Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt finansiering av DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 och TRR 241. Den optisk Imaging Centre Erlangen (OICE) och i särskilt Ralf Palmisano, Philipp Tripal och Tina Fraaß (projektet Z2 av de DFG CRC 1181) är erkända för teknisk expertsupport för ljus ark fluorescens mikroskopbilder.

Experiment med djur utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av de berörda lokala myndigheterna i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Möss inkvarterades särskilda villkor patogenfria. Insamling av humanblod godkändes av den lokala etiska kommittén och den institutionella Granskningsnämnden av universitetet i Erlangen-Nürnberg. Varje patient gav skriftligt informerat samtycke.
1. framkalla allergisk lunginflammation hos möss
<str...

Den här beskrivna experimentella inställningen ger möjlighet att övervaka den målsökande lungkapacitet av primära mänskliga immunceller under Invivo inflammatoriska tillstånd och därmed relevant komplement klassiskt utförs in vitro-vidhäftning och chemotaxisna analyser. För att ta in i konto specifikt anatomiska organ egenskaper i lungan, viktiga aspekter av immunceller homing (inklusive Kemotaxis och cell distribution inom målorganet) samt klinisk relevans och överförbarhet a...

Klassiska inflammatoriska sjukdomar i lungorna, såsom allergisk astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), är väl känt att drivas av en ökad rekrytering av aktiverade lymfocyter in i pulmonell vävnad1,2. Lymfocyter-släppt cytokiner (t.ex., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ och TNF-α) ytterligare främja chemotaxis av medfödd och adaptiv immunceller, inducerar fibrotiska luftvägarna remodeling eller direkt skada på lungan parenkymet2. Hittills har är de underliggande mekanismerna som ansvarar för patologisk ansamling av lymfocyter i lungvävnaden ännu inte helt förstått. I analogi till vävnad-selektiva T cell imprinting beskrivs för tarmen och huden homing, pulmonell dendritiska celler (DCs) är självklart kunna prime perifera T-celler för förmånliga lunginfiltration, åtminstone delvis via induktion av CCR4 uttryck på den ytan av lymfocyter3. Förutom CCR4 kännetecknas luftvägarna-infiltrera T-celler också av ett särskilt ökat uttryck av chemokine receptorer CCR5 och CXCR3 jämfört med T-celler i perifert blod1,4,5. Övergripande, befintliga data är konsekventa med begreppet att lungan homing av T-lymfocyter fysiologiska eller inflammatoriska villkor omfattar ett antal olika chemokine receptorer och deras respektive ligander och därmed beror ytterst på en nära kontrollerade samarbete mellan medfödd och adaptiv immunceller1. Särskilt under den inledande fasen av patogen eller allergen exponering svarar celler av det medfödda immunsystemet TLR stimulering eller IgE-medierad cross-linking av omedelbar frigivning av olika chemoattractants, som LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 och PGD21,6,7. Som ett paradexempel, samspelet mellan PGD2 och korrektiv receptorn CRTh2 är kända för att vara av särskild betydelse för chemotaxis av Th2-celler och således synts så lovande terapeutiskt mål i kliniska hanteringen av astma. Faktiskt, patienter med måttlig astma visade en förbättring av symtom och en betydande ökning av forcerad exspiratorisk volym under en sekund (FEV1) efter behandling med selektiva CRTh2 antagonist jämfört med placebo gruppen8 ,9. I en mer avancerad tillstånd av den inflammatoriska reaktionen är redan rekryterade T celler att ytterligare förstärka pulmonell lymfocyter ackumulering via frisättningen av IL-4 och IL-13 som potenta stimuli för pulmonell DCs. Därefter uppreglera dessa myeloisk-derived medfödda celler uttryck för CCL17 och CCL22 i en STAT6-beroende sätt1,10,11.  Trots komplexiteten i det beskrivna scenariot försvårar fortfarande en fullständig förståelse av T-cell lung homing, erbjuder det en uppsjö av molekylära mål för en potentiellt optimerad terapeutisk kontroll av inflammatoriska eller allergiska sjukdomar. Därför finns det ett akut behov av innovativa experimentella metoder, som har möjlighet att ytterligare fördjupa och komplettera vår kunskap inom T cell Kemotaxis och lung homing.
På grund av att lungorna homing av lymfocyter i kroppen påverkas av flera cellulära och humorala fysiska parametrar1, är de flesta av de befintliga experimentella metoderna inte kunna modellera hela komplexiteten i denna immunologiska process. Istället, fokusera många standardprotokoll för analys av lung homing selektivt på en särskild aspekt som är inblandade i kaskaden av lymfocyter attraktion, vidhäftning, migrering och lagring. Förutom en rent beskrivande bestämning av mRNA eller protein uttrycksmönstret av integriner och chemokine receptorer på perifera eller lung-infiltrera lymfocyter och kompletterande mätning av respektive chemokine nivåer i blod, bronkoalveolär lavage (BAL) eller pulmonell vävnad12,13,14,15, väletablerade in vitro rapportör cell kultur analyser tillåta en funktionell karakterisering av lymfocyter vidhäftning eller chemotaxisna vid definierade försöksbetingelser16,17,18. I princip övervaka statiska in vitro-vidhäftning analyser bindande kapacitet av odlade lymfocyter till en endothelial enskiktslager eller objektglas bestruket med rekombinant endothelial adhesionsmolekyler (t.ex. MAdCAM-1, VCAM-1), medan standard in vitro- chemotaxis analyser används vanligtvis för att kvantifiera lymfocyter förmåga att migrera längs en chemokine övertoning i en transwell system19. Båda in vitro-inställningarna aktivera en kontrollerad justering och modulering av experimentella förhållanden, men å andra sidan saknar viktiga variabler känd som kritiskt inverkan på Invivo Kemotaxis och vidhäftning av lymfocyter. Huvudsakligen, statisk cell kultur analyser bortse från påverkan av skjuvning krafter orsakade av den permanenta blod flöde19 och försumma potentiellt den omgivande immunologiska miljö och samverkande icke-lymfocyter immunceller, engagemang båda finns i en levande organism. För att övervinna dessa begränsningar, tolkning av resultat som förvärvats i statiska in vitro-chemotaxisna eller följsamhet analyser behöver ytterligare validering i dynamiska vidhäftning experiment under flöde villkor20,21 och i i vivo modeller av inflammatoriska orgel patologi19. Ja, viktiga slutsatser om regleringen av T-cell lung homing inflammatorisk eller allergisk villkor kunde dras från djurstudier analysera genetiskt modified möss i definierade modeller av olika lungsjukdomar3, 22 , 23. kvantitativ jämförelse av lung infiltrera lymfocyter mellan vildtyp möss och möss med en brist för en specifik gen av intresse utgör ett väletablerat och i stort sett används verktyg för att definiera effekterna av särskilda cellulär vägar eller receptorer på sjukdomen-driven mönster av T-cell distribution. I kontrast till innan diskuteras in vitro rapportör cell kultur analyser, saknar en studiedesign baserad på klassisk djurmodeller dock förmågan att analysera och övervaka primära humant T-celler som direkt härrör från blod eller BAL av patienter som lider en inflammatorisk lungsjukdom sjukdom. Alltså, det är fortfarande utmanande att funktionellt verifiera om ett diagnostiskt angivna lungsjukdom är kunna avtryck mänskligt lymfocyter för förmånliga lung tropism och hur långt kliniska parametrar kan påverka på detta scenario. Nyligen infördes ett mycket elegant Invivo synsätt i samband med inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), som kunde övervinna de flesta av dessa begränsningar och öppnat nya vägar för avancerade translationella studier på intestinal lymfocyter homing24 . Dra nytta av protokoll för lösningsmedelsbaserade vävnad clearing följt av tvärsnittsdata ljus ark fluorescensmikroskopi som ett kraftfullt imaging verktyg, var det möjligt att visualisera infiltration och distribution av adoptively överförda mänskliga T celler i tarmen colitic nedsatt immunförsvar möss24. I synnerhet denna experimentella inställning genomfört två viktigaste innovationer: (1) primär mänsklig immunceller kan analyseras på experimentellt fastställda Invivo villkor; (2) ett ganska stort område av sjuka organ (ca 1,5 x 1,5 cm) kan avbildas i högupplöst kvalitet, följt av 3D-rekonstruktion. Dessutom etablerat flera färska studier framgångsrikt användningen av lösningsmedel-baserade vävnad clearing och ljus ark fluorescensmikroskopi som viktiga verktyg för avancerad lungcancer imaging25,26. Utnyttja detta tekniska framsteg i pulmonell immunologi, antagit vi nu systemet för analys av lung homing.
Här presenteras protokollet ger en stegvis introduktion hur att rena och fluorescently etikett primära humant T-celler för överföring till möss med inducerad Exponeringsinducerad inflammation och, dessutom i detalj beskriver den efterföljande processen av ljus-ark fluorescens mikroskopbilder, inklusive orgel förberedelse och bildbehandling. Sammantaget hoppas vi kunna stödja framtida translationella studier av inflammatoriska eller allergiska lungsjukdomar genom att införa en sofistikerad, men ändå genomförbar, experimentell modell för övervakning av mänskligt lymfocyter lung homing på förhållandena in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Överväldigande vävnadsansamling av starkt aktiverade immuncellerna representerar ett kännetecken för olika kroniska inflammatoriska sjukdomar och framträtt som ett attraktivt terapeutiska mål i kliniska hanteringen av drabbade patienter. För att ytterligare optimera strategier som syftar till terapeutiska reglering av patologiskt obalanserad vävnad infiltration av pro-inflammatoriska immunceller, blir det särskilt viktigt att uppnå förbättrade insikter till sjukdom - och organ-specifika perifera lymfocyter homing egenskaper. Här beskrivs experimentella protokollet tillåter för att övervaka lung ackumulering av fluorescently märkta och adoptively överförda humana lymfocyter i samband med papain Exponeringsinducerad inflammation. Till skillnad från in vitro-standardanalyser som ofta används för analys av immunceller migration och Kemotaxis, nu introducerade Invivo inställningen tar konto lung-specifika aspekter av vävnad organisation och påverkan av komplexet inflammatoriska scenario som äger rum i den levande murina organismen. Dessutom tredimensionella tvärsnittsdata ljus ark fluorescens mikroskopbilder ger inte bara kvantitativa uppgifter om infiltrera immunceller, men också skildrar mönstret av immunceller lokalisering inom inflammerad lungan. Sammantaget kan vi införa en innovativ teknik för högt värde för immunologisk forskning i fältet av kroniska inflammatoriska lungsjukdomar, som lätt kan tillämpas genom att följa protokollet angivna steg för steg.

Presenterade protokollet beskriver en experimentell musmodell, som möjliggör övervakning och kvantifiera ansamling av adoptively överförda humana T-lymfocyter i lungan via ljus ark fluorescensmikroskopi. Figur 1 A föreskrivs en schematisk översikt över hur Invivo av experimentella schemat. För att garantera tillförlitliga resultat, är det av väsentlig betydelse för att säkerställa en god kvalitet av den isolerade och fluorescently märkt mänskliga CD4+<...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Här introducerades protokollet tillåter karakterisering av den målsökande lungkapacitet av primära humana lymfocyter under Invivo inflammatoriska tillstånd. Pulmonell infiltration av adoptively överförda mänskliga immunceller i en musmodell av allergisk inflammation kan avbildas och kvantifieras av ljus ark fluorescensmikroskopi av kemiskt clearade lungvävnad.

Avancerade Imaging av Lung Homing mänskligt lymfocyter i en experimentell i Vivo modell av allergisk Inflammation baserat på ljus-ark mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Vår teknik möjliggör exakt bildbehandling av lung-ackumulerade mänskliga immunceller i in vivo inflammatoriska förhållanden ger spännande insikter i processen för T cell lung homing. Detta protokoll stöder translationell forskning om T-cellslunga homing och kan därigenom hjälpa till vid identifiering av nya mål för en optimerad terapi av inflammatoriska eller allergiska lungsjukdomar. I synnerhet, förmågan att överväga påverkan av sjukdomsspecifika immuncell egenskaper, pulmonell vävnad organisation, och inflammatorisk miljö på T-cells lung homing gör denna metod mycket fördelaktigt.Sammantaget är vår teknik av högt värde för immunologisk forskning inom området kroniska inflammatoriska lungsjukdomar, som ofta drivs av en överväldigande vävnadsansamling av aktiverade immunceller. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en minst 16-gram, sex veckor gamla, sövda C57 svart 6J mus, använd en micropipet att långsamt leverera 10 mikroliter av nyberedda papain lösning i en nostril av musen en gång om dagen i tre dagar i följd. Dagen efter den sista papain administrering, lager 10 milliliter av Ficoll medium under humant perifert blod från en frisk volontär pre-utspädd vid en ett till två förhållandet i PBS för densitet gradient separation genom centrifugeringen.Överför det perifera mononukleära blodcellen eller PBMC-interfasskiktet till ett nytt 50-milliliterrör och samla in cellerna genom centrifugeringen. Därefter utför magnetisk mikrobead isolering av CD4 positiva celler enligt tillverkarens protokoll. Re-suspending pärlan isolerade CD4 positiva T-celler på en upp till en gånger tio till den sjunde T-celler per minst 500 mikroliter av PBS koncentration.Märk cellerna med ett lämpligt rött ljus retbart cellproliferation färgämne i 10 minuter vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, arrestera märkningsreaktionen med fem volymer RPMI medium kompletterat med 10%FBS i fem minuter på is följt av tre tvättar i medium. För adoptivöverföring av de mänskliga CD4-positiva T-cellerna till papainexponerade mottagarmöss, åter upphäva de fluorescently märkta T-cellerna till en en gång 10 till sjunde celler per milliliterkoncentration i PBS och ladda 100 mikroliter celler i en en milliliterspruta utrustad med en 30-gauge nål per mottagardjur, injicera sedan hela volymen av celler från en spruta i svansvenen ett papainbehandlat djur som upprätthåller nålspetsen i venen för ytterligare en fem sekunder efter cellleverans för att förhindra utsläpp av cellupphängningen.Tre timmar efter adoptivcellöverföring punkterar du höger kammare hos varje dödshjälpsmus med en 21-gauge kanyl ansluten till en kateter och gör ett snitt i den vänstra ventrikeln. Långsamt genomsyra lungan med 20 milliliter iskall PBS kompletteras med fem millimolar EDTA följt av två milliliter iskall 4%paraformaldehyd. När alla fixative har spolats genom vävnaden, ta bort spottkörtlarna och skär sternala hyoid muskeln att tillåta en tlyktor som ska gled under luftstrupen att exponera airtube vävnad.Utför en första punktering av den exponerade luftstrupen med en nål med 30 gauge innan nålen ersätts med en trubbig kateter med 30 gauge för att förhindra ytterligare skador på vävnaden. Använd en nålhållare för att täta korsningen mellan den insatta katetern och luftstrupen, och fyll försiktigt luftvägarna med cirka 37 grader Celsius 0,75%-agaros tills den är klar utspelad i lungan. En tät korsning mellan kateter och luftstrupe är avgörande för att expandera lungan till dess fysiologiska storlek och upprätthålla vävnadsarkitektur för avbildning.När agaros har helt stelnat, ta bort katetern och försiktigt överföra lungan i en förmörkad, två-milliliter rör fyllt med 4%paraformaldehdye. Därefter dehydrera vävnaden med sekventiella etanol inkubationer under kontinuerlig rotation vid 31 rotationer per minut och fyra grader Celsius som anges i fyra timmar per inkubation. Efter fullständig uttorkning, överför provet till etyl cinnamate för en övernattning inkubation vid rumstemperatur tills vävnaden verkar genomskinlig.För en ljus-ark fluorescerande mikroskopi, använd en liten droppe av organiskt lösningsmedel stabilt lim för att hålla lungan till provhållaren av mikroskopet och ställa lungloben på hållaren i upprätt läge. Placera provhållaren i dess kammare och välj lämpliga lasrar för experimentet i instrumentprogramvaran. Därefter använder reglagen under Optik för att ställa in ett ark bredd som numerisk bländare som enhetligt avslöjar hela organet eller en viss del av intresse.Använd skjutreglaget för att ställa in laserintensiteten under laseröverföringskontroll för varje vald laser och klicka på Använd. Använd Avancerade måttinställningar för att sammanfoga vänster och höger ljusark för att skapa en homogent belyst bild. Definiera start- och slutpositioner för Z-stacken som ska mätas under skanningsområde och ställ in stegstorleken på fem mikrometer väljer sedan autospara för att spara filerna automatiskt och påbörja mätningen för att fånga bilderna.När alla av bilderna har förvärvats, aktivera Knappen Överträffa i 3D efter bildframställning analys programvara och ladda den första bilden från en Z-stack för att initiera öppnandet och automatisk 3D-rekonstruktion av alla andra bilder av den valda Z-stacken, sedan under Display Justering, justera intensitet, svart nivå och kontrast för varje kanal. För att jämföra ansamling av mänskliga celler i lungvävnaden mellan olika prover väljer du Redigera och Beskär 3D för att definiera en lungkub med en specifik volym. Om du vill kvantifiera de märkta cellerna inom den definierade lungkuben öppnar du Lägg till nya fläckar i verktygsfältet, klickar på Hoppa över automatiskt skapande, redigera manuellt och väljer nanometerkanalen 640.Ställ in radieskalan på 10,00 mikrometer, klicka på Välj och under Redigera skiftklickar du med vänster musknapp för att individuellt markera varje fluorescerande cell med en punkt. Det totala antalet räknade celler kommer att visas i statistiken. Om du vill fånga en bild använder du ögonblicksbildsverktyget och eller använder animeringsverktyget för att fånga en video.Microbead-baserade cell anrikning och efterföljande fluorescens märkning som visat typiskt resultera i en CD4 positiv renhet på minst 95%och en framgångsrik märkning av dessa celler som bestäms av flödescytometri. Ethyl cinnamate-baserade vävnad clearing uppnår en hög nivå av organ öppenhet som anger en framgångsrik brytningsindex matchning. Den automatisk fluorescerande signalen i lungvävnaden erbjuder ett användbart verktyg för att avbilda den anatomiska strukturen i lungan genom ljus-ark mikroskopi som kan visas som en genomsnittlig intensitet projektion eller i ytläge.Jämfört med konventionell mikroskopi, light-sheet mikroskopi erbjuder fördelen av hela organ bildbehandling och efterföljande 3D-rekonstruktion möjliggör identifiering och visualisering av spridning färgämne-märkt, överförd mänskliga T-celler i samband med hela organet, dessutom, företräde överförd mänskliga T-celler för selektiv ackumulering inom den inflammerade lungvävnad av papain-exponerade djur stöds ytterligare av det faktum att mänskliga CD4 positiva T-celler inte kan hämtas från tarmslemhinnan hos de mottagande djuren. För kvantifiering och jämförelse av lungansamlingen av mänskliga CD4 positiva T-celler mellan olika förhållanden kan de märkta cellerna också räknas i flera lungkuber av definierad volym som påvisas. Noggrann vävnad förberedelse inklusive lungperfusion, inflation och vävnad clearing är mycket viktigt för en optimerad generering av hög upplösning ljus-ark mikroskopiska bilder.För att ytterligare bekräfta den framgångsrika diapedesis av överförda mänskliga lymfocyter, kan detta protokoll enkelt kombineras med flödet cytometrisk kvantifiering av mänskliga lymfocyter inom murine bronchoalveolar lavage. Förmågan att övervaka immunceller som härrör från enskilda patienter i in vivo villkor stöder identifiering av funktionella förändringar i immunceller präglade av en viss sjukdom eller terapi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentell Human Pneumococcal Transport

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Utveckling av en ljud-baserad virtuell spelmiljö för att bistå med kunskaper i navigering i Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metod för Isolerad<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en råttmodell: Lärdomar från Utveckla en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi av tumör-associerad vaskulatur använder avancerade dorsala Skinfold fönster Chambers på transgena fluorescerande möss

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...