Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Gli autori riconoscono con gratitudine finanziamenti dalla DFG Collaborative Research centri SFB 1181 e TRR 241. L'Optical Imaging centro Erlangen (OICE) e in particolare Ralf Palmisano, Philipp Tripal e Tina Fraaß (progetto Z2 del DFG CRC 1181) sono riconosciuti per il supporto tecnico di esperti per l'imaging di fluorescenza di luce-foglio microscopico.

Esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalle autorità locali competenti a Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). Topi sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche. La raccolta di sangue umano è stata approvata dal comitato etico locale e il Comitato di revisione istituzionale dell'Università di Erlangen-Norimberga. Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.
1. indurre infiammazione allergi...

L'impostazione sperimentale descritto qui offre la possibilità di monitorare la capacità di homing polmonare delle cellule immuni umane primarie sotto condizioni infiammatorie in vivo e quindi relativo complementi classicamente eseguita la chemiotassi e l'adesione in vitro saggi. Per tener conto delle caratteristiche specifiche dell'organo anatomico del polmone, aspetti importanti della cellula immunitaria homing (compreso distribuzione chemiotassi e cella all'interno dell'organo bersaglio)...

Classici disordini infiammatori del polmone, come l'asma allergica e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono ben noti per essere guidato da un aumentato reclutamento di linfociti attivati nel tessuto polmonare1,2. Linfocita-rilasciato citochine (ad es., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promuovere ulteriormente la chemiotassi di cellule immuni innate ed adattabili, indurre fibrotica vie respiratorie che ritoccano o direttamente danneggiare il parenchima polmonare2. Finora, i meccanismi di fondo responsabili dell'accumulo patologico dei linfociti all'interno del tessuto polmonare ancora completamente non sono capiti. In analogia al tessuto-selettivo delle cellule di T imprinting descritto per homing intestinale e della pelle, polmonare cellule dendritiche (DCs) sono ovviamente in grado di prime cellule di T periferiche per infiltrazione polmonare preferenziale, almeno in parte tramite l'induzione dell'espressione di CCR4 sul superficie di linfociti3. Oltre CCR4, delle vie respiratorie-infiltrazione di cellule T sono anche caratterizzate da una particolare aumentata espressione dei recettori chemochinici CCR5 e CXCR3 rispetto alle cellule di T all'interno il sangue periferico1,4,5. Nel complesso, esistenti dati sono coerenti con il concetto che polmone homing dei linfociti T in condizioni fisiologiche o infiammatorie coinvolge un numero di recettori per le chemochine diversi e loro rispettivi ligandi e così fondamentalmente dipende un strettamente controllata la collaborazione tra le cellule immuni innate ed adattabili1. Soprattutto, durante la fase iniziale dell'esposizione dell'agente patogeno o allergene, cellule del sistema immunitario innato rispondono alla stimolazione dei TLR o di IgE-mediata reticolazione dell'immediato rilascio di chemioattrattanti differenti, come LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD21,6,7. Come un primo esempio, l'interazione tra PGD2 e il recettore chemoattractant CRTh2 è noto per essere di particolare importanza per chemiotassi di cellule Th2 e così è comparso come promettente bersaglio terapeutico nell'amministrazione clinica di asma. Infatti, i pazienti con asma moderata hanno mostrato un miglioramento dei sintomi e un aumento significativo del volume espiratorio forzato in un secondo (FEV1) dopo il trattamento con un antagonista selettivo CRTh2 rispetto al gruppo placebo8 ,9. In uno stato più progredito della risposta infiammatoria, già reclutato le cellule T sono in grado di amplificare ulteriormente accumulazione polmonare del linfocita tramite il rilascio di IL-4 e IL-13 come potenti stimoli per DCs polmonare. Successivamente, queste cellule innate mieloide-derivato in su-regolano l'espressione di CCL17 e CCL22 in un STAT6-dipendente modo1,10,11.  Anche se la complessità dello scenario descritto ancora ostacola una comprensione completa del polmone delle cellule T homing, offre una pletora di bersagli molecolari per un controllo terapeutico potenzialmente ottimizzato delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di tecniche sperimentali innovative, che sono in grado di approfondire e integrare la nostra conoscenza nel campo della cellula T chemiotassi e polmone homing ulteriormente.
Dovuto al fatto che homing polmonare dei linfociti all'interno del corpo umano è influenzata da molteplici parametri cellulari, umorale e fisica1, la maggior parte dei metodi sperimentali esistenti non sono in grado di modellare tutta la complessità di questo processo immunologico. Invece, molti protocolli standard per l'analisi del polmone homing selettivamente concentrano su un aspetto specifico coinvolto nella cascata di attrazione del linfocita, adesione, migrazione e ritenzione. Oltre ad una determinazione puramente descrittiva del pattern di espressione di mRNA o proteina delle integrine e chemochine recettori sui linfociti periferici o polmone-infiltrazione e la misura complementare di chemokine rispettivi livelli nel sangue, il lavaggio broncoalveolare (BAL) o tessuto polmonare12,13,14,15, saggi di cultura consolidata in vitro delle cellule consentono una caratterizzazione funzionale di adesione dei linfociti o chemiotassi al momento definito condizioni sperimentali16,17,18. In linea di principio, saggi di adesione statica in vitro monitorare la capacità legante di linfociti coltivati per un monostrato endoteliale o diapositive di vetro rivestiti con molecole di adesione endoteliali ricombinante (ad es., MAdCAM-1, VCAM-1), mentre in vitro standard chemiotassi sono solitamente applicati al fine di quantificare la capacità dei linfociti di migrano lungo un gradiente di chemokine in un sistema di transwell19. Entrambe le impostazioni in vitro permettono una regolazione controllata e la modulazione delle condizioni sperimentali, ma d'altra parte mancano importanti variabili note criticamente l'impatto sulla chemiotassi in vivo e l'adesione dei linfociti. Principalmente, saggi di cultura statica cellulare ignorare l'influenza delle forze di taglio causate dal flusso di sangue permanente19 e potenzialmente trascurano il coinvolgimento del milieu immunologica circostante e interagenti non-linfocita cellule immunitarie, entrambi presenti in un organismo vivente. Per superare queste limitazioni, l'interpretazione dei risultati acquisiti nelle analisi in vitro statiche di chemiotassi o aderenza bisogno ulteriore convalida negli esperimenti di adesione dinamico sotto flusso condizioni20,21 e in vivo modelli di infiammatorio organo patologia19. Infatti, importanti studi sugli animali potrebbero trarre conclusioni sulla regolamentazione del polmone delle cellule T homing in condizioni infiammatorie o allergiche analizzare geneticamente topi modificati in modelli definiti di diverse malattie polmonari3, 22 , 23. il confronto quantitativo del polmone infiltrazione di linfociti tra topi selvatici e topi con un deficit per un gene specifico di interesse rappresenta uno strumento ben consolidato e largamente usato per definire l'impatto del cellulare particolare percorsi o recettori sul modello di malattia basato di distribuzione delle cellule T. Tuttavia, contrariamente a prima discusso saggi di cultura in vitro delle cellule, un disegno di studio basato su modelli animali classici manca la capacità di analizzare e monitorare le cellule T umane primarie direttamente derivate dal sangue o BAL di pazienti affetti da un infiammatorio del polmone malattia. Così, rimane ancora impegnativo per convalidare funzionalmente se una malattia polmonare diagnosticamente specificato è in grado di imprimere i linfociti umani per tropismo preferenziale del polmone e fino a che punto i parametri clinici potrebbero avere un impatto su questo scenario. Recentemente, un approccio molto elegante in vivo è stato introdotto nel contesto delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), che era in grado di superare la maggior parte di queste limitazioni e aperto nuove strade per studi avanzati traslazionali su linfociti intestinali homing24 . Approfittando dei protocolli per schiarimento del tessuto solvente seguita da microscopia di fluorescenza di luce-foglio trasversale come un potente strumento di imaging, è stato possibile visualizzare l'infiltrazione e la distribuzione delle cellule T umane passivamente trasferite nell'intestino dei topi immunodeficienti colitic24. In particolare, questa impostazione sperimentale implementato due innovazioni principali: (1) cellule immuni umane primarie possono essere analizzati in condizioni in vivo sperimentalmente definite; (2) una zona piuttosto grande di organo malato (circa 1,5 x 1,5 cm) può essere imaged in qualità ad alta risoluzione, seguita da ricostruzione 3D. Inoltre, parecchi studi recenti stabilito con successo l'uso del tessuto a base di solvente di compensazione e microscopia a fluorescenza di luce-foglio come strumenti importanti per polmonare avanzato imaging25,26. Al fine di beneficiare di questo progresso tecnologico nel campo dell'immunologia polmonare, abbiamo ora adottato il sistema per analisi di homing polmonare.
Il protocollo qui presentato fornisce un'introduzione passo passo come purificare e fluorescente etichetta primaria umana T cellule per trasferimento in topi con infiammazione polmonare indotta e, inoltre, descrive in dettaglio il processo successivo di luce-foglio imaging al microscopio di fluorescenza, tra cui organo preparazione ed elaborazione di immagini. Nel complesso, ci auguriamo sostenere gli studi traslazionali futuri nel campo delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche introducendo un sofisticato, ma modello tuttavia fattibile, sperimentale per il monitoraggio di homing polmonare del linfocita umano su condizioni in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Accumulazione del tessuto delle cellule immuni altamente attivate in modo schiacciante rappresenta un segno distintivo di varie malattie infiammatorie croniche ed emerso come un obiettivo terapeutico attraente nella gestione clinica dei pazienti affetti. Al fine di ottimizzare ulteriormente le strategie finalizzate a regolamento terapeutico di infiltrazione del tessuto patologico squilibrata delle cellule immuni pro-infiammatorie, sarà di particolare importanza per il raggiungimento di migliori intuizioni in malattia organo-specifiche e Proprietà Homing dei linfociti periferici. Il protocollo sperimentale descritto qui permette di polmone accumulo di linfociti umani fluorescente contrassegnati e passivamente trasferiti nel contesto di infiammazione polmonare indotta da papaina. In contrasto con l'analisi in vitro standard si è frequentemente utilizzata per l'analisi di chemiotassi e migrazione delle cellule immuni, l'impostazione ora introdotto in vivo tiene conto di aspetti specifici del polmone dell'organizzazione del tessuto e l'influenza del complesso infiammatorio scenario che si svolgono nell'organismo vivente murino. Inoltre, imaging microscopica tridimensionale a sezione trasversale luce-foglio fluorescenza non fornisce solo dati quantitativi su infiltrazione di cellule immuni, ma raffigura anche il modello di localizzazione delle cellule immuni all'interno del polmone infiammato. Nel complesso, siamo in grado di introdurre una tecnica innovativa di alto valore per le ricerche immunologiche nel campo delle malattie polmonari croniche infiammatorie, che può essere facilmente applicato seguendo il protocollo fornito dettagliato.

Il protocollo presentato descrive un modello sperimentale del topo, che consente di monitorare e quantificare l'accumulo di linfociti T umani passivamente trasferiti nel polmone tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio. Figura 1 A fornisce una descrizione schematica dei passaggi del piano sperimentale in vivo. Al fine di garantire risultati affidabili, è di importanza notevole per garantire una buona qualità dell'isolato e fluorescente etichettato CD4 umana+...

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Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

La nostra tecnica consente l'imaging preciso delle cellule immunitarie umane accumulate dai polmoni in condizioni infiammatorie in vivo fornendo informazioni entusiasmanti sul processo di homing polmonare delle cellule T. Questo protocollo supporta la ricerca traslazionale sull'homing polmonare a cellule T e può quindi aiutare nell'identificazione di nuovi obiettivi per una terapia ottimizzata di malattie polmonari infiammatorie o allergiche. In particolare, la capacità di considerare l'influenza delle proprietà delle cellule immunitarie specifiche della malattia, dell'organizzazione del tessuto polmonare e dell'ambiente infiammatorio sull'homing polmonare delle cellule T rende questo metodo altamente vantaggioso.Nel complesso, la nostra tecnica è di alto valore per la ricerca immunologica nel campo delle malattie polmonari infiammatorie croniche, che sono spesso guidate da un accumulo di tessuto travolgente di cellule immunitarie attivate. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un mouse C57 nero 6J di almeno 16 grammi, di sei settimane, usato un micropipetto per consegnare lentamente 10 microlitri di soluzione di papaina preparata al momento in una narice del mouse una volta al giorno per tre giorni consecutivi. Il giorno dopo l'ultima somministrazione di papaina, strato 10 millilitri di mezzo Ficoll sotto sangue periferico umano da un volontario sano pre-diluito ad un rapporto uno o due in PBS per la separazione del gradiente di densità per centrifugazione.Trasferire la cellula ematica mononucleare periferica o lo strato interfase PBMC in un nuovo tubo da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Successivamente, eseguire l'isolamento magnetico delle microperline di cellule positive CD4 secondo il protocollo del produttore. La sospensione delle cellule T positive CD4 isolate perline a un massimo di uno per dieci fino alla settima t cellule per almeno 500 microlitri di concentrazione di PBS.Etichettare le cellule con un colorante di proliferazione cellulare eccitabile a luce rossa appropriato per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione di etichettatura con cinque volumi di mezzo RPMI integrati con 10%FBS per cinque minuti sul ghiaccio seguiti da tre lavaggi in mezzo. Per il trasferimento adottivo delle cellule T positive CD4 umane in topi riceventi esposti alla papaina, sospendere le cellule T etichettate fluorescentmente a una concentrazione di 1 per 10-settima per millilitro in PBS e caricare 100 microlitri di cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 30 calibro per animale ricevente, quindi iniettare l'intero volume di cellule da una siringa nella vena di coda un animale trattato con papaina mantenendo la punta dell'ago all'interno della vena per un ulteriore ago per un ulteriore cinque secondi dopo l'erogazione della cella per evitare lo scarico della sospensione cellulare.Tre ore dopo il trasferimento cellulare adottivo, forare il ventricolo destro di ogni topo eutanasiato con una cannula calibro 21 collegata a un catetere e fare un'incisione nel ventricolo sinistro. Perfondere lentamente il polmone con 20 millilitri di PBS ghiacciato integrati con cinque EDTA millimolare seguiti da due millilitri di paraformaldeide ghiacciata al 4%. Quando tutto il fissatore è stato lavato attraverso il tessuto, rimuovere le ghiandole salivari e tagliare il muscolo ioide sternale per consentire a una forza di scivolare sotto la trachea per esporre il tessuto del flusso d'aria.Eseguire una puntura iniziale della trachea esposta con un ago calibro 30 prima di sostituire l'ago con un catetere smussato calibro 30 per evitare ulteriori danni al tessuto. Utilizzare un portaaghi per sigillare la giunzione tra il catetere inserito e la trachea e riempire accuratamente le vie aeree con circa 37 gradi Celsius 0,75% di agarosio fino al completo svolgimento del polmone. Una stretta giunzione tra catetere e trachea è fondamentale per espandere il polmone alle sue dimensioni fisiologiche e mantenere l'architettura tissutale per l'imaging.Quando l'agarosio si è completamente solidificato, rimuovere il catetere e trasferire con cura il polmone in un tubo oscurato da due millilitri riempito con 4%paraformaldehdye. Successivamente, disidratare il tessuto con incubazioni sequenziali di etanolo a rotazione continua a 31 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius come indicato per quattro ore per incubazione. Dopo la completa disidratazione, trasferire il campione in cinnamato etilico per un'incubazione notturna a temperatura ambiente fino a quando il tessuto appare traslucido.Per una microscopia fluorescente a fogli leggeri, utilizzare una piccola goccia di colla stabile con solvente organico per attaccare il polmone al portacampioni del microscopio e impostare il lobo polmonare sul supporto in posizione verticale. Posizionare il portacampioni nella sua camera e selezionare i laser appropriati per l'esperimento nel software dello strumento. Quindi, usa i cursori sotto Ottica per impostare una larghezza del foglio che riveli uniformemente l'intero organo o una sezione specifica di interesse.Utilizzare il dispositivo di scorrimento per impostare l'intensità del laser sotto il controllo della trasmissione laser per ogni laser selezionato e fare clic su Applica. Utilizzare le impostazioni di misurazione avanzate per unire i fogli luce sinistro e destro per creare un'immagine illuminata in modo omogeneo. Definire le posizioni iniziale e finale della pila Z da misurare nell'intervallo di scansione e impostare la dimensione del passo su cinque micrometri, quindi selezionare salvataggio automatico per salvare automaticamente i file e iniziare la misurazione per acquisire le immagini.Una volta acquisite tutte le immagini, attivare il pulsante Supera nel software di analisi post-imaging 3D e caricare la prima immagine da una pila Z per avviare la ricostruzione 3D di apertura e automatica di tutte le altre immagini dello stack Z selezionato, quindi in Regolazione display, regolare l'intensità, il livello nero e il contrasto per ogni canale. Per confrontare l'accumulo di cellule umane all'interno del tessuto polmonare tra diversi campioni, selezionare Modifica e Ritaglia 3D per definire un cubo polmonare con un volume specifico. Per quantificare le celle etichettate all'interno del cubo polmonare definito, aprite Aggiungi nuove macchie sulla barra degli strumenti, fate clic su Salta creazione automatica (Skip automatic creation), modificate manualmente e selezionate il canale di 640 nanometri.Impostare la scala del raggio su 10,00 micron, fare clic su Seleziona e in Modifica fare clic con il pulsante sinistro del mouse per contrassegnare singolarmente ogni cella fluorescente con un punto. Il numero complessivo di celle contate verrà visualizzato nelle statistiche. Per acquisire un'immagine, usa lo strumento snapshot e usa lo strumento di animazione per acquisire un video.L'arricchimento cellulare a base di microperline e la successiva etichettatura a fluorescenza come dimostrato in genere si traducono in una purezza positiva del CD4 di almeno il 95% e in un'etichettatura riuscita di queste cellule come determinato dalla citometria del flusso. La compensazione dei tessuti a base di cinnamato etilico raggiunge un alto livello di trasparenza degli organi che indica una corretta corrispondenza dell'indice di rifrazione. Il segnale auto-fluorescente del tessuto polmonare offre uno strumento utile per immaginare la struttura anatomica del polmone mediante microscopia a fogli di luce che può essere visualizzata come proiezione di intensità media o in modalità superficie.Rispetto alla microscopia convenzionale, la microscopia a fogli di luce offre il vantaggio dell'imaging di organi interi e della successiva ricostruzione 3D che consente l'identificazione e la visualizzazione di cellule T umane trasferite con colorante di proliferazione nel contesto dell'intero organo, inoltre, la preferenza delle cellule T umane trasferite per l'accumulo selettivo all'interno del tessuto polmonare infiammato degli animali esposti alla papaina è ulteriormente supportata dal fatto che le cellule T positive CD4 umane non possono essere recuperate dalla mucosa intestinale degli animali riceventi. Per la quantificazione e il confronto dell'accumulo polmonare di cellule T positive CD4 umane tra diverse condizioni, le cellule etichettate possono anche essere contate in diversi cubi polmonari di volume definito come dimostrato. Un'attenta preparazione dei tessuti, tra cui perfusione polmonare, gonfiaggio e compensazione dei tessuti, è molto importante per una generazione ottimizzata di immagini microscopiche a foglio luminoso ad alta risoluzione.Per confermare ulteriormente la diapedesi riuscita dei linfociti umani trasferiti, questo protocollo può essere facilmente combinato con la quantificazione citometrica del flusso dei linfociti umani all'interno del lavaggio broncoalveolare murino. La capacità di monitorare le cellule immunitarie derivate da singoli pazienti in condizioni in vivo supporta l'identificazione di alterazioni funzionali nelle cellule immunitarie impresse da una particolare malattia o terapia.

Research

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