיבוד תמונה. בסך הכל, אנו מקווים לתמוך מחקרים translational עתידיים בתחום מחלות ריאה דלקתיות או אלרגי על ידי החדרת שילוב מתוחכם, אבל בכל זאת ריאלי, ניסיוני דגם לניטור לימפוציטים אנושיים יונת ריאות על התנאים ויוו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

מהמם הצטברות רקמה של תאים חיסוניים מופעל מאוד מייצג סימן היכר של מחלות דלקתיות כרוניות שונות, הגיח יעד אטרקטיבי טיפולית בתחום ניהול קליני של חולים מושפעת. כדי לייעל עוד יותר אסטרטגיות מכוון טיפולית רגולציה של רקמות באופן פתולוגי מאוזנת חדירה של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים, זה יהיה בעל חשיבות מיוחדת כדי להשיג שיפור תובנות לתוך המחלה איברים ספציפיים או תכונות ביות של לימפוציטים היקפיים. פרוטוקול הניסוי המתואר כאן מאפשר לעקוב אחר ריאות הצטברות של לימפוציטים אנושיים fluorescently שכותרתו, הועבר adoptively בהקשר של דלקת ריאות הנגרמת פפאין. בניגוד מבחני הפריה רגילה תכוף לניתוח של נדידת תאים חיסוניים ו כימוטקסיס, ההגדרה ויוו עכשיו הציג לוקח בחשבון ספציפי ריאות היבטי בארגון רקמות ואת ההשפעה של המתחם דלקתיות תרחיש מתרחשים האורגניזם החי מאתר. יתר על כן, קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך תלת מימדי הדמיה מיקרוסקופיים אינם מספקים נתונים כמותיים על הסתננות התאים החיסוניים, אבל גם מציג את הדפוס של תאים חיסוניים לוקליזציה בתוך הריאה מודלק. בסך הכל, אנו מסוגלים להכיר טכניקה חדשנית בעלת ערך גבוה עבור אימונולוגי במחקר בתחום מחלות ריאה דלקתיות כרוניות, אשר יכול להיות מיושם בקלות על ידי ביצוע פרוטוקול צעד אחר צעד שסופקו.

פרוטוקול הציג מתאר מודל העכבר ניסיוני, אשר מאפשר ניטור וכימות ההצטברות של לימפוציטים T אנושיים הועבר adoptively בריאה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. איור 1 א מעניק סקירה סכמטי של השלבים ויוו של לוח הזמנים ניסיוני. על מנת להבטיח תוצאות אמינות, הוא בעל חשיבות משמע...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

הטכניקה שלנו מאפשרת הדמיה מדויקת של תאי חיסון אנושיים שנצברו בריאה בתנאים דלקתיים של ויוו ומספקת תובנות מרגשות על תהליך ביות תאי T. פרוטוקול זה תומך במחקר תרגום על ביות ריאות תא T ובכך עשוי לסייע בזיהוי מטרות חדשות לטיפול אופטימיזציה של מחלות ריאות דלקתיות או אלרגיות. בפרט, היכולת לשקול את ההשפעה של תכונות תאים חיסוניים ספציפיים למחלות, ארגון רקמת ריאות, ומילייה דלקתי על ביות ריאות תא T עושה שיטה זו יתרון רב.בסך הכל, הטכניקה שלנו היא ערך גבוה למחקר אימונולוגי בתחום מחלות ריאות דלקתיות כרוניות, אשר מונעים לעתים קרובות על ידי הצטברות רקמות מכריע של תאים חיסוניים פעילים. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן לפחות 16 גרם, שישה שבועות, הרדמה C57 שחור 6J עכבר, להשתמש micropipet לאט לספק 10 microliters של פתרון פפאין מוכן טרי לתוך נחיר אחד של העכבר פעם ביום במשך שלושה ימים רצופים. יום לאחר ממשל הפפאין האחרון, שכבה 10 מיליליטר של מדיום Ficoll תחת דם היקפי אנושי ממתנדב בריא מדולל מראש ביחס של אחד עד שניים ב- PBS להפרדת שיפוע צפיפות על ידי צנטריפוגה.מעבירים את תא הדם המונונוקלארי ההיקפי או את שכבת האינטרפאז PBMC לצינור חדש של 50 מיליליטר ואוסף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע בידוד microbead מגנטי של תאים חיוביים CD4 על פי פרוטוקול היצרן. השעיה מחדש של תאי CD4 חיוביים מבודדים של חרוזים עד פי 10 עד תאי T השביעיים לכל לפחות 500 מיקרוליטרים של ריכוז PBS.סמן את התאים עם אור אדום מתאים להתרבות תאים צבע במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, עצרו את תגובת התיוג עם חמישה כרכים של מדיום RPMI בתוספת 10% FBS במשך חמש דקות על קרח ואחריו שלוש שטיפות במדיום. להעברה מאמצת של תאי ה-CD4 החיוביים האנושיים לעכברי נמען חשופי פפאין, להשעות מחדש את תאי T המסומנים באופן פלואורסצנטי לתאי T פי 10 לתאים השביעיים לריכוז מיליליטר ב- PBS ולהעמיס 100 מיקרוליטרים של תאים לתוך מזרק אחד של מיליליטר המצויד במחט של 30 מד לכל בעל חיים נמען, ואז להזריק את כל נפח התאים ממזרק אחד לתוך וריד הזנב חיה אחת שטופלה בפפאין שומרת על קצה המחט בתוך וריד. חמש שניות לאחר מסירת התא כדי למנוע פריקה של ההשעיה התא.שלוש שעות לאחר העברת תאים מאמצים, לנקב את החדר הימני של כל עכבר המתת דם עם cannula 21-מד מחובר קטטר ולעשות חתך בחדר השמאלי. לאט לאט לבלבל את הריאה עם 20 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת חמישה מילימולרים EDTA ואחריו שני מיליליטר של קרח קר 4% paraformaldehyde. כאשר כל התיקון כבר סמוק דרך הרקמה, להסיר את בלוטות הרוק לחתוך את שריר עצם החזה כדי לאפשר מדחפים להיות החליק מתחת קנה הנשימה לחשוף את רקמת airtube.בצע ניקוב ראשוני של קנה הנשימה החשוף עם מחט 30-מד לפני החלפת המחט עם קטטר קהה 30-מד כדי למנוע נזק נוסף לרקמה. השתמש במחזיק מחט כדי לאטום את הצומת בין הקטטר שהוכנס קנה הנשימה, בזהירות למלא את דרכי הנשימה עם כ 37 מעלות צלזיוס 0.75% התעורר עד התגלגלות מלאה של הריאה. צומת הדוק בין קטטר קנה הנשימה הוא קריטי להרחבת הריאה לגודל הפיזיולוגי שלה ושמירה על ארכיטקטורת רקמות להדמיה.כאשר ההתעוררות התגבשה לחלוטין, הסר את הקטטר והעבר בזהירות את הריאה לצינור חשוך של שני מיליליטר מלא בפרפורמלדהדייה 4%. לאחר מכן, לייבש את הרקמה עם דגירה אתנול רציפה תחת סיבוב מתמשך ב 31 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס כפי שצוין במשך ארבע שעות לכל דגירה. לאחר התייבשות מוחלטת, מעבירים את הדגימה לאתיל סינמט לצורך דגירה לילית בטמפרטורת החדר עד שהרקמות מופיעות שקופות.למיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיר, השתמשו בירידה קטנה של דבק יציב ממס אורגני כדי להדביק את הריאה למחזיק הדגימה של המיקרוסקופ ולהגדיר את אונת הריאה על המחזיק במצב זקוף. מניחים את מחזיק הדגימה בתאו ובחרו את הלייזרים המתאימים לניסוי בתוכנת המכשיר. לאחר מכן, השתמש המחוונים תחת אופטיקה כדי להגדיר רוחב גיליון כי הצמצם המספרי לחשוף באופן אחיד את האיבר כולו או קטע מסוים של עניין.השתמשו במ המחוון להגדרת עוצמת הלייזר תחת בקרת שידור בלייזר לכל לייזר שנבחר ולחצו על 'החל'. השתמשו בהגדרות מדידה מתקדמות למיזוג גליונות האור השמאליים והימין ליצירת תמונה מוארת באופן הומוגני. הגדר את מיקומי ההתחלה והסיום של מחסנית Z שיש למדוד תחת טווח סריקה והגדר את גודל השלב לחמישה מיקרומטרים ולאחר מכן בחר שמירה אוטומטית כדי לשמור את הקבצים באופן אוטומטי ולהתחיל במדידה כדי ללכוד את התמונות.לאחר שכל התמונות נרכשו, הפעילו את הלחצן 'עלה' בתוכנת הניתוח 'תלת-ממדי' לאחר ההדמיה וטעינו את התמונה הראשונה מערימת Z אחת כדי ליזום שחזור תלת-ממדי פותח ואוטומטי של כל התמונות האחרות של מחסנית Z שנבחרה, ולאחר מכן, תחת 'התאמת תצוגה', התאימו את העוצמה, הרמה השחורה והניגודיות לכל ערוץ. כדי להשוות את הצטברות התאים האנושיים בתוך רקמת הריאה לדגימות שונות, בחר 'עריכה' ו'חתוך תלת-ממדי' כדי להגדיר קוביית ריאה עם נפח מסוים. כדי לכמת את התאים המסווים בתוך קוביית הריאה המוגדרת, פתח את הוסף כתמים חדשים בסרגל הכלים, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני ובחר את ערוץ 640 ננומטר.הגדר את קנה המידה של הרדיוס ל- 10.00 מיקרון, לחץ על בחר ותחת עריכה, הקש Shift באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לסמן בנפרד כל תא פלואורסצנטי באמצעות נקודה. המספר הכולל של תאים שנספרו יוצג בסטטיסטיקה. ללכידת תמונה, השתמש בכלי תצלום בזק או השתמש בכלי ההנפשה ללכידת וידאו.העשרת תאים מבוססי Microbead ותיוג פלואורסצנטיות לאחר מכן כפי שהוכח בדרך כלל לגרום טוהר חיובי CD4 של לפחות 95%, תיוג מוצלח של תאים אלה כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה. ניקוי רקמות מבוסס cinnamate אתיל משיג רמה גבוהה של שקיפות איברים המציינת התאמת אינדקס שבירה מוצלחת. האות הפלואורסצנטי האוטומטי של רקמת הריאה מציע כלי מועיל לתמונה המבנה האנטומי של הריאה על ידי מיקרוסקופיה של יריעות אור אשר ניתן להציג כהקרנה בעוצמה ממוצעת או במצב פני השטח.בהשוואה למיקרוסקופיה קונבנציונלית, מיקרוסקופיה של יריעות אור מציעה את היתרון של הדמיית איברים שלמה ושחזור תלת מימדי לאחר מכן המאפשר זיהוי והדמיה של תאי T אנושיים בעלי תווית של התפשטות, המועברים בהקשר של האיבר כולו, יתר על כן, ההעדפה של תאי T אנושיים שהועברו להצטברות סלקטיבית בתוך רקמת הריאה מודלקת של בעלי חיים חשופי פפאין נתמכת עוד יותר על ידי העובדה כי תאי T חיוביים CD4 אנושיים לא ניתן לאחזר מרירית המעי של בעלי החיים. עבור כימות והשוואה של הצטברות ריאתי של תאי T חיוביים CD4 אנושי בין תנאים שונים, התאים המסווים ניתן לספור גם במספר קוביות ריאות של נפח מוגדר כפי שהוכח. הכנת רקמות זהירות כולל חליטת ריאות, אינפלציה וגיול רקמות חשובה מאוד עבור דור ממוטב של תמונות מיקרוסקופיות של יריעות אור ברזולוציה גבוהה.כדי לאשר עוד יותר את diapedesis מוצלח של לימפוציטים אנושיים שהועברו, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות משולב עם כימות ציטומטרי זרימה של לימפוציטים אנושיים בתוך מליאת ברונכואלוולאר מורין. היכולת לנטר תאים חיסוניים הנגזרים מחולים בודדים בתנאי vivo תומכת בזיהוי שינויים תפקודיים בתאי החיסון המוטבעים על ידי מחלה או טיפול מסוימים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

תובלת pneumococcal אנוש ניסויית

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

פיתוח של סביבת משחקים וירטואלית אודיו מבוססות המסייע במיומנויות ניווט בליינד

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

שיטה של ​​מבודד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; ריאות זלוף במודל עכברוש: ​​לקחים מפיתוח תכנית EVLP עכברוש

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...