Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

著者は、DFG 共同研究センター SFB 1181 TRR 241 で感謝します。光学イメージング センター エルランゲン (入居) と特定のラルフ パルミサーノ ・ フィリップ ・ Tripal ・ ティナ Fraaß (DFG CRC 1181 のプロジェクト Z2) 光シート蛍光顕微鏡イメージングのエキスパート技術サポートのために認めています。

エルランゲン (Regierung ・ フォン ・ Unterfranken、ヴュルツブルク、ドイツ) に関連する地方自治体によって承認されたプロトコルに従い動物を含む実験を行った。マウスに特定の病原体フリーの条件の下で収容されました。人間の血のコレクションは、ローカル倫理委員会とエアランゲン ・ ニュルンベルグ大学の倫理委員会によって承認されました。各患者は、書面によるインフォームド コ?...

ここで説明されている実験の設定提供古典的な体内の炎症性条件およびそれにより適切補完したプライマリ人間免疫細胞のホーミング肺活量を監視する機会を実行体外密着性と走化性試金。肺のアカウント特定の解剖学的な臓器特性を考慮に、臨床的意義および集録したデータの譲渡 (標的臓器内の走化性、細胞の分布) を含むホーミング免疫細胞の重要な側面を撮りま?...

肺、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患 (COPD) などの古典的な炎症性疾患、肺組織1,2に活性化リンパ球の増加の採用によって駆動されるよく知られています。サイトカインはリンパ球リリース (例えば、IL 4、IL-5、IL 9、IL-13、IFN-γ、TNF-α) 自然免疫と適応免疫細胞の走化性を促進、線維症の気道リモデリング誘導や肺実質2の直接損害します。これまでのところ、肺組織内のリンパ球の病理学的蓄積のための責任の根本的なメカニズムはまだよくわかっていません。肺樹状細胞 (Dc) は明らかに首相の CCR4 発現誘導を介して少なくとも部分的の優遇肺癌浸潤の末梢 T 細胞にすることができる T 細胞の組織選択的刷り込み腸と皮膚ホーミングへの類似で、リンパ球3の表面。CCR4 は、以外にも気道浸潤 T 細胞も CCR5 と末梢血1,4,5内 T 細胞に比べて CXCR3 ケモカイン受容体の発現が特に増加によって特徴付けられます。全体的に、既存のデータが肺生理学的または炎症性条件の下で T リンパ球のホーミングが異なるケモカイン受容体とのそれぞれの配位子の数を含む、従って重大決まる概念と一貫性のある、密接に自然免疫と適応免疫細胞1間のコラボレーションを制御します。特に、病原体や抗原暴露の初期段階では、生得の免疫組織の細胞応答 TLR 刺激、LTB4CCL1、CCL17 のような異なる塩基の即時釈放によって架橋 igeCCL22、CCL20、CXCL10 PGD21,6,7。主な例として PGD2と走化性因子受容体の相互作用 CRTh2 は Th2 細胞の走化性にとって特に重要なが知られている、従って喘息の臨床管理に、有望な治療上のターゲットが登場します。確かに、中等度の喘息患者を示し, 症状の改善治療後 1 秒 (fev 社1) 強制呼気量の大幅な増加 CRTh2 の選択的拮抗薬プラセボ グループの8 と比較して、9。炎症反応のより進行した状態で既に採用の T 細胞が il-4, IL 13 のリリースを介して肺の Dc の強力な刺激としての肺リンパ球蓄積をさらに増幅することができます。その後、これらの骨髄由来の生得的な細胞を調整 STAT6 依存の方法1,10、11CCL17 ・ CCL22 式。 説明したシナリオの複雑さはまだホーミング T 細胞肺の完全な理解を妨げているが、炎症やアレルギー性の肺疾患の可能性があります最適治療制御の分子標的の茄多を提供しています。そのため、緊急の必要性を深めるおよび T 細胞走化性と肺ホーミングの分野で我々 の知識を補完することができる革新的な実験があります。
肺、人体内のリンパ球のホーミングは複数の細胞、体液性および物理的なパラメーター1によって影響を受け、という事実のために、既存の実験手法のほとんどはこの免疫学的プロセスの全体の複雑さをモデル化することがありません。代わりに、ホーミングが選択的に肺の解析の多くの標準的なプロトコルはリンパ球の魅力、接着、移行および保持のカスケードに関連する特定の側面に焦点を当てます。純粋に記述決定周辺機器または肺に浸潤リンパ球のインテグリンとケモカイン受容体の mRNA やタンパク質の発現パターンとそれぞれケモカイン、血中レベルの相補的な測定のほか気管支肺胞洗浄 (BAL) または肺組織12,13,14,15、老舗の in vitro における細胞培養の試金によりリンパ球の接着や走化性の機能解析実験条件16,17,18を定義します。原則として、静的体外付着の試金監視培養リンパ球内皮細胞の単層または組換え内皮細胞接着分子 (例えば、MAdCAM 1、VCAM 1) でコーティングされたガラスの結合容量標準体外走化性アッセイは、transwell システム19のケモカイン勾配に沿って移行するリンパ球の機能を定量化するために通常適用されます。体外の両方の設定は制御調整と実験条件の変調を有効にするが、一方で批判的に体内の走化性とリンパ球の接着に影響する知られている重要な変数がないです。主に、静的な細胞培養の試金は恒久的な血流19によりせん断力の影響を無視し、可能性のある周囲の免疫環境と相互作用する非リンパ球免疫細胞の関与を無視両方の生きている有機体の存在。これらの制限を克服するために静的なインビトロ走化性または付着試験で取得した結果の解釈に必要なさらにフロー条件20,21の下での動的付着実験で検証炎症性器官病理学19の生体モデル。確かに、T 細胞肺の炎症やアレルギー性の条件の下でホーミングの規制に関する結論動物の研究から重要な遺伝子分析変更異なる肺疾患3、に定義されたモデルのマウス22,23. 興味の特定の遺伝子が特定の細胞の影響を定義するためよく確立され、広く使用されているツールを表すため欠損マウスと野生型マウスのリンパ球の浸潤肺の定量的比較経路や T 細胞分布の病気の駆動パターン上の受容体。しかし、対照的に培養細胞培養の試金を議論する前に古典的な動物モデルに基づく研究デザインを欠いている分析し、主なヒト T 細胞血液または炎症性肺を患っている患者のバルから直接派生を監視する能力病気。したがって、それはまだ機能的診断によって指定された肺疾患が優遇肺トロピズムと臨床パラメーター可能性がありますこのシナリオに影響を与えるどの程度までの人間のリンパ球をインプリントすることができるかどうかを検証する挑戦的なままです。最近では、非常にエレガントな生体内でのアプローチは、これらの制限のほとんどを克服することができたし、腸管リンパ球ホーミング24 トランスレーショナル研究の新時代が開かれた炎症性腸疾患 (IBD) のコンテキストで導入されました。.強力なイメージング ツールとして断面光シート蛍光顕微鏡に続いて溶媒基づく組織クリアするためのプロトコルを活かし、浸潤に対して転送ヒト T 細胞の分布を視覚化する可能だった24合併免疫不全マウスの腸。特に、この実験の設定は 2 つの主要な技術革新を実装: 実験的定義の生体内での条件の下で (1) 主な人間の免疫細胞を分析できます(2) 病気にかかった器官の幾分大きい区域 (約 1.5 cm × 1.5 cm) の高画質、3 D 再構築が続くイメージを作成することができます。また、いくつかの最近の研究は、正常に肺癌25,26をイメージングのための重要なツールとしてオフ溶剤系組織と光シート蛍光顕微鏡の使用を設立しました。肺の免疫学の分野でこの技術の進歩から利益のために我々 は今肺ホーミングの分析システムを採用しました。
浄化する方法と蛍光ラベル プライマリ ヒト T 細胞の肺炎症を誘導したマウスに転送するためと、また、光シートの後続のプロセスの詳細に説明します、ここで提示されたプロトコルが紹介の手順蛍光顕微鏡イメージング、器官の準備、画像処理など。全体的に、洗練された、生体内での条件の時にリンパ肺ホーミングを監視するためそれにもかかわらず可能、実験的モデルを導入することによって炎症やアレルギー性の肺疾患の分野で将来の橋渡し研究を支援していきます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

高活性の免疫細胞の組織蓄積を圧倒的な様々 な慢性炎症性疾患の特徴を表し、影響を受ける患者の臨床管理に魅力的な治療上のターゲットとして浮上しました。プロ炎症性免疫細胞の病理組織学的不均衡な組織浸潤の治療の規制を目指す戦略をさらに最適化するためには、病・臓器別に改良された洞察力を達成するために特に重要なこと末梢血リンパ球のホーミングのプロパティです。ここで説明されている実験的なプロトコルは、パパイン誘発肺炎症のコンテキストで蛍光に分類された、本人間のリンパ球の肺蓄積を監視できます。免疫細胞の移動と走化性の分析のために頻繁に使用される標準試験管内アッセイと対照をなして今導入された生体内の設定を組織のアカウント肺固有の側面と炎症性のコンプレックスの影響考慮します。シナリオ生物マウスで行われています。さらに、三次元断面光シート蛍光顕微鏡イメージングは免疫細胞の浸潤にだけ定量的なデータを提供しませんが、また炎症を起こした肺内免疫細胞局在化のパターンを示しています。全体的に、提供されているステップバイ ステップのプロトコルに従うことによって簡単に適用することができます慢性炎症性肺疾患における免疫学的研究価値の高い革新的な技術を導入することが。

提案するプロトコルは、監視と定量化ライト シート蛍光顕微鏡を介して肺に対して転送ヒト T リンパ球の蓄積を可能にするマウスの実験的モデルをについて説明します。図 1A実験スケジュールの生体内での手順の図式的な概観を提供します。信頼性の高い結果を保証するためには相当な重要性、分離および蛍光良い品質を確保するのにラベル付けヒト CD4<su...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

ここで導入されたプロトコルでは、体内の炎症性条件の下で主要な人間のリンパ球のホーミング肺活量の評価をことができます。アレルギー性炎症のマウス モデルの転送に対して人間の免疫細胞の肺の浸潤をイメージし、化学的にクリアされた肺組織の光シート蛍光顕微鏡による定量化できます。

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

我々の技術は、インビボ炎症状態における肺蓄積ヒト免疫細胞の正確なイメージングを可能にし、T細胞肺ホーミングのプロセスに関するエキサイティングな洞察を提供する。このプロトコルは、T細胞肺ホーミングに関する翻訳研究をサポートし、それによって炎症性またはアレルギー性肺疾患の最適化された治療のための新しい標的の同定に役立つかもしれない。特に、T細胞肺ホーミングに対する疾患特異的免疫細胞特性、肺組織組織、および炎症性ミリューの影響を考慮する能力は、この方法を非常に有利にする。全体的に見て、我々の技術は、多くの場合、活性化免疫細胞の圧倒的な組織蓄積によって駆動される慢性炎症性肺疾患の分野で免疫学的研究のために高い価値があります。少なくとも16グラム、6週齢、麻酔付きC57黒6Jマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、マイクロピペットを使用して、調製したパパイン溶液10マイクロリットルを1日1回連続で1回連続でマウスの1つの鼻孔にゆっくりと送達する。最後のパパイン投与の翌日、ヒト末梢血下のFicoll培地の層10ミリリットルは、遠心分離による密度勾配分離のためにPBSで1〜2の比率で事前希釈された健康なボランティアからである。末梢単核血球またはPBMC相間層を新しい50ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって細胞を採取する。次に、メーカーのプロトコルに従ってCD4陽性細胞の磁気マイクロビーズ分離を行います。ビーズ単離CD4陽性T細胞を、PBS濃度の少なくとも500マイクロリットル当たり最大10倍から7番目のT細胞で再懸濁した。37°Cで10分間、適切な赤色光励起細胞増殖色素を細胞にラベル付けします。インキュベーションの終わりに、氷の上で5分間10%FBSを補充した5巻のRPMI培地で標識反応を逮捕し、続いて培地で3回のスリングを行う。ヒトCD4陽性T細胞をパパイン暴露されたレシピエントマウスに養子に移す場合、 蛍光標識されたT細胞をPBSのミリリットル濃度当たり7番目の細胞に1回10回再中断し、100マイクロリットルの細胞をレシピエント動物1匹あたり30ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器にロードし、1つのシリンジから細胞の全容を尾静脈に注入する細胞懸濁液の排出を防止するために細胞送達の5秒後。養子細胞転移の3時間後、各安楽死マウスの右心室をカテーテルに接続した21ゲージカニューレで穿刺し、左心室に切開する。5ミリモルEDTAを補った20ミリリットルの氷冷PBSと肺をゆっくりと浸透させ、続いて2ミリリットルの氷冷4%パラホルムアルデヒドを加える。すべての固定剤が組織を通して洗い流されたら、唾液腺を取り除き、胸部ヒョイド筋肉を切断して、気管の下で鉗子を滑らせてエアチューブ組織を露出させる。露出した気管の最初の穿刺を30ゲージ針で行ってから、針を鈍い30ゲージのカテーテルに置き換えて、組織へのさらなる損傷を防ぎます。針ホルダーを使用して挿入されたカテーテルと気管の間の接合部を密封し、肺の完全な展開まで約37°C0.75%アガロースで気道を慎重に満たします。カテーテルと気管の間の緊密な接合は、肺を生理学的な大きさに拡大し、イメージングのための組織アーキテクチャを維持するために重要である。アガロースが完全に固まったら、カテーテルを取り外し、4%パラホルデドエで満たされた暗い2ミリリットルのチューブに肺を慎重に移します。次に、連続的な回転の下で連続的なエタノールインキュベーションで組織を脱水し、毎分31回転、摂氏4度で、インキュベーションごとに4時間示した。完全な脱水後、サンプルをエチルシンナメートに移し、組織が半透明になるまで室温で一晩インキュベートします。光シート蛍光顕微鏡では、有機溶剤の安定した接着剤を少量使用して、肺を顕微鏡のサンプルホルダーに貼り付け、肺ローブを直立した位置にホルダーにセットします。サンプルホルダーをチャンバーに入れ、計器ソフトウェアで実験に適したレーザーを選択します。次に、光学の下のスライダーを使用して、オルガン全体または関心のある特定のセクションを均一に明らかにするシート幅を設定します。スライダーを使用して、選択したレーザーごとにレーザー伝送制御下のレーザー強度を設定し、[適用]をクリックします。[高度な測定設定] を使用して、左右のライト シートを結合して、均質に照らされたイメージを作成します。スキャン範囲で測定するZスタックの開始位置と終了位置を定義し、ステップサイズを5マイクロメートルに設定してから、自動保存を選択してファイルを自動的に保存し、画像をキャプチャするための測定を開始します。すべての画像が取得されたら、3Dポストイメージング解析ソフトウェアで「卓越」ボタンをアクティブにし、1つのZスタックから最初の画像をロードして、選択したZスタックの他のすべての画像の開く3D再構成と自動3D再構成を開始し、[表示調整]で各チャンネルの強度、黒レベル、コントラストを調整します。異なるサンプル間で肺組織内のヒト細胞の蓄積を比較するには、[編集]および[3D をトリミング]を選択して、特定のボリュームを持つ肺立方体を定義します。定義された肺立方体内のラベル付きセルを定量化するには、ツールバーの「新しいスポットを追加」を開き、「自動作成をスキップして手動で編集」をクリックし、640 ナノメートル・チャネルを選択します。半径スケールを 10.00 ミクロンに設定し、[選択] をクリックし、[編集] の下でマウスの左ボタンをクリックして各蛍光セルをドットで個別にマークします。カウントされたセルの総数が統計に表示されます。画像をキャプチャするには、スナップショット ツールを使用するか、アニメーション ツールを使用してビデオをキャプチャします。微生物ベースの細胞濃縮およびそれに続く蛍光標識は、典型的には、少なくとも95%のCD4陽性純度とフローサイトメトリーによって決定されるこれらの細胞の正常な標識をもたらす。エチルシンナメートベースの組織クリアリングは、屈折率のマッチングが成功したことを示す高レベルの臓器透明化を達成する。肺組織の自動蛍光シグナルは、平均強度投影または表面モードで表示することができる光シート顕微鏡検査によって肺の解剖学的構造を画像化するのに役立つツールを提供する。従来の顕微鏡法と比較して、光シート顕微鏡法は、全臓器イメージングとその後の3D再構成の利点を提供し、色素標識された増殖の同定および可視化を可能にし、全器官の文脈でヒトT細胞を移し、さらに、パパイン暴露動物の炎症肺組織内で選択的蓄積するために移されたヒトT細胞の好みは、ヒトCD4陽性細胞が腸管内のレシピエントから取得することができないという事実によってさらに支持される。異なる条件間のヒトCD4陽性T細胞の肺蓄積の定量および比較のために、標識された細胞はまた、実証されるように定義された体積のいくつかの肺キューブで数えることができる。肺灌流、膨張、組織のクリアリングを含む慎重な組織調製は、高解像度の光シート顕微鏡画像の最適化された生成のために非常に重要です。さらに、移されたヒトリンパ球のダイアペデスが成功したことを確認するために、このプロトコルは、マウス気管支肺胞洗浄体内のヒトリンパ球のフロー細胞量測定と容易に組み合わせることができる。生体内の状態で個々の患者から誘導された免疫細胞を監視する能力は、特定の疾患または治療によって刻印された免疫細胞における機能的変化の同定をサポートする。

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

ブラインドのナビゲーションスキルを支援するためにオーディオベースのバーチャル·ゲーム環境の開発

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミングヒトリンパ球のイメージング高度な