Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Forfatterne erkjenner takknemlig støtte av DFG samarbeidende forskning sentre SFB 1181 og TRR 241. Optisk tenkelig sentrum Erlangen (OICE) og i bestemt Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (Project Z2 av DFG CRC 1181) er anerkjent ekspert kundestøtte for lys arks fluorescens mikroskopiske bildebehandling.

Eksperimenter som involverer dyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av relevante lokale myndigheter i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus ble plassert ved bestemte patogen uten betingelser. Samlingen av menneskeblod ble godkjent av lokale etiske komiteen og institusjonelle gjennomgang styret av universitetet i Erlangen-Nuremberg. Hver pasient ga skriftlig samtykke.
1. få allergisk lungebetennelse i mus
Merk: So...

Her beskrives eksperimentelle innstillingen gir mulighet til å overvåke homing lungekapasitet av primære menneskelige immunceller under i vivo inflammatoriske tilstander og dermed relevantly utfyller klassisk utført i vitro vedheft og chemotaxis analyser. Ta i kontoen bestemte anatomiske orgel kjennetegner lungene, viktige aspekter av immun celle homing (inkludert chemotaxis og celle distribusjon i målet orgel) samt kliniske relevans og overdragelse av ervervet data, vi tok nytte av tre ...

Klassisk inflammatoriske lidelser i lungene, som allergisk astma og kroniske hindrende lunge sykdom (COPD), er kjent for å være drevet av en større rekruttering av aktivert lymfocytter i lunge vev1,2. Lymfocytt utgitt cytokiner (f.eks, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) fremme chemotaxis av medfødte og adaptive immunceller, indusere fibrotiske airway ombygging eller direkte skade lungene parenchyma2. Så langt, er de underliggende mekanismene ansvarlig for patologisk akkumulering av lymfocytter i lungevev ennå ikke fullt ut forstått. I analogi til vev-selektiv T celle preging på gut og hud homing, lunge dendrittiske celler (DCs) er åpenbart kunne prime perifere T celler for fortrinnsrett lunge infiltrasjon, delvis via induksjon av CCR4 uttrykk på den overflaten av lymfocytter3. Foruten CCR4, er airway-infiltrere T-celler også preget av en spesielt økt uttrykk av chemokine reseptorer CCR5 og CXCR3 forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlet, eksisterende data er konsistent med konseptet at lunge homing av T-lymfocytter under fysiologiske eller inflammatorisk forhold innebærer en rekke ulike chemokine reseptorer og deres respektive ligander og derfor avgjørende avhengig av en tett kontrollert samarbeid mellom medfødte og adaptive immunceller1. Spesielt i den innledende fasen av patogen eller allergen svare cellene av medfødte immunforsvaret TLR stimulering eller IgE-medierte cross-linking av umiddelbar løslatelse av forskjellige chemoattractants, som LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et godt eksempel, samspillet mellom PGD2 og chemoattractant reseptoren CRTh2 er kjent for å være spesielt viktig for chemotaxis Th2 celler og dermed dukket opp som lovende terapeutisk mål i klinisk forvaltning av astma. Faktisk moderat astmapasienter viste en forbedring av symptomer og en betydelig økning av forsert ekspiratorisk volum i ett sekund (FEV1) etter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist forhold til placebo gruppen8 ,9. I en mer progressed tilstand av inflammatorisk respons kan allerede rekrutterte T celler ytterligere forsterke lunge lymfocytt akkumulering via utgivelsen av IL-4 og IL-13 som potent stimuli for lunge DCer. Deretter regulere disse myelogen-avledet medfødte celler opp-uttrykk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-avhengige måte1,10,11.  Selv om kompleksiteten i beskrevet scenariet fortsatt hindrer en fullstendig forståelse av T celle lunge homing, tilbyr det en mengde molekylære mål for en potensielt optimalisert terapeutiske kontroll av inflammatoriske eller allergisk lungesykdommer. Derfor er det et stort behov for innovative eksperimentelle teknikker, som kan videre utdype og utfylle vår kunnskap i T celle chemotaxis og lunge homing.
Skyldes at lunge homing av lymfocytter i kroppen påvirkes av flere mobilnettet, humoral og fysiske1, kan de fleste av de eksisterende eksperimentelle metodene ikke modell hele kompleksiteten i denne immunologiske prosessen. I stedet fokus mange standardprotokoller for analyse av lunge homing selektivt på et bestemt aspekt involvert i kaskade av lymfocytt attraksjon, vedheft, migrasjon og oppbevaring. Foruten en beskrivende fastsettelse av mRNA eller protein uttrykksmønster av integrins og chemokine reseptorer på ytre eller lunge-infiltrere lymfocytter og komplementære måling av respektive chemokine nivåer i blod, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge vev12,13,14,15, etablert i vitro celle kultur analyser tillate funksjonell karakteristikk av lymfocytt heft eller chemotaxis på definert eksperimentelle forhold16,17,18. I prinsippet overvåke statisk i vitro vedheft analyser bindende kapasiteten på kulturperler lymfocytter en endotelial monolayer eller glass lysbilder belagt med rekombinant endothelial vedheft molekyler (f.eks MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard i vitro chemotaxis analyser brukes vanligvis for å kvantifisere evnen lymfocytter overføre langs chemokine gradering i et transwell system19. Både i vitro innstillinger kontrollert justering og modulering av eksperimentelle forhold, men derimot mangler viktige variabler kjent kritisk virkning på i vivo chemotaxis og vedheft av lymfocytter. Overveiende, statisk celle kultur analyser Ignorer påvirkning av skjær krefter forårsaket av permanent blodet flyt19 og forsømmelse potensielt involvering av omkringliggende immunologiske miljøet og samspill ikke-lymfocytt immunceller, både i en levende organisme. For å overvinne disse begrensningene, tolkningen av resultater i statisk in vitro chemotaxis eller tilslutning analyser trenger ytterligere validering i dynamiske vedheft eksperimenter under flyt forhold20,21 og i i vivo modeller av inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk viktig konklusjoner om regulering av T celle lunge homing under inflammatoriske eller allergiske forhold kan trekkes fra dyrestudier analysere genetisk endret mus i definerte modeller av forskjellige lungesykdommer3, 22 , 23. kvantitativ sammenligningen av lunge infiltrere lymfocytter mellom wildtype mus og mus med mangel for en bestemte genet av interesse representerer en veletablert og bredt brukt verktøy for å definere effekten av bestemt mobilnettet veier eller reseptorer på sykdom-drevet mønster av T celle distribusjon. Men mangler i motsetning til før diskutert i vitro celle kultur analyser, en studie design basert på klassisk dyremodeller evnen til å analysere og overvåke primær menneskelige T-celler direkte avledet fra blod eller BAL av pasienter som lider av en inflammatorisk lunge sykdom. Derfor fortsatt det utfordrende funksjonelt validere om en diagnostically angitt lungesykdom er i stand til å implementere menneskelige lymfocytter for fortrinnsrett lunge tropism og hvor langt klinisk parametere kan påvirke på dette scenariet. Nylig ble en svært elegant i vivo tilnærming introdusert i sammenheng med inflammatorisk tarm sykdommer (IBD), som klarte å overvinne de fleste av disse begrensningene og åpnes nye muligheter for avansert translational studier på intestinal lymfocytt homing24 . Dra nytte av protokoller for løsemiddelbaserte vev clearing etterfulgt av cross-sectional lys arks fluorescens mikroskopi som et kraftig tenkelig verktøy, det var mulig å visualisere infiltrasjon og distribusjon av adoptively overførte menneskelige T-celler i tarmen av colitic immunodeficient mus24. Spesielt denne eksperimentelle innstillingen gjennomført to viktigste nyvinningene: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres under eksperimentelt definert i vivo forhold; (2) et ganske stort område av syke orgelet (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan avbildes i høy oppløsningskvalitet, etterfulgt av 3D-gjenoppbygging. Dessuten opprettet flere nyere studier bruk av løsemiddelbaserte vev clearing og lys arks fluorescens mikroskopi som viktigste verktøy for avansert lunge imaging25,26. For å ha nytte av denne teknologiske fremskritt i lunge immunologi, innført vi nå systemet for analyse av lunge homing.
Her presenteres protokollen gir en trinnvis innføring hvordan å rense og fluorescently etikett primære menneskelige T celler for overføring til mus med indusert lungebetennelse og, videre beskriver i detalj senere prosessen med lys-ark fluorescens mikroskopiske bildebehandling, inkludert orgel forberedelse og bildebehandling. Total, håper vi å støtte fremtidig translational studier innen inflammatoriske eller allergisk lungesykdommer ved å innføre en sofistikert, men likevel mulig, eksperimentelle modell for overvåking menneskelige lymfocytt lunge homing på i vivo forhold.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Overveldende vev opphopning av svært aktivert immunceller representerer et kjennetegn på ulike kroniske inflammatoriske sykdommer og dukket opp som en attraktiv terapeutiske mål i klinisk forvaltning av pasientene påvirkes. For å ytterligere optimalisere strategier sikte på terapeutisk regulering av patologisk ubalanserte vev infiltrasjon av pro-inflammatoriske immunceller, vil det være spesielt viktig å oppnå bedre innsikt i sykdommen - og organ-spesifikke homing egenskapene til perifere lymfocytter. Her beskrives eksperimentelle protokollen kan overvåke lunge akkumulering av fluorescently merket og adoptively overførte menneskelige lymfocytter i sammenheng med papain-indusert lungebetennelse. I motsetning til standard in vitro analyser brukte for analyse av immun celle migrasjon og chemotaxis, tar nå innført i vivo innstillingen konto lunge-spesifikke aspekter av vev organisasjon og påvirkning av komplekset inflammatorisk scenariet skjer i den levende murine organismen. Videre tredimensjonale cross-sectional lys arks fluorescens mikroskopiske imaging gir ikke bare kvantitative data på infiltrere immunceller, men også viser mønsteret av immun celle lokalisering i betente lungene. Samlet er vi kunne introdusere en innovativ teknikk av høy verdi for immunologiske forskning innen kronisk inflammatorisk lungesykdommer, som lett kan brukes ved å følge den angitte trinnvise protokollen.

Presentert protokollen beskriver en eksperimentell musemodell, hvilke innrømmer overvåking og kvantifisere akkumulering av adoptively overførte menneskelige T-lymfocytter i lungene via lys arks fluorescens mikroskopi. Figur 1 A gir en skjematisk oversikt i vivo trinnene av eksperimentelle planen. For å garantere pålitelige resultater, det er av vesentlig betydning å sikre god kvalitet av den isolerte og fluorescently merket menneskelige CD4+ T celler, som e...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Her introduserte protokollen tillater karakteristikk av homing lungekapasitet av primære menneskelige lymfocytter under i vivo inflammatoriske tilstander. Lunge infiltrasjon av adoptively overførte menneskelige immunceller i en musemodell av allergiske betennelse kan avbildes og kvantifisert ved lys arks fluorescens mikroskopi av kjemisk ryddet lungevev.

Avansert bildeteknologi av lunge Homing menneskelige lymfocytter i en eksperimentell i Vivo modell av allergiske betennelse basert på lys arks mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Vår teknikk tillater presis avbildning av lunge-akkumulerte menneskelige immunceller i in vivo inflammatoriske forhold som gir spennende innsikt i prosessen med T-celle lunge homing. Denne protokollen støtter translasjonell forskning på T celle lunge homing og kan dermed hjelpe i identifisering av nye mål for en optimalisert terapi av inflammatoriske eller allergiske lungesykdommer. Spesielt gjør evnen til å vurdere påvirkning av sykdomsspesifikke immuncelleegenskaper, lungevevsorganisasjon og inflammatorisk miljø på T-cellelungehoming denne metoden svært fordelaktig.Samlet sett er vår teknikk av høy verdi for immunologisk forskning innen kroniske inflammatoriske lungesykdommer, som ofte drives av en overveldende vevsakkumulering av aktiverte immunceller. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme i en minst 16 gram, seks uker gammel, bedøvet C57 svart 6J-mus, bruk en mikropipe til sakte å levere 10 mikroliter nylaget papainløsning i ett nesebor av musen en gang om dagen i tre påfølgende dager. Dagen etter siste papain administrasjon, lag 10 milliliter Ficoll medium under menneskelig perifert blod fra en sunn frivillig pre-fortynnet på en ett til to ratio i PBS for tetthet gradient separasjon ved sentrifugering.Overfør den perifere mononukleære blodcellen eller PBMC interfaselaget til et nytt 50-milliliter rør og samle cellene ved sentrifugering. Deretter utfører du magnetisk mikroperleisolering av CD4-positive celler i henhold til produsentens protokoll. Re-suspendere perle isolert CD4 positive T-celler på opptil en ganger ti til den syvende T-celler per minst 500 mikroliter pbs konsentrasjon.Merk cellene med et passende rødt lys spennende celleproliferasjonsfarge i 10 minutter ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, arrester merkingreaksjonen med fem volumer av RPMI medium supplert med 10% FBS i fem minutter på is etterfulgt av tre vasker i medium. For adoptivoverføring av de humane CD4-positive T-cellene til papaineksponerte mottakermus, re-suspendere fluorescerende merkede T-celler til en gang 10 til de syvende cellene per milliliter konsentrasjon i PBS og laste 100 mikroliter celler i en en-milliliter sprøyte utstyrt med en 30-gauge nål per mottaker dyr, deretter injisere hele volumet av celler fra en sprøyte inn i halevenen en papain-behandlet dyr opprettholde nålespissen i venen for en ekstra fem sekunder etter cellelevering for å hindre utslipp av cellefjæringen.Tre timer etter adoptivcelleoverføring punkterer du høyre ventrikkel av hver eutaniserte mus med en 21-gauge kanyle koblet til et kateter og gjør et snitt i venstre ventrikkel. Sakte perfuse lungene med 20 milliliter iskald PBS supplert med fem millimolar EDTA etterfulgt av to milliliter iskalde 4% paraformaldehyd. Når alt fikseringsmiddelet har blitt spylt gjennom vevet, fjern spyttkjertlene og kutt sternal hyoidmuskelen slik at en tang kan skled under luftrøret for å avsløre luftrørets vev.Utfør en innledende punktering av det eksponerte luftrøret med en 30-gauge nål før du erstatter nålen med et sløvt 30-gauge kateter for å forhindre ytterligere skade på vevet. Bruk en nåleholder til å forsegle krysset mellom det innsatte kateteret og luftrøret, og fyll luftveiene forsiktig med ca. 37 grader Celsius 0,75 % agarose til den er fullstendig utfoldelse av lungene. Et tett knutepunkt mellom kateter og luftrør er avgjørende for å utvide lungene til sin fysiologiske størrelse og opprettholde vevsarkitektur for avbildning.Når agarose har helt størknet, fjern kateteret og forsiktig overføre lungen til en mørk, to milliliter rør fylt med 4% paraformaldehdye. Deretter dehydrerer vevet med sekvensielle etanolinkubasjoner under kontinuerlig rotasjon ved 31 rotasjoner per minutt og fire grader Celsius som angitt i fire timer per inkubasjon. Etter fullstendig dehydrering, overfør prøven til etylcinnamat for en overnattingsinkubasjon ved romtemperatur til vevet vises gjennomsiktig.For en lysarksfluoresiv mikroskopi, bruk en liten dråpe organisk løsemiddelstabilt lim for å feste lungene til prøveholderen på mikroskopet og sett lungelappen på holderen i oppreist stilling. Plasser prøveholderen i kammeret og velg de riktige laserne for eksperimentet i instrumentprogramvaren. Deretter bruker du glidebryterne under Optikk til å angi en arkbredde som numerisk blenderåpning som jevnt avslører hele orgelet eller en bestemt del av interesse.Bruk glidebryteren til å angi laserintensiteten under laseroverføringskontroll for hver valgte laser og klikk på Bruk. Bruk Avanserte måleinnstillinger til å slå sammen venstre og høyre lysark for å lage et homogent opplyst bilde. Definer start- og sluttposisjonene til Z-stakken som skal måles under skanneområdet, og angi deretter trinnstørrelsen til fem mikrometer, og velg deretter automatisk lagring for å lagre filene automatisk og starte målingen for å fange bildene.Når alle bildene er anskaffet, aktiverer du Surpass-knappen i 3D-analyseprogramvaren etter bildebehandling og laster inn det første bildet fra en Z-stabel for å starte åpningen og automatisk 3D-rekonstruksjon av alle andre bilder av den valgte Z-stakken, og juster deretter intensiteten, svartnivået og kontrasten for hver kanal under Skjermjustering. Hvis du vil sammenligne akkumuleringen av menneskelige celler i lungevevet på tvers av ulike prøver, velger du Rediger og beskjær 3D for å definere en lungekube med et bestemt volum. Hvis du vil kvantifisere de merkede cellene i den definerte lungekuben, åpner du Legg til nye flekker på verktøylinjen, klikker Hopp over automatisk oppretting, redigerer manuelt og velger 640 nanometerkanalen.Sett radiusskalaen til 10,00 mikron, klikk Merk, og under Rediger, Skift klikk med venstre museknapp for å merke hver fluoriseringscelle individuelt med en prikk. Det totale antallet talte celler vises i statistikken. Hvis du vil ta et bilde, bruker du øyeblikksbildeverktøyet og bruker animasjonsverktøyet til å ta opp en video.Mikroperlebasert celleberikelse og påfølgende fluorescensmerking som vist, resulterer vanligvis i en CD4-positiv renhet på minst 95%, og en vellykket merking av disse cellene som bestemmes av strømningscytometri. Etylcinnamate-basert vevsrydding oppnår et høyt nivå av organgjennomsiktighet som indikerer en vellykket brytningsindeksmatching. Det auto-fluorescerende signalet i lungevevet gir et nyttig verktøy for å bilde av den anatomiske strukturen i lungene ved lysarkmikroskopi som kan vises som en gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon eller i overflatemodus.Sammenlignet med konvensjonell mikroskopi, lysark mikroskopi tilbyr fordelen av hele orgelavbildning og påfølgende 3D rekonstruksjon slik at identifisering og visualisering av spredning fargestoff-merket, overførte menneskelige T-celler i sammenheng med hele orgelet, dessuten er preferansen for overførte menneskelige T-celler for selektiv akkumulering i det betente lungevevet av papaineksponerte dyr ytterligere støttet av det faktum at menneskelige CD4 positive T-celler ikke kan hentes fra tarmslimhinnen til mottakerdyrene. For kvantifisering og sammenligning av lungeakkumulering av humane CD4 positive T-celler mellom forskjellige forhold, kan de merkede cellene også telles i flere lungekuer av definert volum som vist. Forsiktig vev forberedelse inkludert lunge perfusjon, inflasjon og vev clearing er svært viktig for en optimalisert generasjon av høyoppløselige lysark mikroskopiske bilder.For ytterligere å bekrefte den vellykkede diapedesen av overførte menneskelige lymfocytter, kan denne protokollen lett kombineres med strømmen cytometrisk kvantifisering av menneskelige lymfocytter i murine bronkoalveolar lavage. Evnen til å overvåke immunceller avledet fra individuelle pasienter i in vivo-forhold støtter identifisering av funksjonelle endringer i immunceller preget av en bestemt sykdom eller terapi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantasjon i en In vitro Simulert ischemia / reperfusjon Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Eksperimentell Menneskelig pneumokokksakkarid Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Utvikling av en Audio-baserte Virtual Gaming Environment for å bistå med Navigasjon Skills i Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Måte Isolert<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusjons i en Rat Modell: Erfaringer fra å utvikle en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi av svulst-assosiert blodkar benytter avansert Dorsal Skinfold vinduet Chambers på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murin modell av Fulminant myokarditt ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...