Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

ونحن نشكر الين زخاري للمساعدة التقنية. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة وايت هول" (منحة عام 2017-05-35) و "كليون جيم Arrington البحوث بدء برنامج منح" (تلاعب-93) A.M.M. ماج و D.W.Y. على حد سواء حظيت بزمالة 2CI "نيوروجينوميكس جامعة الدولة في جورجيا".

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية جورجيا.
1-إعداد الخلايا العصبية هيبوكامبال الأولية (في هود الاندفاق الصفحي)
<ol><li>عزل الخلايا العصبية هيبوكامبال الابتدائي من يوم الولادة الجنس المختلط (ف) 0-1 الفئران كما تم وصفه سابقا36.</li>
	<li>صفيحة من الخلايا العصبية في 96-جيدا بولي-د-يسين المغلفة ميكروبلاتيس في كثافة 2 × 104 خلايا كل بئر.</li>
	<li>تعد وسائل الإعلام لتغذية الخلايا العصبية بإضافة 10 مل 50 س B-27، 5 مل 100 × الجلوتامين، ميليلتر 242 من 10 ملغ/مل 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر) و 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل مع الجنتامايسين إلى 485 مل وسائط العصبية (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>تغذية الخلايا العصبية كما تم وصفه سابقا36 بإزالة نصف (100 ميليلتر) من القائمة من قبل وسائل الإعلام (المشار إليها كوسائل الإعلام المكيفة، التي تحتوي على المكونات التي تدعم بقاء الخلايا العصبية) من كل بئر واستبدال مع 100 ميليلتر من 37 درجة مئوية بريوارميد وسائل الإعلام في الخطوة 1، 3 إعداد كل 3-4 أيام. قم بتخزين الوسائط مكيفة من كل تغذية في 4˚C لخطوة 2، 3.</li>
</ol>2-قياس مستقبلات امبا الاتجار في الاستجابة إلى دهبج (في هود الاندفاق الصفحي)
<ol><li>في اليوم في المختبر (DIV) 14، إعداد حل أسهم 500 ميليلتر من تيدرودوتاكسين (ت) بتركيز 2 مم باستخدام خلية ثقافة المياه الصف. تنبيه: ت عصبي. التعامل معها بعناية وتجنب ملامسة الجلد.</li>
	<li>استخدام ماصة متعددة القنوات، إزالة 100 ميليلتر من كل بئر الميكروسكوبية 96-جيدا من الخلايا العصبية وتجمع وسائط الإعلام.</li>
	<li>إضافة 2 ميليلتر من حل ت الأسهم إلى 1 مل من وسائط الإعلام مكيفة المجمعة من الخطوة 2.2 لإنشاء حل ت 4 ميكرومتر. إذا لم يكن هناك تجميع ما يكفي من وسائل الإعلام المكيفة، ثم استخدام بعض الوسائط المخزنة مكيفة من "الخطوة 1، 4".</li>
	<li>علاج الخلايا العصبية مع 100 ميليلتر/جيدا من حل ت 4 ميكرومتر من الخطوة 2، 3. مكان الميكروسكوبية في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية ح 4.</li>
	<li>إرفاق زجاج معقمة باستور "الماصة؛" لخط شفط وإرفاق حد 200 ميليلتر ماصة معقمة بتلميح الماصة. قم بإزالة الوسائط من كل كذلك بعناية. تجنب لمس أسفل الميكروسكوبية حيث توجد الخلايا العصبية.</li>
	<li>إضافة 200 ميليلتر من الوسائط العصبية في درجة حرارة الغرفة لكل بئر.</li>
	<li>احتضان الميكروسكوبية في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة حضانة في 5% CO2 هو المفضل ولكن ليس من الضروري.</li>
</ol>3-إيمونولابيلينج (في هود الاندفاق الصفحي)
<ol><li>إعداد إضعاف 1:150 جسم GluA1 المضادة أو مكافحة GluA2 في الوسائط العصبية.</li>
	<li>قم بإزالة الوسائط العصبية بإضافتها في "الخطوة 2، 6". إضافة 50 ميليلتر من الحلول الأجسام المضادة GluA1 المضادة أو مكافحة GluA2 لآبار المقابلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح ربط جسم. إضافة 50 ميليلتر من الوسائط العصبية إلى جسم الثانوية فقط مراقبة الآبار.</li>
	<li>إزالة جسم الحلول بإضافتها في الخطوة 3، 2. أغسل الميكروسكوبية 3 مرات مع 100 درجة حرارة الغرفة ميليلتر/بئر الوسائط العصبية لإزالة أي أجسام غير منضم.</li>
	<li>جعل حل أسهم 50 مم من دهبج في الوسائط العصبية أو خلية ثقافة الصف المياه. دوامة الحل بإيجاز حل دهبج الكامل. إعداد هذا الحل الطازجة في اليوم نفسه من التجربة. تجنب استخدام الحلول القديمة أو المذابة.</li>
	<li>تمييع الحل الأسهم في الوسائط العصبية إلى 1: 500 لجعل حل 100 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بإزالة الوسائط الموجودة من كل بئر. إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل الأسهم دهبج 100 ميكرون من 3.5 خطوة. احتضان الميكروسكوبية في الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إزالة الحل دهبج بإضافتها في الخطوة 3، 6 وإضافة الوسائط العصبية ميليلتر/بئر 100. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. مكان الميكروسكوبية في الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة السكروز لجعل الحل السكروز paraformaldehyde/4% 4% في برنامج تلفزيوني في اليوم نفسه من التجربة. تجنب استخدام الحلول القديمة أو المذابة. قم بإزالة الوسائط بإضافتها في الخطوة 3، 7. إضافة من محلول السكروز paraformaldehyde/4% 4% 100 ميليلتر/جيدا. كرر الخطوات من 3.6-3.8 لكل نقطة الوقت الإضافي. بمجرد اكتمال، احتضان الميكروسكوبية عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تنبيه: التعامل مع الأرصدة بارافورمالدهيد في غطاء دخان.</li>
	<li>إزالة مثبت من الخطوة 3.8 واضافه 100 ميليلتر/جيدا من البرد x DPBS 1.</li>
	<li>إزالة دببس. إضافة 150 ميليلتر/بئر حجب المخزن المؤقت (صيغة جاهزة للاستخدام في تبس، أرجع إلى الجدول للمواد) واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 90 دقيقة بدلاً من ذلك، تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
</ol>4-وضع العلامات المستقبلات السطحية
<ol><li>إعداد إضعاف 1:1500 680RD الماعز الماوس المضادة IgG جسم الثانوية في المخزن المؤقت لحظر.</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت حظر من الخطوة 3، 10. إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 60 دقيقة تبقى الميكروسكوبية محمية من الضوء بمجرد إضافة الأجسام المضادة الثانوية. تأكد من الاستمرار في حماية الصفيحة من الضوء خلال إينكوبيشنز اللاحقة.</li>
	<li>إزالة الحل من الخطوة 4، 2. إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS (50 مم تريس-HCl، 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.6) واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة 4 مرات إضافية.</li>
	<li>إزالة TBS من الخطوة 4، 3. إضافة من السكروز paraformaldehyde/4% 4% 100 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إزالة الحل من الخطوة 4، 4. إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 2 مرات إضافية.</li>
</ol>5-وضع العلامات السكان مستقبلات المدخلة
<ol><li>إعداد تبس تحتوي على صابونين 0.2%. دوامة الحل بإيجاز بالكامل حل مسحوق صابونين. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون لإزالة أي الجزيئات التي يمكن أن تسبب السيارات-الأسفار.</li>
	<li>إضافة 150 ميليلتر تبس تحتوي على صابونين 0.2% واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إزالة الحل صابونين من الخطوة 5، 2 وإضافة 150 ميليلتر/كذلك حظر في المخزن المؤقت. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.</li>
	<li>إعداد إضعاف 1:1500 800CW حمار الماوس المضادة مفتش الثانوي جسم في المخزن المؤقت لحظر.</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت حظر من الخطوة 5، 3 وإضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 4 مرات إضافية.</li>
</ol>6-التصوير والتحليل
<ol><li>صورة ميكروسكوبية 96-جيدا باستخدام ليزر الأشعة تحت حمراء التصوير النظام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعيين دقة المسح الضوئي إلى 84 ميكرومتر، ونوعية المسح الضوئي إلى المتوسطة والتركيز تعويض وفقا لارتفاع الميكروسكوبية 96-كذلك تستخدم قاعدة. انقر فوق ← زر القائمة "الصورة استوديو" تصدير ← صورة "الوسائط الرقمية" ← تصدير الصور بدقة 300 نقطة في البوصة، في تنسيق TIFF.</li>
	<li>تحميل صورة ي "فيجي" في https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>فتح الصورة في الصورة ي "فيجي". تقسيم قنوات الألوان بالنقر على القائمة "صورة" لون ← تقسيم القنوات.</li>
	<li>فتح إدارة العائد على الاستثمار من "تحليل" ← "أدوات". حدد المربع "تسميات" في إدارة العائد على الاستثمار لتسمية الدوائر مع أرقام.</li>
	<li>باللون الأحمر قناة (680 نانومتر مستقبلات سطح حوض السباحة)، حدد المنطقة من الفائدة (العائد على الاستثمار) عن طريق تحديد أداة الدائرة ورسم دائرة يناسب دقة البئر الأولى. اضغط Ctrl + T.</li>
	<li>اسحب الدائرة إلى التالي جيدا واضغط Ctrl + T. تكرار حتى يتم حلق جميع الآبار.</li>
	<li>من إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق "إجراء". حدد القيم التي تظهر ونسخها إلى جدول بيانات.</li>
	<li>انقر فوق قناة الأخضر (800 نانومتر مستقبلات داخلية حوض السباحة) وثم تبديل رويس مختارة من الخطوة 6، 6 بالصورة. من إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق "إجراء". حدد القيم التي تظهر ونسخها إلى جدول بيانات.</li>
	<li>حساب القيم متوسط كثافة المتكاملة من الثانوية فقط التحكم في الآبار. طرح قيم الكثافة المتكاملة لكل بئر تجريبية من قيم الكثافة السيطرة المتكاملة فقط الثانوي متوسط لتجمع مستقبلات سطحية. كرر هذه الخطوة لتجمع مستقبلات داخلية.</li>
	<li>حساب التغيرات في التعبير مستقبلات السطحية باستخدام Rs/Rt، حيث تمثل Rs المتكاملة كثافة المستقبلات السطحية وارتي يمثل كثافة المستقبلات السطحية متكامل + كثافة المتكاملة مستقبلات داخلية.</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مستقبلات امبا هي النوع فرعي مستقبلات غلوتامات إيونوتروبيك التي جزء لا يتجزأ لوظائف الخلايا العصبية التي تشمل تشكيل المشبك المشبك واﻻستقرار اللدونة متشابك. اضطراب مستقبلات امبا مرتبط ب اضطرابات عصبية متعددة24 وتعتبر المخدرات جاذبية أهداف40. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات أن واحدة من علامات المبكرة من مرض الزهايمر (AD) هو فقدان المشبك وخفض مستويات مستقبلات امبا متشابك41،42. الفضول، وإضافة ليغومرات اميلويد-ß يضعف التعبير مستقبلات المحتوية على GluA1 امبا السطحية في نهايات43. علاوة على ذلك، مركز epilepticus أسفل-ينظم مرناً GluA2 والبروتين في الخلايا العصبية هيبوكامبال السابقة على وفاة44. في التصلب العضلي الجانبي (المرض)، وأمراض البروتين (ماساتشوستس-43) "القطران الحمض النووي" ملزم، شذوذ جزيئية خاصة بالمرض، وقد تم مرتبطة بالكفاءة GluA2 Q/R الموقع-الجيش الملكي النيبالي تحرير45.
عالية--محتوى امبا مستقبلات الإنزيم الاتجار يوفر وسيلة فعالة لقياس التغيرات الأكبر في مستقبلات ملفات تعريف الاتجار بالبشر ضمن شبكة الخلايا العصبية استجابة لعوامل مختلفة، تستهلك أقل بكثير من الوقت والمواد من الأساليب البديلة. ميكروسكوبية 96-بئر واحدة توفر الآبار العديدة تشغيل تقنية متعددة وإنشاء نسخ متماثلة وعناصر تحكم للظروف التجريبية المختلفة في نفس اللوحة. كثافة منخفضة والطلاء 2 × 104 خلايا/جيدا بالنسبة إلى كثافة الخلايا/بئر 5 × 105 يقلل كثيرا من عدد الحيوانات والمواد المطلوبة لكل تجربة (الشكل 1). الماسح الضوئي الأشعة تحت الحمراء يمكن الصورة يصل إلى ستة 96-بئر ميكروبلاتيس في وقت واحد. يمكن أيضا تعديل المقايسة إلى ميكروسكوبية جيدا 38446، الذي يصبح على وجه التحديد قيمة إذا تم تشغيل الفحص عينات الثمينة التي يصعب الحصول عليها أو غالية الثمن للثقافة (العينات البشرية مثلاً والخلايا الجذعية المستحثة pluripotent). يمكن إكمال التحليل الكامل وحللت في نفس اليوم، مما يوفر وقتاً ثمينا (الشكل 1).
لإتمام ناجحة وفعالة المقايسة، تحتاج بعض النقاط التي سينظر فيها. أولاً، من المهم إعداد الحل دهبج في نفس اليوم لعلاج العصبية. لا إعادة استخدام أو تجميد الأرصدة دهبج. كما ينبغي الطازجة السكروز paraformaldehyde/4% 4 ٪ في حل برنامج تلفزيوني في اليوم نفسه من التجربة. وثانيا، آبار مراقبة تعامل مع ت فقط أو مركبة مطلوبة لضمان محددة لمعالجة آثار لاحظ. كما أن من المهم أن تشمل الآبار تعامل مع الأجسام المضادة الثانوية فقط لعنصر التحكم للأسفار الخلفية التي تنتجها ملزمة غير محددة. علما أن الخطوة الثانية التثبيت (تبييض التالية من الأجسام المضادة الثانوية) هي المفتاح للحد من تأثيرات خلفية جسم الثانوي وتحقيق وسمها فعال من مفارز مستقبلات.
حلول توفيقية والقيود، كما هو الحال مع أي أسلوب، موجودة. هذا التحليل لا يوفر القرار خلية واحدة (أو سوبسيلولار)، ولا يسمح بتتبع في الوقت الحقيقي من مستقبلات الاتجار مثل أخرى أساليب32،،من3335. بالإضافة إلى ذلك، يجب اتخاذ الرعاية المناسبة خلال الخطوة بيرميبيليزيشن من الخلايا العصبية، هذا الأسلوب سوف تكون حساسة لتسرب العناصر داخل الخلايا في حالة الإفراط بيرميبيليزيشن.

حجم وديناميات الزمانية لاستثارة الخلايا العصبية يعتمد إلى حد كبير على توافر وتكوين السكان مستقبلات السطحية التي ترانسدوسي الإشارات الكهروكيميائية. حين تركيب مستقبلات جديدة (أو مفارز مستقبلات) عموما عملية قوة مكلفة وطويلة الأمد نسبيا، مجموعة من الأجهزة الخلوية مخصصة إندو-والرقابة من المستقبلات الموجودة توفر وسيلة لإدخالهم بسرعة وإزالة من الغشاء1. ولذلك، بالإضافة إلى تنظيم مستقبلات النسخي ومتعدية الجنسيات، الاتجار مستقبلات بوسترانسلاشونال هو المغير هامة لاستثارة الخلايا العصبية.
ويعتقد اللدونة متشابك، أو قوة تغيير الاتصالات بين الخلايا العصبية مع التجربة، لتشكل أساسا للتعلم والذاكرة2،3. تقوية وإضعاف نقاط الاشتباك العصبي مع مرور الوقت، ووصف التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) والاكتئاب الطويل الأجل (المحدودة)، على التوالي، يمكن أن يكون التضمين من خلال الاتجار بمستقبلات حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (امبا) 4 , 5-مستقبلات امبا هيتيروتيتراميرس تتألف من أربع وحدات فرعية (GluA1-4)، والتوسط في أغلبية ضادات سرعة انتقال متشابك في الدماغ6. وهكذا، استثارة الخلايا العصبية في جزء كبير منه دالة لكمية امبا مستقبلات على سطح بوستسينابتيك المتاحة لتنشيط بواسطة الغلوتامات. المحدودة ويرتبط عادة مع زيادة في امبا مستقبلات الالتقام، بينما LTP يرتبط أساسا بزيادة الرقابة مستقبلات امبا. يتطلب التعبير السطحي بوستسينابتيك امبا مستقبلات تسليم اندوسومال للبروتينات اكسوسيتوتيك، حيث يحدث الانصهار مع غشاء البلازما ثم في طريقة تعتمد على الكالسيوم7،،من89، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وتوجد أيضا مجموعة من الآليات التي تنظم نشاط تعتمد امبا مستقبلات الالتقام. واحد الأمثلة على ذلك عن طريق الجينات المبكر الفوري Arc/Arg3.1 (Arc). من بين مهام أخرى15، يعرف القوس التوسط مستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك (مجلور)-تعتمد المحدودة عن طريق تعزيز امبا مستقبلات الالتقام من خلال شركائها الملزمة، التي تشمل البروتينات اندوسيتيك AP-2، اندوفيلين-3 ودينامين-2 16 , 17 , 18 , 19، في كلاثرين المغلفة حفر20،21. مستقبلات امبا المدخلة يمكن أما إعادة تدويرها مرة أخرى إلى غشاء البلازما أو المخصصة لتدهور22،23.
الأهم من ذلك، يساهم تشكيل وحدة فرعية من مستقبلات امبا ديناميات الاتجار24. أهمية رئيسية هو المجال ج-محطة داخل الخلايا من الوحدات الفرعية، حيث تحدث غالبية التعديلات بوستترانسلاشونال والتفاعلات المتصلة بالاتجار البروتين. GluA1 و GluA4 التي تحتوي على وحدة فرعية امبا المستقبلات خاصة عرضه للاتجار بهم إلى سطح الخلية خلال الكمونية، جزئيا بسبب وجود على يغاندس بدز، تسلسل الأحماض الأمينية ~ 90 التي تروج للأغشية رسو عبر التفاعل مع مختلف بدز المجال التي تحتوي على بروتينات25،26. من ناحية أخرى، تميل امبا المستقبلات المحتوية على GluA2 والتي تفتقر إلى GluA1 أو GluA4 إلى يهرب مؤثرا ولكن تتراكم إينتراسيلولارلي مع النشاط متشابك27. مفارز GluA2 الخضوع للحمض النووي الريبي التحرير التي، بالإضافة إلى تعزيز الاحتفاظ في هيولى28، يجعل المسام قناة كتيمة إلى29من الكالسيوم، كذلك تورط وحدة فرعية محددة الاتجار كوسيط رئيسي للخلايا العصبية التوازن واللدونه. من المثير للاهتمام، قد تبين توقف تدهور القوس ubiquitin-تعتمد على زيادة GluA1 الالتقام وزيادة التعبير السطحي GluA2 التي تحتوي على وحدة فرعية امبا مستقبلات بعد تحريض من مجلور--المحدودة مع انتقائية المجموعة الأولى مؤثر مجلور (ق)--3، 5-ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج)، مما يشير إلى أنه ما زال يمكن تعلمه بشأن الآليات ودور وحدة فرعية محددة امبا مستقبلات الاتجار30.
أساليب لمراقبة التغيرات في سطح التعبير عن مستقبلات غالباً ما تكون مرهقة، وتستغرق وقتاً طويلاً، أو إدخال غير ضرورية يفند. فحوصات على أساس البيوتين نهج منتشرة ومتوفرة تجارياً. انجذاب تطهير مستقبلات سطحية بيوتينيلاتيد يمثل أحد الأمثلة، إلا أن ضرورة إجراء التفريد يتطلب كمية كبيرة من مواد العينة ويمكن أن تجعل فحص عدة علاجات باهظة طويلة 31من العملية. ملحقات لهذا التحليل، حيث يتم تنفيذ متعددة النقاط الزمنية لوضع العلامات وإيمونوبريسيبيتيشنز لقياس التدهور التدريجي لإشارة أولية، وبالمثل الإهمال الإضافة جديدة – أو المعاد تدويرها – مستقبلات الخلية السطحية وإلا تؤدي إلى تفاقم الوقت والاحتياجات من المواد.
نهوج أخرى الاستفادة من بنيات تشيميريك أو إضافة علامات مضيئة لمراقبة الاتجار مستقبلات32، وفي بعض الأحيان استخدام لايف الخلية التصوير،من3334. في حين يحتمل أن تكون قوية، هذه التصاميم يمكن أن تؤثر على أنماط الاتجار العادي من مستقبلات سبب طفرات أو تغيرات دراماتيكية في الوزن الجزيئي وعرض في هذه البروتينات. استخدام الأصباغ التي تسمية المقصورات سوبسيلولار باستهداف الأس الهيدروجيني المنخفض34،35 هي غير محددة، وجعل التمييز بين الأقسام المختلفة داخل الخلايا الهامة لمستقبلات الاتجار غير المشروع (على سبيل المثال. ليسوسوميس و proteasomes) صعبة. وأخيراً، استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] تصور كولوكاليزاتيون مستقبلات مع علامات المرتبطة بالاتجار بالأشخاص والتدهور، مثل البروتينات اندوسومال أو كلاثرين، بينما يحتمل أن توفر الترجمة محددة مع نظرة ثاقبة مفيدة القرار سوبسيلولار، والوقت، وكثيفة العمالة، ومكلفة بسبب ضرورة تحليل منفردة كل خلية، والاشتراط [كنفوكل] أو مجهرية فائقة القرار.
هنا، علينا أن نظهر مقايسة الاتجار مستقبلات عالية المحتوى متوافق مع ثقافة العصبية الأولية الاستعدادات30. تسميات هذا الأسلوب بشكل منفصل في تجمعات مستقبلات سطحية وداخل الخلية من الخلايا العصبية الثابتة، مما يتيح عرض البيانات كنسبة من سطح طبيعية أو كثافة مستقبلات المدخلة إلى الكثافة الإجمالية لأن المستقبلات. طبيعة المحتوى العالي من هذا الأسلوب مثالية لفحص عدة علاجات و/أو الأنماط الجينية في فترة زمنية قصيرة، وتتطلب خبرة حضانة استزراع وجسم الخلية القياسية فقط.
بإيجاز، الخلايا العصبية الأولية هي تزرع في معيار 96-جيدا ميكروبلاتيس وثم تعامل وفق ما تمليه التصميم التجريبي والمحتضنة مع الأجسام المضادة الأولية وغسلها وثابتة. ثم هي المحتضنة الخلايا مع جسم ثانوية لتسمية المستقبلات السطحية، تليها خطوة أخرى من التثبيت. بيرميبيليزيشن ثم يحدث وجسم ثانوية ثانية تستخدم لتسمية برك مستقبلات داخلية. وأخيراً، يتم تصويرها الخلايا استخدام ماسح ضوئي ميكروسكوبية فلورسنت الأشعة تحت حمراء لقياس كثافة السكان مستقبلات كل متكامل. ويلخص الشكل 1 لدينا مقايسة محتوى عالية بالمقارنة مع الإنزيم بيوتينيليشن تقليدية.
في حين عرضت البروتوكول هنا هو الأمثل ومحددة لمستقبلات امبا الاتجار في الثقافات العصبية هيبوكامبال الأولية، هذا الإجراء يمكن، من الناحية النظرية، الموسعة وتكييفها لمستقبلات مختلفة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

بوستسينابتيك الاتجار مستقبلات من سطح الخلية وآلية هامة لتعدل الخلايا العصبية التي قدرتها على الاستجابة للمحفزات المختلفة. المستقبلات (امبا) حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic، والمسؤولة عن انتقال متشابك ضادات سريع في الخلايا العصبية، يتجر بهم من السطح بوستسينابتيك بشكل حيوي تغيير استثارة الخلايا العصبية. امبا مستقبلات الاتجار ضروري اللدونة متشابك، ويمكن أن تتعطل في الأمراض العصبية. ومع ذلك، تجاهل النهج السائد للتحديد الكمي للاتجار مستقبلات مستقبلات أكمله برك، هي مفرطة الوقت-وكثيفة العمالة، أو يحتمل أن تعطيل آليات الاتجار بالبشر العادي وتعقيد ولذلك تفسير البيانات الناتجة عن ذلك. نقدم مقايسة عالية المحتوى للتحديد الكمي للسكان مستقبلات امبا السطحية والداخلية على حد سواء في الخلايا العصبية هيبوكامبال الابتدائي مثقف استخدام إيمونولابيلينج نيون مزدوج وماسح ضوئي القريبة من الأشعة تحت الحمراء فلورسنت 96-جيدا ميكروسكوبية. سطح كثافة مستقبلات مع تقليل المواد عينة هذا النهج ويسهل الفرز السريع من استيعاب الجزء الأكبر. ومع ذلك، لدينا أسلوب قد قيودا في الحصول على قرار خلية واحدة أو إجراء تصوير الخلايا الحية. وأخيراً، أن هذا البروتوكول قد تكون قابلة للمستقبلات وأنواع الخلايا المختلفة، وقدمت التعديلات المناسبة والتحسين الأخرى.

القوس/Arg3.1 يسرع امبا مستقبلات الالتقام من خلال التفاعل مع AP-2، اندوفيلين-3 ودينامين-216،18 بعد التنشيط مجلور37. في قوس تدق في الماوس (أرككر)، وهي تحور ليسينيس 268 و 269 في البروتين القوس إلى ارجينين، الذي يتداخل مع أوبيكويتيناتيون القوس. وهذا يعوق دوران بروتوزوم-تعتمد على القوس ويطيل عمرها النصفي في الخلايا العصبية21،30. في هذه التجربة، تم بحث استمرار القوس في تنظيم الاتجار بمستقبلات امبا استخدام محتوى عالي امبا مستقبلات الإنزيم الاتجار بالبشر. وعولج الخلايا العصبية مع مانع قناة نا+ ت، مما يحول دون إمكانات العمل ويقلل من قوس مستويات38، تليها دهبج، الذي يدفع القوس الترجمة و37،أوبيكويتينيشن39. السطح وبرك المدخلة من GluA1-(الشكل 2A) وقيست مفارز مستقبلات امبا (الشكل 3A) المحتوية على GluA2 في 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. تستخدم هذه التجربة خاصة replicates التقنية الثلاثة من 3 التجارب المستقلة. أركر الخلايا العصبية أظهرت زيادة الالتقام GluA1 عندما تعامل مع دهبج مقارنة بوزن الخلايا العصبية، هو تأثير الذي لم يكن ينظر إليه عندما كانت تعامل الخلايا العصبية مع ت فقط (الشكل 2). التعبير السطحي من مفارز GluA2 ارتفع عند نقطة زمنية قصيرة مقارنة بوزن الخلايا العصبية (الشكل 3B)، تشير إلى إمكانية استبدال وحدة فرعية30. وعولج بعض الآبار مع الأجسام المضادة الثانوية فقط لعنصر التحكم للأسفار الخلفية الناجمة عن الربط غير محدد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> رقم 1: مقارنة بين مستقبلات امبا المحتوى السامي المقايسة الاتجار للانزيم بيوتينيليشن مستقبلات. تحليل الاتجار عالية المحتوى يستهلك أقل من الوقت والموارد مقارنة بمقايسة بيوتينيليشن القياسية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> رقم 2: السكان السطحية والداخلية لمفارز مستقبلات GluA1 امبا في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر- (أ) سطح (sGluA1) والمدخلة (iGluA1) التي تحتوي على GluA1 امبا مستقبلات مفارز في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر في 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. مقارنة WT، أركر الخلايا العصبية قد انخفاضا آخر في المحتوية على sGluA1 امبا مستقبلات تجمع 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. (ب) الرسم البياني يمثل fluorescence السطحية تطبيع لشدة مجموع الأسفار. وأجريت مقارنات إحصائية استخدام ANOVA أحادي اتجاه، اختبارات t المزدوجة ومزاوج للطالب. p ≤ 0.05؛ n = 3 replicates التقنية من 3 التجارب المستقلة. وتمثل القيم يعني ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من الجدار، م. ج. وآخرون 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> الشكل 3: السكان السطحية والداخلية لمفارز مستقبلات GluA2 امبا في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر- (أ) نفس الحالة التجريبية الرقم 2. مقارنة WT، قد أركر الخلايا العصبية زيادة في تجمع مستقبلات امبا المحتوية على sGluA2 5 دقائق بعد تبييض دهبج. (ب) الرسم البياني يمثل fluorescence السطحية تطبيع لشدة مجموع الأسفار. وأجريت مقارنات إحصائية استخدام أحادي الاتجاه ANOVA، اختبارات t المزدوجة ومزاوج للطالب. p ≤ 0.05؛ n = 3 replicates التقنية من 3 التجارب المستقلة. وتمثل القيم يعني ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من الجدار، م. ج. وآخرون 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

يمكن أن يكون التضمين استثارة الخلايا العصبية من خلال عملية ديناميكية إندو-والرقابة إيونوتروبيك ضادات مستقبلات الغلوتامات. الموصوفة هنا مقايسة موجوداً، وارتفاع محتوى للتحديد الكمي لتجمعات السكان مستقبلات السطحية والداخلية.

مقايسة محتوى عالية لرصد امبا مستقبلات الاتجار

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

هنا نبرهن على محتوى عالية مستقبلات الاتجار بالتشجار التي تتوافق مع إعداد الثقافة العصبية الأولية. هذه الطريقة تسميات منفصلة سطح برك مستقبلات قبو inter من الخلايا العصبية الثابتة. تمكين عرض البيانات كنسبة من سطح طبيعي أو كثافة مستقبلات داخلية إلى الكثافة الكلية لتلك المستقبلات.إن المحتوى العالي وقياس الاتجار بالمستقبلات يوفر وسيلة لقياس التغيرات الكبيرة في ملامح الاتجار بالمستقبلات داخل الشبكة العصبية استجابة لعوامل مختلفة. تستهلك وقتا أقل بكثير والمواد من الطرق البديلة. وقد ارتبطت الاضطرابات والاتجار بالمنظورين باضطرابات عصبية متعددة، وتعتبر أهدافا جذابة للعلاج بالعقاقير.على سبيل المثال أظهرت الدراسات واحدة من أقدم علامات مرض الزهايمر هو فقدان متشابك وتقلص تجمعات متشابك والمدب. تتطلب هذه التقنية العديد من الخطوات المختلفة من صعوبة متفاوتة. خاصة لأن التعامل مع لوحة 96 بئر والتلاعب في الآبار يمكن أن يكون من الصعب على شخص دون خبرة.ولأن نتائج التجربة حساسة للغاية للتعامل غير السليم ، فمن المفيد عرض الخطوات المختلفة التي يتم تنفيذها. مدرب للبدء، وتغذية الخلايا العصبية في لوحة 96 جيدا عن طريق إزالة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام الموجودة من قبل من كل بئر. واستبداله بـ 100 ميكروليتر من وسائل الإعلام تم تسخينها مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.كل ثلاثة إلى أربعة أيام. يوم في المختبر 14، واستخدام متعدد pipet لإزالة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام من كل بئر وتجمع وسائل الإعلام. إضافة اثنين microliters من TTX الأسهم الحل إلى ملليلتر واحد من وسائل الإعلام مكيفة مجمع لخلق حل أربعة ميكرومولار من TTX.علاج الخلايا العصبية في كل بئر مع 100 ميكرولترات من أربعة محلول TTX micromolar. إذا لم يكن هناك ما يكفي من وسائط الحالة المجمعة إضافة بعض الوسائط المخزنة مسبقاً. احتضان في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.بعد هذا إزالة TTX القائمة التي تحتوي على وسائل الإعلام وإضافة 200 microliters من وسائل الإعلام العصبية قبل الدافئة، واحتضان لوحة صغيرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة. أولا إزالة وسائل الإعلام العصبية من لوحة صغيرة. إضافة خمسين ميكرولترات من المضادة gluA1 أو المضادة لحلول الأجسام المضادة gluA2 إلى الآبار المقابلة من لوحة صغيرة.إضافة خمسين microliters من وسائل الإعلام العصبية للجسم المضاد الثانوية السيطرة فقط الآبار. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشرين دقيقة للسماح للأجسام المضادة ملزمة. بعد هذا إزالة الوسائط الموجودة من الآبار.غسل لوحة صغيرة ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة وسائط عصبية في كل بئر لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة. ثم إضافة 100 ميكرولتررز 100 micromolar من حل الأسهم DHPG إلى كل بئر. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق.المقبل إزالة الحل DHPG وإضافة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام العصبية إلى كل بئر. كرر هذه العملية مرة ثانية. ثم احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.في يوم التجربة إعداد حل من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ سكروز NPBS. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر واستبداله مع 100 ميكرولترات من حل شبه شكلي وsucrose. كرر هذه العملية لكل نقطة وقت الإضافة.احتضان لوحة صغيرة في 4 درجات مئوية لمدة عشرين دقيقة. ثم إزالة المثبت وإضافة 100 ميكرولترات من DPBS إلى كل بئر. إزالة DPBS وإضافة 150 ميكروليتر من العازلة حظر إلى كل بئر.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة تسعين دقيقة. قم بإزالة العازلة العازلة وإضافة 50 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ستين دقيقة مع الحفاظ على لوحة محمية من الضوء.إزالة حل الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولترات من TBS إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار إضافة TBS، والاحتضان في درجة حرارة الغرفة أربع مرات إضافية.بعد ذلك، إزالة TBS من لوحة صغيرة. إضافة 100 ميكرولترات من محلول من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة عشر دقيقة.إزالة حل paraformaldehyde وإضافة 100 ميكرولترات من TBS في كل بئر، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين إضافية. أولاً إعداد حل TBS تحتوي على 2٪ سابونين ودوامة الحل لفترة وجيزة إلى حل مسحوق السابونين تماما.باستخدام مرشح 2 ميكرومتر، تصفية الحل لإزالة أي جزيئات التي يمكن أن تسبب الفلوروس. إضافة 150 ميكرولترات من هذا الحل سابونين 2٪ لكل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة. ثم إزالة الحل saponin، وإضافة 150 ميكرولترات من العازلة حظر إلى كل بئر.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة تسعين دقيقة. بعد هذا إزالة العازلة حظر وإضافة 50 ميكروليترس من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ستين دقيقة.ثم إضافة 100 ميكرولترات من TBS إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية إضافة TBS والتحضان في درجة حرارة الغرفة أربع مرات إضافية. باستخدام الأشعة تحت الحمراء ليزر نظام التصوير صورة 96 جيدا لوحة صغيرة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.تعيين دقة المسح الضوئي إلى 84 ميكرومتر. جودة المسح الضوئي إلى متوسطة والتركيز إزاحة وفقا لارتفاع قاعدة 96 جيدا لوحة صغيرة المستخدمة. انقر على زر القائمة Image Studio ، تصدير صورة للوسائط الرقمية ، وتصدير الصور بدقة 300 نقطة في البوصة في تنسيق TIFF.افتح الصورة في ImageJ فيجي. تقسيم قنوات اللون عن طريق النقر على قائمة الصورة ثم اللون، تقسيم القنوات. ثم افتح مدير عائد الاستثمار من تحليل ، والأدوات.حدد خانة التسميات في مدير عائد الاستثمار، لتصنيف الدوائر بالأرقام. في 6 80، أو قناة حمراء، حدد المنطقة ذات الأهمية عن طريق تحديد أداة الدائرة ورسم دائرة تناسب بشكل دقيق أول بئر. ثم اضغط على Ctrl plus T، وسحب الدائرة إلى البئر التالية.كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع الآبار. من مدير العائد على الاستثمار انقر فوق قياس. حدد القيم التي تظهر ثم نسخها إلى ورقة انتشار.انقر بعد ذلك على القناة الخضراء ونقل ROIs المحدد إلى الصورة. من مدير العائد على الاستثمار انقر فوق قياس. حدد القيم التي تظهر ثم نسخها إلى ورقة انتشار.بعد هذا حساب التغييرات التعبير مستقبلات السطح كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذا الإجراء يتم فحص استمرار القوس في تنظيم الاتجار مستقبلات أمبا باستخدام محتوى عالية الاتجار مستقبلات أمبا ومجرا. يتم التعامل مع الخلايا العصبية مع مانع قناة الصوديوم أيون TTX الذي يمنع إمكانات العمل ويقلل من مستويات القوس.تليها DHPG الذي يحفز ترجمة قوس وSubiquitination. تم قياس كل من السطح واستيعاب برك من gluA1 وgluA2 التي تحتوي على وحدات فرعية مستقبلات APA في خمس وخمس عشرة دقيقة بعد تبييض DHPG. تظهر الخلايا العصبية ArcKR زيادة الشتوة الداخلية gluA1 عند التعامل مع DHPG، بالمقارنة مع حين نوع الخلايا العصبية.لا ينظر إلى هذا التأثير عندما يتم التعامل مع الخلايا العصبية TTX فقط. يتم زيادة التعبير السطحي لـ gluA2 الفرعية بشكل كبير في نقاط زمنية قصيرة مقارنة بالخلايا العصبية من النوع الويل. تشير إلى استبدال محتمل لـ Subunit.يجب التأكد من أن الخلايا غير السائلة ثابتة شبهformaldehyde ينبغي أن تكون مستعدة جديدة في يوم التجربة. يجب إعادة إصلاح الخلايا بعد وضع العلامات لمستقبلات السطح. طرق أخرى مثل المجهر confocal سوف تكون قادرة على توفير القرار خلية واحدة إلى مزيد من وصف تغيير ذات الصلة في بنية الخلايا العصبية وتوطين المستقبلات.تعطيل الديناميات الزمنية قوس يغير مستقبلات أمبا الاتجار ردا على MgluR بوساطة المحدودة. التوجهات المستقبلية ستكون لقياس مستقبلات أمبا الاتجار استجابة للمحفزات الأخرى. هذا الفحص ربما قابل للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى, العلاجات والمستقبلات, شريطة أن يتم تعديل الإجراء بعناية والتحقق من صحتها بشكل مناسب.يجب الحرص على ضمان تحسين كثافة الخلايا وأوقات المعالجة وخطوات التثبيت وخطوات permeabilization واختيارات الكاشف بنظامك الذي يهمك. من أجل الانتهاء من النجاح والكفاءة في الفحص من المهم إعداد حل DHPG و 4٪ شبهformaldehyde ، محلول السكروز 4٪ في يوم التجربة. التحكم تعامل بشكل جيد مع vakeel أو TTX مطلوبة للتأكد من أن الآثار التي لوحظت محددة للعلاج.كما أنه من الأهمية بمكان أن تشمل الآبار المعالجة بالأجسام المضادة الثانوية فقط للتحكم في الفلورس الخلفية التي تنتجها ملزمات غير محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

رصد حركة العين من الذاكرة

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

مقايسة الفلورة يستند إلى الخلية بسيطة للكشف عن الأجسام ضد مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) في الدم

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

اكتب أساليب لاكتشاف مركبات الرواية تحوير مستقبلات حمض غاما أمينوبوتيريك – كبيرة

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...