Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Os autores reconhecem com gratidão financiamento pelo DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 e TRR 241. O Optical Imaging centro Erlangen (OICE) e, em particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal e Tina Fraaß (projeto Z2 da DFG CRC 1181) são reconhecidos por suporte técnico especializado para geração de imagens microscópicas de fluorescência de luz-folha.

Foram realizados experimentos envolvendo animais em conformidade com os protocolos aprovados pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. A coleção de sangue humano foi aprovada pelo Comitê de ético local e o Conselho de revisão institucional da Universidade de Erlangen-Nuremberga. Cada paciente deu consentimento escrito.
1. induzir inflamação alér...

A configuração experimental descrita aqui fornece a oportunidade de monitorar a capacidade de localização pulmonar de células humanas primárias do imunes sob condições inflamatórias em vivo e desse modo relevante complementa classicamente realizada quimiotaxia e adesão in vitro ensaios. Para tomar em características de órgão anatômico específico conta do pulmão, aspectos importantes da célula imune homing (incluindo distribuição de quimiotaxia e célula dentro do órgão-al...

Desordens inflamatórias clássicos do pulmão, como alérgica asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), são conhecidos para ser conduzido por um maior recrutamento de linfócitos ativados no tecido pulmonar1,2. Linfócito-lançado citocinas (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promover quimiotaxia de células do sistema imunológico inatas e adaptativas, induzir a remodelação das vias respiratórias fibrótica ou danificar diretamente o de parênquima pulmonar2. Até agora, os mecanismos subjacentes responsáveis para o acúmulo patológico de linfócitos no tecido pulmonar não são ainda totalmente compreendidos. Em analogia à impressão de tecido-seletiva de célula T descrito para hospedagens de intestino e pele, pulmonares células dendríticas (DCs) são obviamente capazes de prime periféricas células T para infiltração pulmonar preferencial, pelo menos em parte através da indução de expressão CCR4 na superfície de linfócitos3. Além de CCR4, as células T infiltrando as vias aéreas também são caracterizadas por uma expressão particularmente aumentada dos receptores de chemokine CCR5 e CXCR3 em comparação com as células T no sangue periférico1,4,5. Globalmente, existentes de dados são consistentes com o conceito que homing de pulmão dos linfócitos T sob condições fisiológicas ou inflamatórios envolve uma série de chemokine diferentes receptores e seus respectivos ligantes e assim crucialmente depende uma estreita colaboração controlada a colaboração entre células do sistema imunológico inato e adaptativo1. Especialmente, durante a fase inicial de exposição do patógeno ou alérgeno, células do sistema imunológico inato respondem à estimulação TLR ou do cross-linking IgE mediada pela liberação imediata de diferentes quimioatraentes, como LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD21,6,7. Como um exemplo, a interação entre o PGD2 e o receptor quimiotático CRTh2 é conhecido por ser de particular importância para a quimiotaxia de células Th2 e assim apareceu o alvo terapêutico tão promissor no manejo clínico de asma. De fato, pacientes com asma moderada mostraram uma melhoria dos sintomas e um aumento significativo do volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) após o tratamento com um antagonista seletivo de CRTh2 em comparação com o placebo grupo8 ,9. Em um estado mais progrediu da resposta inflamatória, já recrutou as células T são capazes de amplificar ainda mais o acúmulo de linfócitos pulmonar através da liberação de IL-4 e IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, essas células inatas mieloide-derivado up-regulam a expressão de CCL17 e CCL22 em um STAT6-dependente maneira1,10,11.  Embora a complexidade do cenário descrito ainda dificulta uma compreensão completa do pulmão de células T de orientação, oferece uma infinidade de alvos moleculares para um controle terapêutico potencialmente otimizado de doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas. Portanto, há uma necessidade urgente de técnicas experimentais inovadoras, capazes de complementar nosso conhecimento no campo da quimiotaxia de células T e hospedagens de pulmão e aprofundar ainda mais.
Devido ao fato de que a orientação do pulmão de linfócitos dentro do corpo humano é influenciada por vários parâmetros celular, humoral e física1, a maioria dos métodos experimentais existentes não é capaz de modelar a toda complexidade deste processo imunológico. Em vez disso, muitos protocolos padrão para a análise do pulmão orientação seletivamente focar um aspecto específico envolvido em cascata de atração de linfócitos, adesão, migração e retenção. Além de uma determinação puramente descritiva do padrão de expressão do mRNA ou proteínas dos receptores integrinas e chemokine em linfócitos periféricos ou pulmão infiltrando e a medida complementar do chemokine respectivos níveis no sangue, lavagem broncoalveolar (BAL) ou tecido pulmonar12,13,14,15, ensaios de cultura de células in vitro bem-estabelecida permitem uma caracterização funcional da aderência dos linfócitos ou quimiotaxia após definidas condições experimentais16,17,18. Em princípio, os ensaios de aderência in vitro estático monitoram a capacidade de ligação de linfócitos culturas uma monocamada endotelial ou lâminas de vidro revestidas com moléculas de adesão endotelial recombinante (por exemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), enquanto norma in vitro ensaios de quimiotaxia geralmente são aplicados de forma a quantificar a capacidade dos linfócitos de migrar ao longo de um gradiente de chemokine em um sistema de transwell19. Ambas as configurações em vitro permitem um ajuste controlado e modulação das condições experimentais, mas por outro lado, falta variáveis importantes conhecidas por criticamente o impacto na quimiotaxia in vivo e aderência dos linfócitos. Predominantemente, ensaios de cultura estáticas de célula desconsiderar a influência das forças de cisalhamento causado pelo fluxo de sangue permanente19 e potencialmente negligenciam o envolvimento do meio circundante de imunológico e interação não-linfócitos células imunes, os dois presentes em um organismo vivo. Para superar essas limitações, a interpretação dos resultados adquiridos em ensaios in vitro de quimiotaxia ou aderência estáticos precisa mais validação em experimentos de adesão dinâmico sob condições de fluxo20,21 e em modelos de vivo do órgão inflamatória patologia19. De facto, importante na regulação do pulmão de células T orientação sob condições inflamatórias ou alérgicas poderia-se conclusões de estudos com animais analisando geneticamente modificado ratos em modelos definidos de diferentes doenças pulmonares3, 22 , 23. a comparação quantitativa do pulmão infiltrando linfócitos entre sua ratos e camundongos com deficiência para um gene específico de interesse representa uma ferramenta bem estabelecida e amplamente utilizada para definir o impacto de celular particular caminhos ou receptores no padrão de distribuição de células T orientada para a doença. No entanto, em contraste com antes de que discutidos ensaios de cultura de células in vitro, um estudo design baseado em modelos animais clássicos não possui a capacidade de analisar e monitorar primárias células T humanas, diretamente derivadas do sangue ou BAL de pacientes que sofrem de um pulmão inflamatório doença. Assim, ainda permanece desafiador para validar funcionalmente se uma doença de pulmão para o diagnóstico especificado é capaz de imprimir linfócitos humanos para tropismo preferencial do pulmão e quão longe de parâmetros clínicos podem impacto sobre esse cenário. Recentemente, uma abordagem muito elegante em vivo foi introduzida no contexto de doenças inflamatória intestinal (IBD), que foi capaz de superar a maioria destas limitações e abriu novos caminhos para estudos avançados de translação no linfocito intestinal homing24 . Aproveitando-se dos protocolos para compensação de tecido à base de solvente, seguido por microscopia de fluorescência de luz-folha transversal como uma poderosa ferramenta de geração de imagens, foi possível visualizar a infiltração e a distribuição de pilhas de T humanas enviaram transferidas no intestino de camundongos imunodeficientes colitic24. Em particular, essa configuração experimental implementado duas inovações principais: (1) células do sistema imunológico humano primário podem ser analisado sob condições in vivo experimentalmente definidas; (2) uma área bastante grande do órgão doente (aproximadamente 1,5 x 1,5 cm) pode ser fotografada em qualidade de alta resolução, seguida de reconstrução 3D. Além disso, vários estudos recentes estabeleceram com êxito o uso de tecido à base de solvente limpando e microscopia de fluorescência de luz-folha como ferramentas importantes para o pulmão avançado de imagem25,26. Para beneficiar desta evolução tecnológica no campo da imunologia pulmonar, adotamos o sistema de análise de hospedagens de pulmão.
O protocolo apresentado aqui oferece uma introdução passo a passo como purificar e fluorescente etiqueta primária humana T células para transferência em ratos com inflamação pulmonar induzida e, além disso, descreve em detalhes o processo subsequente de luz-folha fluorescência microscópico imagem latente, incluindo preparação de órgão e processamento de imagem. Em geral, esperamos apoiar estudos translacionais futuros no campo das doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas introduzindo um sofisticado, mas o modelo experimental, no entanto, viável para o monitoramento de hospedagens de pulmão linfócito humano nas condições in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Esmagadora de acumulação de tecido de células do sistema imunológico altamente ativadas representa uma marca registrada de várias doenças inflamatórias crônicas e emergiu como um alvo terapêutico atraente no manejo clínico dos pacientes afetados. Para otimizar ainda mais as estratégias destinadas a terapêutico regulamento de infiltração de tecido patologicamente desequilibrada de células do sistema imunológico pró-inflamatórias, será de grande importância para atingir melhorou introspecções em doenças e órgão-específicas Localização de propriedades de linfócitos periféricos. O protocolo experimental descrito aqui permite monitorar o acúmulo de pulmão de linfócitos humanos fluorescente etiquetados e enviaram transferidos no contexto de inflamação pulmonar induzida por papaína. Em contraste com ensaios in vitro padrão frequentemente utilizados para a análise da migração de células imunes e quimiotaxia, a configuração em vivo agora introduzida leva em conta os aspectos de pulmão específicas de organização do tecido e a influência do complexo inflamatório cenário que ocorrem no organismo vivo murino. Além disso, imagem microscópica tridimensional transversal fluorescência de luz-folha só não fornece dados quantitativos sobre a infiltração de células do sistema imunológico, mas também descreve o padrão de localização da célula imune dentro do pulmão inflamado. Em geral, somos capazes de introduzir uma técnica inovadora de alto valor para a investigação imunológica no campo das doenças pulmonar inflamatória crônica, que pode ser facilmente aplicado, seguindo o protocolo passo a passo fornecido.

O protocolo apresentado descreve um modelo experimental do mouse, que permite o monitoramento e quantificar o acúmulo de linfócitos humanos enviaram transferidos do T no pulmão através de microscopia de fluorescência de luz-folha. Figura 1 A fornece uma visão esquemática das etapas em vivo do programa experimental. Para garantir resultados confiáveis, é de substancial importância para garantir uma boa qualidade de isolados e fluorescente rotulado CD4 humano+<...

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Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Nossa técnica permite a imagem precisa de células imunes humanas acumuladas pelo pulmão em condições inflamatórias in vivo fornecendo insights emocionantes sobre o processo de localização pulmonar das células T. Este protocolo apoia pesquisas translacionais sobre o homing pulmonar de células T e pode, assim, ajudar na identificação de novos alvos para uma terapia otimizada de doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas. Em particular, a capacidade de considerar a influência de propriedades de células imunes específicas da doença, organização de tecidos pulmonares e meio inflamatório na espirro pulmonar das células T torna este método altamente vantajoso.No geral, nossa técnica é de alto valor para pesquisas imunológicas no campo de doenças pulmonares inflamatórias crônicas, que muitas vezes são impulsionadas por um acúmulo de tecido avassalador de células imunes ativadas. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato C57 preto 6J de pelo menos 16 gramas, de seis semanas de idade, anestoizado, use um micropipet para entregar lentamente 10 microliters de solução papain recém-preparada em uma narina do mouse uma vez por dia por três dias consecutivos. No dia seguinte à última administração do papain, a camada 10 mililitros de Ficoll médio sob sangue periférico humano de um voluntário saudável pré-diluído em uma proporção de um a dois na PBS para separação gradiente de densidade por centrifugação.Transfira a célula sanguínea mononuclear periférica ou a camada de interfase PBMC em um novo tubo de 50 mililitros e colete as células por centrifugação. Em seguida, realize o isolamento de microesferas magnéticas de células positivas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. Re-suspendendo as células T cd4 positivas isoladas em até uma vez dez vezes a sétima células T por pelo menos 500 microliters de concentração de PBS.Rotule as células com um corante de proliferação celular de luz vermelha apropriada por 10 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, prendam a reação de rotulagem com cinco volumes de meio RPMI suplementados com 10% de FBS por cinco minutos no gelo seguidos por três lavagens em médio. Para transferência adotiva das células T positivas CD4 humanas em camundongos receptores expostos ao papain, suspender novamente as células T fluorescentes rotuladas para uma única vez 10 a sete células por concentração mililitro na PBS e carregar 100 microliters de células em uma seringa de um mililitro equipado com uma agulha de 30 bitola por animal receptor, em seguida, injetar todo o volume de células de uma seringa na veia traseira um animal tratado com papain mantendo a ponta da agulha dentro da veia para um adicional cinco segundos após a entrega da célula para evitar a descarga da suspensão da célula.Três horas após a transferência de células adotivas, puna o ventrículo direito de cada rato eutanizado com uma cânula de 21 bitola conectada a um cateter e faça uma incisão no ventrículo esquerdo. Perfuse lentamente o pulmão com 20 mililitros de PBS gelado suplementado com 5 milimões EDTA seguido por dois mililitros de gelo 4%paraformaldeído. Quando todo o fixador tiver sido lavado através do tecido, remova as glândulas salivares e corte o músculo hioide severo para permitir que um fórceps seja deslizado sob a traqueia para expor o tecido do airtube.Realize uma punção inicial da traqueia exposta com uma agulha de calibre 30 antes de substituir a agulha por um cateter de calibre 30 para evitar danos adicionais ao tecido. Use um suporte de agulha para selar a junção entre o cateter inserido e a traqueia, e encha cuidadosamente as vias aéreas com aproximadamente 37 graus Celsius 0,75% agarose até o completo desdobramento do pulmão. Uma junção apertada entre cateter e traqueia é fundamental para expandir o pulmão para seu tamanho fisiológico e manter a arquitetura tecidual para imagem.Quando a agarose tiver se solidificado completamente, remova o cateter e transfira cuidadosamente o pulmão para um tubo escurecido de dois mililitros preenchido com 4%de desmase de 4%. Em seguida, desidratar o tecido com incubações sequenciais de etanol em rotação contínua a 31 rotações por minuto e quatro graus Celsius, conforme indicado por quatro horas por incubação. Após a desidratação completa, transfira a amostra para cinnamate etílico para uma incubação durante a noite à temperatura ambiente até que o tecido pareça translúcido.Para uma microscopia fluorescente de folha de luz, use uma pequena gota de cola estável de solvente orgânico para grudar o pulmão no suporte amostral do microscópio e coloque o lobo pulmonar no suporte em posição vertical. Coloque o suporte de amostra em sua câmara e selecione os lasers apropriados para o experimento no software de instrumento. Em seguida, use os controles deslizantes sob óptica para definir uma largura de folha que abertura numérica que uniformemente revele todo o órgão ou uma seção específica de interesse.Use o controle deslizante para definir a intensidade do laser sob controle de transmissão a laser para cada laser selecionado e clique em Aplicar. Use configurações avançadas de medição para mesclar as folhas de luz esquerda e direita para criar uma imagem iluminada de forma homogênea. Defina as posições de início e final da pilha Z a serem medidas sob o intervalo de varredura e defina o tamanho da etapa para cinco micrômetros e selecione autosave para salvar os arquivos automaticamente e inicie a medição para capturar as imagens.Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, ative o botão 'Superar' no software de análise pós-imagem 3D e carregue a primeira imagem de uma pilha Z para iniciar a abertura e a reconstrução 3D automática de todas as outras imagens da pilha Z selecionada, em seguida, em Ajuste de Exibição, ajuste a intensidade, nível preto e contraste para cada canal. Para comparar o acúmulo de células humanas dentro do tecido pulmonar em diferentes amostras, selecione Editar e Crop 3D para definir um cubo pulmonar com um volume específico. Para quantificar as células rotuladas dentro do cubo pulmonar definido, abra Adicionar novos pontos na barra de ferramentas, clique em Pular a criação automática, editar manualmente e selecionar o canal de 640 nanômetros.Defina a escala de raio para 10,00 mícrons, clique em Selecionar e em Editar, clique com o botão do mouse esquerdo para marcar individualmente cada célula fluorescente com um ponto. O número total de células contadas será exibido nas estatísticas. Para capturar uma imagem, use a ferramenta snapshot e ou use a ferramenta de animação para capturar um vídeo.Enriquecimento celular baseado em microesferas e rotulagem subsequente de fluorescência como demonstrado normalmente resultam em uma pureza positiva cd4 de pelo menos 95% e uma rotulagem bem sucedida dessas células como determinada pela citometria de fluxo. A limpeza de tecido à base de cinnamate etílico atinge um alto nível de transparência do órgão indicando uma correspondência de índice refrativo bem-sucedida. O sinal auto-fluorescente do tecido pulmonar oferece uma ferramenta útil para visualizar a estrutura anatômica do pulmão por microscopia de folha de luz que pode ser exibida como uma projeção de intensidade média ou no modo de superfície.Comparado com a microscopia convencional, a microscopia de folha de luz oferece a vantagem de toda a imagem de órgãos e posterior reconstrução 3D permitindo a identificação e visualização de células T de papelão-luz no contexto de todo o órgão, além disso, a preferência de células T humanas transferidas para acúmulo seletivo dentro do tecido pulmonar inflamado de animais expostos ao papain é ainda apoiada pelo fato de que as células T positivas do CD4 humano não podem ser recuperadas da mucosa intestinal dos animais receptores. Para a quantificação e comparação do acúmulo pulmonar de células T positivas CD4 humanas entre diferentes condições, as células rotuladas também podem ser contadas em vários cubos pulmonares de volume definido como demonstrado. A preparação cuidadosa do tecido, incluindo perfusão pulmonar, inflação e limpeza de tecidos é altamente importante para uma geração otimizada de imagens microscópicas de folha de luz de alta resolução.Para confirmar ainda mais a diápedese bem sucedida dos linfócitos humanos transferidos, este protocolo pode ser facilmente combinado com a quantificação citométrica de fluxo de linfócitos humanos dentro da lavagem de broncoalveolar murina. A capacidade de monitorar células imunes derivadas de pacientes individuais em condições in vivo suporta a identificação de alterações funcionais em células imunes impressas por uma determinada doença ou terapia.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Medicina

Experimental Human Pneumococcal Carriage

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Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

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The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

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Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

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