Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Авторы с благодарностью признаем, финансирование DFG совместных научно-исследовательских центров SFB 1181 и TRR 241. Оптических изображений центра Эрлангена (ОНИС) и в частности Ральф Палмисано, Филипп Tripal и Тина Fraaß (проект Z2 DFG CRC 1181) признал экспертов техническую поддержку для света лист флуоресценции микроскопических изображений.

Эксперименты с участием животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных соответствующими местными властями в Эрлангене (Regierung фон Унтерфранкен, Вюрцбург, Германия). Мышей были размещены при определенных условиях возбудителя бесплатно. Сбор крови человека был одобр?...

Здесь описаны экспериментальной установки обеспечивает возможность контролировать самонаведения емкости легких первичных человеческих иммунных клеток при воспалительных процессов в естественных условиях и таким образом уместно дополняет классическом исполнении в...

Классический воспалительные заболевания легких, такие как аллергическая астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хорошо известны управляться путем увеличения найма активированных лимфоцитов в легочной ткани1,2. Лимфоцит выпущена цитокинов (например, Ил-4, Ил-5, IL-9, IL-13, ИФН γ и TNF-α) далее содействовать хемотаксис врожденного и адаптивного иммунных клеток, побудить фиброзных сократимость реконструкции или непосредственно повреждения паренхимы легких2. До настоящего времени основные механизмы, ответственные за патологического накопления лимфоцитов в легочной ткани еще не понял полностью. По аналогии с импринтинг ткани селективный Т-клеток, описанные для кожи и кишки самонаведения, легочной дендритных клеток (DCs) способны очевидно премьер периферийные клетки T для проникновения преференциальных легких, по крайней мере частично через индукции CCR4 выражение на поверхности лимфоцитов3. Помимо CCR4 проникают в дыхательные пути Т-клетки характеризуются особенно увеличение выражение хемокиновых рецепторов CCR5 и CXCR3, по сравнению с Т-клеток в периферической крови1,4,5. В целом, существующих данных в соответствии с концепцией легких самонаведения Т-лимфоцитов при физиологических или воспалительные условиях предполагает целый ряд различных хемокиновых рецепторов и их соответствующих лигандов и таким образом в решающей степени зависит тесно контроль взаимодействия между врожденного и адаптивного иммунные клетки1. Особенно на начальном этапе патогена или аллерген воздействия клетки иммунной системы отвечают стимуляции TLR или IgE опосредованной cross-linking немедленного освобождения различные chemoattractants, как LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 и ПГД2в1,6,7. Как яркий пример взаимодействие между ПГД2 и хемотаксического рецептора CRTh2 как известно, имеют особое значение для хемотаксис Th2 клетки и таким образом появилась как многообещающие терапевтические цели в клиническому ведению астмы. Действительно у пациентов с умеренной астмы показали улучшение симптомов и значительное увеличение объема принудительного выдоха в одну секунду (ОФВ1) после лечения с селективный антагонист CRTh2, по сравнению с группой плацебо8 ,9. В состоянии более продвинулись воспалительной реакции уже набранных Т-клетки способны далее усиливать легочной лимфоцитов накопления через выпуск Ил-4 и IL-13 как мощные стимулы для легких DCs. Впоследствии эти врожденной клетки миелоидного производный вверх регулируют выражение CCL17 и CCL22 в STAT6-зависимых образом1,10,11.  Хотя сложность описан сценарий по-прежнему препятствует полное понимание Т-клеток легких самонаведения, он предлагает множество молекулярных целей для элемента потенциально оптимизированный лечебный воспалительным или аллергическим легочных заболеваний. Таким образом существует настоятельная необходимость новаторских экспериментальных методов, которые способны далее углублять и дополнить наши знания в области хемотаксис Т-клеток и легких самонаведения.
С тем, что легких самонаведения лимфоцитов в организме человека влияют несколько сотовых, гуморальный и физических параметров1, большинство существующих экспериментальных методов не способны модели всю сложность этой иммунологические процесса. Вместо этого многие стандартные протоколы анализа легких самонаведения выборочно сосредоточиться на конкретном аспекте участвующих в каскад лимфоцитов притяжения, адгезии, миграция и удержание. Помимо чисто описательного определения мРНК белка или выражению интегринов и хемокиновых рецепторов на лимфоцитах периферической или проникают в легких и дополнительные измерения соответствующих хемокиновых уровней в крови, Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) или легочной ткани12,13,14,15, установившаяся в пробирке клеток культуры анализы позволяют функциональная характеристика лимфоцитов адгезию и хемотаксис После определенных экспериментальных условиях16,17,18. В принципе статические в пробирке адгезии анализов контролировать связывающая способность культурной лимфоциты эндотелиальной монослоя или стеклянных скольжениях покрытые рекомбинантным эндотелиальной адгезии молекулы (например, MAdCAM-1, VCAM-1), то время как стандарт в пробирке хемотаксис анализов обычно применяются для того, чтобы количественно оценить способность лимфоцитов мигрируют вдоль хемокиновых градиент в системе transwell19. Оба в пробирке параметры позволяют контролируемых перестройки и модуляции экспериментальных условиях, но с другой стороны отсутствуют важные переменные, известный критически воздействия на в-vivo хемотаксис и адгезии лимфоцитов. Преимущественно статические клетки культуры игнорировать влияние сдвига, вызванных постоянным крови поток19 и потенциально пренебрегать участия окружающих иммунологические окружение и взаимодействующих-лимфоцит иммунных клеток, Оба представляют в живом организме. Для того, чтобы преодолеть эти ограничения, интерпретацию результатов, приобретенных в статических в пробирке хемотаксис или присоединение анализы требуют дальнейшего проверки в динамических адгезии экспериментов под поток условий20,21 и в в VIVO модели воспалительных орган патологии19. Действительно важные выводы о регулировании Т-клеток легких самонаведения воспалительным или аллергическим условиях от животных исследования анализа генетически изменены мышей в определенных моделей различных легочных заболеваний3, 22 , 23. количественные сравнения легких, проникнув лимфоцитов между wildtype мышей и мышей с дефицитом для конкретных генов интерес представляет устоявшихся и широко используемый инструмент для определения воздействия конкретных сотовых пути или рецепторов на болезнь управляемый характер распределения Т-клеток. Однако в отличие от к до обсуждения в пробирке клеток культуры анализов, Дизайн исследования, основанные на классических моделях животных не хватает возможности для анализа и мониторинга первичных человеческих клеток T непосредственно вытекает из крови или бал пациентов, страдающих от воспалительных легких болезни. Таким образом она по-прежнему остается сложным функционально проверить ли диагностически указанного легкое заболевание способна запечатлеть лимфоцитах человека для преференциального легких тропизма и насколько клинические параметры могут повлиять на этот сценарий. Недавно очень элегантный подход в естественных условиях была введена в контексте воспалительные заболевания кишечника (IBD), который был в состоянии преодолеть большую часть этих ограничений и открыла новые возможности для передовых исследований трансляционного на кишечные лимфоцитов самонаведения24 . Воспользовавшись протоколов для очистки ткани на основе растворителя, следуют поперечного сечения свет лист флуоресцентной микроскопии как мощный инструмент визуализации, можно было визуализировать проникновения и распространения восприимчивую передаваемых человеческих клеток T в кишечнике colitic иммунодефицитных мышей24. В частности, этот экспериментальный параметр реализованы две главные нововведения: (1) основного человеческого иммунные клетки могут быть проанализированы в экспериментально определенных условиях в естественных условиях; (2) довольно большой площади больного органа (около 1,5 х 1,5 см) может отражаться в высоким разрешением качества, следуют 3D-реконструкции. Кроме того некоторые недавние исследования успешно установлено использование ткани на основе растворителя очистки и микроскопии флуоресцирования свет лист как важные инструменты для передовых легких изображений25,26. Для того, чтобы выгоду от этого технологического прогресса в области легких иммунологии, мы сейчас приняли системы для анализа легких самонаведения.
Здесь представлены протокол предусматривает поэтапное введение как для очистки и дневно этикетке первичной человека T клетки для передачи в мышей с индуцированного легочного воспаления и, Кроме того, подробно описывает процесс последующего света-листа флуоресценции микроскопических изображений, включая подготовку орган и обработки изображений. В целом мы надеемся на поддержку будущих трансляционного исследования в области воспалительным или аллергическим легочных заболеваний путем введения сложных, но тем не менее возможно, Экспериментальная модель для мониторинга самонаведения легких человека лимфоцитов на условиях, в естественных условиях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Подавляющее ткани накопление высоко активации иммунных клеток представляет отличительной чертой различных хронических воспалительных заболеваний и стала привлекательным терапевтического клинического управления пострадавших пациентов. Для дальнейшей оптимизации стратегии, направленные на терапевтические регулирования инфильтрации патологически несбалансированным ткани про воспалительных иммунных клеток, он будет иметь особое значение для достижения улучшения идеи в конкретных заболеваний и органа самонаведения свойства периферических лимфоцитах. Здесь описаны экспериментальный протокол позволяет отслеживать накопление легкого дневно обозначенные и восприимчивую передаются лимфоцитах человека в контексте папаин индуцированной воспаления легких. В отличие от стандартных анализов в пробирке часто используется для анализа миграции иммунных клеток и хемотаксис параметр теперь введено в естественных условиях учитывает легких специфические аспекты организации ткани и влияние комплекса воспалительных сценарий, происходящие в живом организме мышиных. Кроме того микроскопических изображений трехмерных поперечного сечения флуоресценции свет лист не только представить количественные данные о проникают в клетки иммунной системы, но также изображает шаблон локализации иммунных клеток в воспаление легких. В целом мы в состоянии внедрить инновационные техники высокого значения для иммунологических исследований в области хронических воспалительных легочных заболеваний, которые могут быть легко применены следуя предоставленного шаг за шагом протокол.

Представленные протокол описывает экспериментально мыши модель, которая позволяет мониторинга и количественной оценки накопления восприимчивую передаваемых человеческий Т-лимфоцитов в легких через свет лист флуоресцентной микроскопии. Рисунок 1 A обеспечи...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Здесь представлен протокол позволяет характеристика самонаведения емкости легких первичного человека лимфоцитов в естественных условиях воспалительные условиях. Легких инфильтрации восприимчивую передаваемых человека иммунокомпетентных клеток в мышиной модели аллергические воспаления может образы и количественно микроскопии флуоресцирования свет лист химически очищенной легочной ткани.

Расширенный визуализации легких самонаведения человека лимфоцитов в экспериментальной модели Vivo аллергические воспаления, основанный на свет лист микроскопия

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Наша методика позволяет точное изображение легких накопленных иммунных клеток человека в воспалительных условиях in vivo обеспечивая захватывающее понимание процесса самонаведения Т-клеток легких. Этот протокол поддерживает трансляционные исследования самонаведения Т-клеток легких и тем самым может помочь в выявлении новых целей для оптимизированной терапии воспалительных или аллергических легочных заболеваний. В частности, способность учитывать влияние специфических заболеваний иммунных клеток, организации легочной ткани и воспалительной среды на самонаводяние Т-клеток легких делает этот метод весьма выгодным.В целом, наша методика имеет большое значение для иммунологических исследований в области хронических воспалительных заболеваний легких, которые часто обусловлены подавляющим накоплением тканей активированных иммунных клеток. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша в по крайней мере 16-граммовый, шестинедельный, анестезированной C57 черный 6J мыши, использовать микропайп медленно доставить 10 микролитров свежеприготовленного раствора папаина в одну ноздрю мыши один раз в день в течение трех дней подряд. На следующий день после последней администрации папаина, слой 10 миллилитров Ficoll среды под человеческой периферической крови от здорового добровольца предварительно разбавленных на один-два соотношения в PBS для разделения градиента плотности центрифугации.Перенесите периферические моноядерные кровяные клетки или межфазный слой PBMC в новую 50-миллилитровую трубку и соберите клетки путем центрифугации. Далее, выполнить магнитную изоляцию микропиба CD4 положительные клетки в соответствии с протоколом производителя. Повторное приостановление бисера изолированных CD4 положительных Т-клеток до одного раза десять седьмой Т-клеток, по крайней мере 500 микролитров концентрации PBS.Этикетка клеток с соответствующим красным светом возбудимого красителя пролиферации клеток в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации, арест маркировки реакции с пятью томами RPMI среднего дополнены 10%FBS в течение пяти минут на льду, а затем три моет в среде. Для принятия передачи человека CD4 положительные Т-клетки в папаин-открытых мышей-реципиентов, повторно приостановить флуоресцентно помечены Т-клеток в один раз от 10 до седьмой клетки на миллилитр концентрации в PBS и загрузить 100 микролитров клеток в один миллилитров шприц оснащен 30-го калибра иглы на животное получателя, а затем ввести весь объем клеток из одного шприца в хвостовой вены папаин-обработанных животных поддержания иглы кончик в вену для дополнительного через пять секунд после доставки ячейки, чтобы предотвратить разряда подвески ячейки.Через три часа после передачи приемной клетки проткните правый желудочек каждой усыпляемой мыши канюлей 21-го калибра, подключенной к катетеру, и сделайте разрез в левом желудочковом отверстии. Медленно пронизыть легкое с 20 миллилитров ледяной PBS дополнены пять миллимолейных EDTA следуют два миллилитров ледяной 4%paraformaldehyde. Когда все фиксатор был промыт через ткань, удалить слюнные железы и сократить стернальной гиоидной мышцы, чтобы типсы, чтобы быть скользнул под трахеей подвергать ткани airtube.Выполните первоначальный прокол открытой трахеи с 30-го калибра иглы перед заменой иглы с тупым 30-калибровочный катетер, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение ткани. Используйте держатель иглы, чтобы запечатать соединение между вставленным катетером и трахеей, и тщательно заполнить дыхательные пути примерно 37 градусов по Цельсию 0,75%agarose до полного раскрытия легких. Плотное соединение между катетером и трахеей имеет решающее значение для расширения легких до его физиологических размеров и поддержания архитектуры тканей для визуализации.Когда агароза полностью затвердеет, удалите катетер и тщательно перенесите легкое в затемненную, двухми миллилитровую трубку, наполненную 4%paraformaldehdye. Далее, обезвоживать ткани с последовательными инкубации этанола под непрерывным вращением на 31 вращения в минуту и четыре градуса по Цельсию, как указано в течение четырех часов на инкубацию. После полного обезвоживания, передать образец в этиловый циннамат для ночной инкубации при комнатной температуре, пока ткань не появится полупрозрачной.Для свето-листовой флуоресцентной микроскопии используйте небольшую каплю органического растворителя стабильного клея, чтобы приклеить легкое к владельцу образца микроскопа и установить легочную долей на держатель в вертикальном положении. Поместите держатель образца в камеру и выберите соответствующие лазеры для эксперимента в программном обеспечении прибора. Далее используйте ползунки под оптикой, чтобы установить ширину листа, что численная диафрагма, которые равномерно выявить весь орган или определенный раздел интереса.Используйте ползунок, чтобы установить интенсивность лазера под контролем лазерной передачи для каждого выбранного лазера и нажмите Применить. Используйте расширенные настройки измерения для слияния левого и правого световых листов для создания однородно освещенного изображения. Определите стартовые и конечные позиции стека, которые будут измеряться в диапазоне сканирования, и установите размер шага до пяти микрометров, затем выберите автосейву для автоматического сохранения файлов и начните измерение для захвата изображений.Когда все изображения были приобретены, активируйте кнопку Surpass в программном обеспечении для анализа 3D после визуализации и загрузите первое изображение из одного стека, чтобы инициировать открытие и автоматическую 3D-реконструкцию всех других изображений выбранного стека, а затем под корректировку дисплея, отрегулируйте интенсивность, черный уровень и контрастность для каждого канала. Для сравнения накопления человеческих клеток в легочной ткани в различных образцах, выберите Редактировать и урожай 3D для определения кубика легких с определенным объемом. Для количественной оценки помеченных ячеек в рамках определенного куба легких откройте Add New Spots в панели инструментов, нажмите кнопку Пропустить автоматическое творение, редактировать вручную, и выберите канал 640 нанометров.Установите шкалу радиуса до 10,00 микрон, нажмите Выберите, и под редактировать, Shift нажмите левой кнопкой мыши, чтобы индивидуально пометить каждую флуоресцирование ячейки с точкой. Общее количество подсчитанных ячеек будет отображаться в статистике. Чтобы запечатлеть изображение, используйте инструмент моментального снимка и или используйте инструмент анимации для захвата видео.Обогащение клеток на основе микробусов и последующая маркировка флуоресценции, как это обычно демонстрируется, приводят к положительной чистоте CD4 по крайней мере 95% и успешной маркировке этих клеток, определяемой цитометрией потока. Очистка тканей на основе этилового циннамата достигает высокого уровня прозрачности органов, что свидетельствует об успешном соответствии рефракционного индекса. Автофлуоресцентный сигнал легочной ткани предлагает полезный инструмент для изображения анатомические структуры легких с помощью светового листа микроскопии, которые могут отображаться в качестве проекции среднего интенсивности или в поверхностном режиме.По сравнению с обычной микроскопией, световая микроскопия предлагает преимущество всей визуализации органов и последующей 3D-реконструкции, позволяющей идентифицировать и визуализировать пролиферацию красителя с маркировкой, переданных Т-клеток человека в контексте всего органа, кроме того, предпочтение переданных Т-клеток человека для селективного накопления в воспаленной легочной ткани папин-открытых животных также подтверждается тем фактом, что человеческие CD4 положительные Т-клетки не могут быть извлечены из кишечника. Для количественной оценки и сравнения легочного накопления человеческих CD4 положительных Т-клеток между различными условиями, помеченные клетки также могут быть подсчитаны в нескольких легких кубов определенного объема, как попродемонстрировано. Тщательная подготовка тканей, включая перфузию легких, инфляцию и очистку тканей, очень важна для оптимизированного поколения микроскопических изображений с высоким разрешением.Для дальнейшего подтверждения успешного диапедеза переданных лимфоцитов человека, этот протокол может быть легко объединен с потоком цитометрической количественной оценки человеческих лимфоцитов в murine бронхоалвеолярной лаваж. Способность контролировать иммунные клетки, полученные от отдельных пациентов в условиях in vivo, поддерживает выявление функциональных изменений в иммунных клетках, отпечатанных конкретным заболеванием или терапией.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Экспериментальные человека перевозке пневмококковой

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Развитие Audio на основе виртуальной игровой среды для оказания помощи навыки навигации в слепых

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Метод Изолированные<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Легких перфузии в крысиной модели: уроки, извлеченные из Разработка EVLP программы Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Прижизненной микроскопии опухольассоциированных сосудистую использования передовых спинной складки окно камеры на трансгенные флуоресцентных мышей

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...