Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Vi takker Zachary Allen for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Joes C. Arrington forskning indledning Grant Program (RIG-93) A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. blev begge støttet af en Georgia State University Neurogenomics 2CI Fellowship.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Georgia State University.
1. forberedelse af primære hippocampus neuroner (i Laminar Flow Hood)
<ol><li>Isolere primære hippocampus neuroner fra blandet sex postnatal dag (P) 0-1 mus som tidligere beskrevet36.</li>
	<li>Plade neuroner i 96-brønd poly-D-lysin belagt mikroplader med en tæthed på 2 x 104 celler pr. brønd.</li>
	<li>Forberede medier for fodring af neuroner ved tilsætning af 10 mL af 50 x B-27, 5 mL 100 x glutamin, 242 µL af 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) og 10 µL af 10 mg/mL phosphatbufferet til 485 mL af neuronal media (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Feed neuroner som tidligere beskrevet36 ved at fjerne halvdelen (100 µL) af de eksisterende media (benævnt konditioneret medier, som indeholder bestanddele, der understøtter neuronal overlevelse) fra hver brønd og erstatte med 100 µL af 37 ° C forvarmet medier rede i trin 1.3 hver 3-4 dage. Gemme konditioneret medierne fra hver fodring på 4˚C for trin 2.3.</li>
</ol>2. måling af AMPA-receptoren menneskehandel som svar på DHPG (i Laminar Flow Hood)
<ol><li>På dagen i Vitro (DIV) 14, forberede en 500 µL stamopløsning af Tetrodotoxin (TTX) ved en koncentration på 2 mM ved hjælp af cellekultur grade vand. Forsigtighed: TTX er en nervegift. Håndtere omhyggeligt og undgå kontakt med huden.</li>
	<li>Brug af en multikanal-pipette, ophæve 100 µL af hvert hul i 96-brønd mikrotiterplade af neuroner og pool i medierne.</li>
	<li>Tilføj 2 µL af stamopløsningen TTX til 1 mL af poolede konditioneret medierne fra trin 2.2 opretter en 4 µM løsning af TTX. Hvis der ikke er nok poolede konditioneret medier, derefter bruge nogle af de lagrede konditioneret medier fra trin 1.4.</li>
	<li>Behandle neuroner med 100 µL/brønd af 4 µM løsningen af TTX fra trin 2.3. Sted mikrotiterplade i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 4 timer.</li>
	<li>Fastgør et sterilt glas Pasteur afpipetteres til en Sugeledningen og fastgør et sterilt 200 µL pipette ende på spidsen af en pipette. Fjerne medier fra hver godt omhyggeligt. Undgå at røre bunden af mikrotiterplade hvor neuroner er placeret.</li>
	<li>Tilføje 200 µL af stuetemperatur neuronal medier til hver brønd.</li>
	<li>Inkuber mikrotiterplade ved stuetemperatur, 15 min. inkubation i 5% CO2 er foretrukne, men ikke nødvendigt.</li>
</ol>3. Immunolabelling (i Laminar Flow Hood)
<ol><li>Forberede en 1:150 fortynding af anti-GluA1 eller anti-GluA2-antistof i neuronal medier.</li>
	<li>Fjerne neuronal medierne tilføjede i trin 2.6. Tilføje 50 µL af anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistof løsningerne til tilsvarende brønde i 20 min. ved stuetemperatur til at tillade antistof bindende. Tilføje 50 µL af neuronal medier til sekundær antistof eneste kontrolhullerne.</li>
	<li>Fjerne antistof løsninger tilføjede taktfast 3.2. Vask mikrotiterplade 3 gange med 100 µL/brønd stuetemperatur neuronal medier til at fjerne enhver ubundne antistoffer.</li>
	<li>Gøre en 50 mM stamopløsning af DHPG i neuronal medier eller celle kultur grade vand. Vortex løsning kort til fuldt opløses i DHPG. Forberede denne løsning frisk på den samme dag i eksperimentet. Undgå at bruge gamle eller optøede løsninger.</li>
	<li>Fortynd stamopløsning i neuronal medier til 1: 500 til at gøre en 100 µM løsning.</li>
	<li>Fjern den eksisterende medier fra hver brønd. Tilføj 100 µL/brønd af 100 µM DHPG stamopløsningen fra trin 3.5. Inkuber mikrotiterplade i varmeskab ved 37 ° C i 5% CO2 til 10 min.</li>
	<li>Fjern den DHPG løsning tilføjede taktfast 3.6 og tilsæt 100 µL/brønd neuronal medier. Gentag dette trin en gang mere. Sted mikrotiterplade i varmeskab ved 37 ° C i 5% CO2 i 5 min.</li>
	<li>Tilføje saccharose for at gøre 4% paraformaldehyde/4% rørsukkeropløsning i PBS på den samme dag i eksperimentet. Undgå at bruge gamle eller optøede løsninger. Fjerne medierne tilføjede taktfast 3.7. Tilsæt 100 µL/brønd af 4% paraformaldehyde/4% rørsukkeropløsning. Gentag trin 3.6-3,8 for hvert yderligere tidspunkt. Når du er færdig, Ruger mikrotiterplade ved 4 ° C i 20 min. Forsigtighed: Håndtere PARAFORMALDEHYD bestande i et stinkskab.</li>
	<li>Fjern fiksativ fra trin 3.8 og tilsæt 100 µL/brønd af kolde 1 x DPBS.</li>
	<li>Fjern DPBS. Tilføj 150 µL/brønd blokerende buffer (en klar-til-brug formulering i TBS, henvises til Tabel af materialer) og der inkuberes ved stuetemperatur i 90 min. Alternativt, inkuberes natten over ved 4 ° C.</li>
</ol>4. mærkning overflade receptorer
<ol><li>Forberede en 1:1500 fortynding af 680RD gede anti-mus IgG sekundær antistof i blokerende buffer.</li>
	<li>Fjern blokerende buffer fra trin 3.10. Tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof løsning og inkuberes ved stuetemperatur for 60 min. hold mikrotiterplade beskyttet mod lys, når de sekundære antistoffer er tilføjet. Sørg for at fortsætte med at beskytte mikrotiterplade fra lys under efterfølgende inkubationer.</li>
	<li>Fjerne løsningen fra trin 4.2. Tilsæt 100 µL/brønd TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) og inkuberes ved stuetemperatur for 5 min. Gentag dette trin 4 flere gange.</li>
	<li>Fjern TBS fra trin 4.3. Tilsæt 100 µL/brønd af 4% paraformaldehyde/4% saccharose i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.</li>
	<li>Fjerne løsningen fra trin 4.4. Tilsæt 100 µL/brønd TBS og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Gentag dette trin 2 flere gange.</li>
</ol>5. mærkning befolkningens internaliseret Receptor
<ol><li>Forberede TBS indeholdende 0,2% saponin. Vortex løsning kort til fuldt saponin pulveret opløses. Filtrer løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter til at fjerne eventuelle partikler, der kan forårsage auto-fluorescens.</li>
	<li>Tilsæt 150 µL TBS indeholdende 0,2% saponin og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.</li>
	<li>Fjern saponin løsning fra trin 5.2 og tilsæt 150 µL/brønd blokerende buffer. Inkuber ved stuetemperatur i 90 min.</li>
	<li>Forberede en 1:1500 fortynding af 800CW Donkey anti-mus IgG sekundær antistof i blokerende buffer.</li>
	<li>Fjern blokerende buffer fra trin 5.3 og tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 60 min.</li>
	<li>Tilsæt 100 µL/brønd TBS og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Gentag dette trin 4 flere gange.</li>
</ol>6. billedbehandling og analyse
<ol><li>Billede 96-brønd mikrotiterplade ved hjælp af en infrarød laser imaging system ifølge producentens anvisninger. Angiv scanningsopløsning til 84 µm, scanningskvaliteten til medium og fokus offset ifølge base højden på den 96-brønd mikrotiterplade anvendes. Klik på "Billede Studio" menu knappen → Eksporter → billede for digitale medier → Eksporter billeder med en opløsning på 300 dpi, i TIFF-format.</li>
	<li>Download billede Jørgensen "Fiji" på https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Åbn billede i billede J "Fiji". Split farvekanaler ved at klikke på menuen "Billede" → Split farvekanaler.</li>
	<li>Åbn ROI manager fra "Analysere" → "værktøjer". Afkrydsningsfeltet "etiketter" i ROI manager til at mærke cirklerne med tallene.</li>
	<li>I røde kanal (den 680 nm overflade receptor pool), Vælg Region af interesse (ROI) ved at vælge værktøjet cirkel og tegne en cirkel, der præcist passer til den første brønd. Tryk på Ctrl + T.</li>
	<li>Trække cirklen til næste godt og tryk på Ctrl + T. Repeat, indtil alle brønde er kredsede.</li>
	<li>Fra ROI manager, skal du klikke på "Foranstaltning". Vælg de værdier, der vises og kopiere dem til et regneark.</li>
	<li>Klik på den grønne kanal (den 800 nm interne receptor pool) og derefter omsætte de valgte ROIs fra trin 6.6 til billedet. Fra ROI manager, skal du klikke på "Foranstaltning". Vælg de værdier, der vises og kopiere dem til et regneark.</li>
	<li>Beregning af de gennemsnitlige integreret tæthedsværdier fra sekundært kun styre brønde. Fratræk de integrerede tæthedsværdier for hver eksperimentelle brønd fra gennemsnitlige sekundær kun integreret tæthed kontrolværdierne for overflade receptor pool. Gentag dette trin for interne receptor pool.</li>
	<li>Beregne ændringerne i overfladen receptor udtryk ved hjælp af Rs/rt, hvor Rs repræsenterer den integrerede tæthed af overflade receptorer og Rt repræsenterer den integrerede tæthed af overflade receptorer + integreret tætheden af interne receptorer.</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

AMPA-receptorer er en ionotropic glutamat receptor subtype, som er en integreret del af neuronal funktioner, som omfatter synapse dannelse, synapse stabilitet og synaptisk plasticitet. AMPA-receptoren forstyrrelser er knyttet til flere neurologiske24 og anses for attraktive drug mål40. For eksempel, har undersøgelser vist, at en af de tidligste tegn på Alzheimers sygdom (AD) er synapse tab og reduceret synaptic AMPA-receptoren niveauer41,42. Intriguingly, svækker tilsætning af Amyloid-ß oligomerer overfladen GluA1-holdige AMPA receptor udtryk på synapser43. Yderligere, status epilepticus ned-regulerer GluA2 mRNA og protein i hippocampus neuroner forud for deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-specifikke molekylære abnormitet, har været knyttet til ineffektive GluA2 Q/R site-RNA redigering45.
High-indhold AMPA-receptoren menneskehandel analysen giver et effektivt middel til at måle bulk ændringer i receptor menneskehandel profiler inden for et neuronal netværk som svar på forskellige faktorer, indtager meget mindre tid og materialer end alternative metoder. En enkelt 96-brønd mikrotiterplade giver mange brønde til at køre flere tekniske replikater og styrer for forskellige eksperimentelle betingelser i den samme plade. Lav plating tætheden af 2 x 104 celler/brønd i forhold til 5 x 105 celler/brønd tæthed reducerer antallet af dyr og materialeudgiften til hvert eksperiment (figur 1). Den infrarøde scanner kan billedet op til seks 96-brønd mikroplader ad gangen. Analysen kan også ændres til en 384-godt mikrotiterplade46, som bliver specielt værdifulde, hvis analysen er kørt på dyrebare prøver, der er vanskelige at opnå eller er dyre at kultur (fx menneskelige prøver og inducerede pluripotente stamceller). Hele analysen kan udfyldes og analyseret på samme dag, som sparer værdifuld tid (figur 1).
Nogle punkter skal anses for vellykket og effektiv gennemførelse af analysen. For det første er det vigtigt at forberede DHPG løsningen på den samme dag af neuron behandling. Undlad at genbruge eller fryse DHPG bestande. 4% paraformaldehyde/4% saccharose i PBS løsning bør også gøres frisk på den samme dag i eksperimentet. For det andet kontrolhullerne behandlet med TTX kun eller køretøjet er forpligtet til at sikre, at de observerede virkninger er bestemt til behandling. Det er også afgørende at omfatte wells behandlet med kun de sekundære antistoffer til kontrol for baggrunden fluorescens produceret af ikke-specifik binding. Bemærk, at det andet fiksering trin (følgende udvaskning af sekundære antistoffer) er nøglen til at reducere sekundær antistof baggrundseffekter og opnå effektiv mærkning af receptor underenheder.
Kompromiser og begrænsninger, som med enhver metode, der findes. Denne analyse giver ikke én celle (eller subcellulært) opløsning og giver ikke mulighed for real-time tracking af receptor handel ligesom andre metoder32,33,35. Derudover skal ordentlig pleje tages under trinnet permeabilization af neuroner, som denne metode vil være følsomme over for udsivning af intracellulære komponenter for overdreven permeabilization.

Omfang og tidsmæssige dynamics af neuronal ophidselse er stort set afhængig af tilgængelighed og sammensætningen af overflade receptor populationer, som transduce elektrokemiske signaler. Syntese af nye receptorer (eller receptor underenheder) er generelt en energisk dyre og forholdsvis langvarige proces, et væld af cellulære maskiner dedikeret til endo- og exocytose af eksisterende receptorer giver mulighed for deres hurtig indsættelse og fjernelse til og fra membran1. Derfor, ud over det transkriptionel og translationel regulering af receptorer, posttranslationelle receptor handel er et vigtigt modulator af neuronal ophidselse.
Synaptisk plasticitet, eller den ændrede styrke forbindelser mellem neuroner med erfaring, menes at danne grundlag for læring og hukommelse2,3. Styrkelse og svækkelse af synapser over tid, betegnes langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), henholdsvis, kan moduleres gennem handel med α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer 4 , 5. AMPA-receptorer er heterotetramers bestående af fire underenheder (GluA1-4), og mægle størstedelen af hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i hjernen6. Neuron ophidselse er således i vid udstrækning en funktion af mængden af AMPA-receptorer på den postsynaptiske overflade kan aktiveres af glutamat. LTD er ofte forbundet med en forhøjelse af AMPA-receptoren endocytose, hvorimod LTP er overvejende knyttet til en forøgelse af AMPA-receptoren exocytose. Postsynaptiske overflade udtryk af AMPA-receptorer kræver endosomal levering til exocytotic proteiner, hvor fusion med plasmamembran derefter forekommer i en calcium-afhængige måde7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. der findes også et væld af mekanismer, der regulerer aktivitet afhængig af AMPA-receptoren endocytose. Et eksempel herpå er via den umiddelbare tidlig gen Arc/Arg3.1 (Arc). Blandt andre funktioner15, Arc er kendt at mægle metabotropic glutamat receptor (mGluR)-afhængige LTD ved at fremme AMPA-receptoren endocytose gennem dets bindende partnere, som omfatter endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt Gruber20,21. Internaliseret AMPA-receptorer kan enten genbruges tilbage til plasma membran eller øremærket til nedbrydning22,23.
Vigtigere, bidrager subunit sammensætningen af AMPA-receptorer til deres menneskehandel dynamics24. Af stor betydning er de intracellulære C-terminal domæne underenheder, hvor fleste af posttranslationelle modifikationer og handel-relaterede protein interaktioner forekomme. GluA1 og GluA4 subunit-holdige AMPA-receptorer er særligt egnet til at være smugles til cellens overflade under LTP, delvis på grund af tilstedeværelsen af deres PDZ ligander, ~ 90 aminosyre-sekvenser, der fremmer membran forankring via interaktion med forskellige PDZ domæne-holdige proteiner25,26. På den anden side AMPA-receptorer indeholdende GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 har tendens til at være smugles constitutively men ophobes intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 subunits gennemgå RNA redigering, som, ud over at fremme fastholdelse i det endoplasmatiske reticulum28, gengiver kanal pore uigennemtrængelige for calcium29, yderligere implicere subunit-specifikke menneskehandel som en vigtig mediator af neuronal homøostase og plasticitet. Interessant, har afbrydelse af ubiquitin-afhængige Arc nedbrydning vist sig at øge GluA1 endocytose og øge den overflade udtryk af GluA2 subunit-holdige AMPA-receptorer efter induktion af mGluR-LTD med den selektive gruppe I mGluR agonist (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), der angiver, at stadig meget læres med hensyn til mekanismer og rolle subunit-specifikke AMPA-receptoren menneskehandel30.
Metoder til at observere ændringer i overflade udtryk af receptorer er ofte besværligt, tidskrævende, eller indføre unødvendige tilintetgør. Biotin-baserede assays er en pervasive og kommercielt tilgængelige tilgang. Affinitet rensning af biotinylated overflade receptorer repræsenterer et eksempel, men nødvendigheden af at udføre elektroforese kræver en stor mængde af prøvemateriale og kan gengive screening af flere behandlinger et uoverkommeligt lang processen31. Udvidelser af denne analyse, hvor flere tidspunkter af mærkning og immunoprecipitations udføres for at kvantificere den gradvise nedbrydning af et indledende signal, ligeledes forsømme tilføjelsen af nye — eller genanvendt-receptorer på cellen overflade og kun forværre tid og materielle krav.
Andre tilgange gøre brug af kimære konstruktioner eller tilsætning af fluorescerende tags at observere receptor menneskehandel32, sommetider ved hjælp af live cell imaging33,34. Mens potentielt magtfulde, kan disse designs påvirke de normale handel med mønstre af receptorer på grund af mutationer eller dramatiske ændringer i Molekylær vægt indført i disse proteiner. Brugen af farvestoffer at etiketten subcellulært rum ved at målrette lave pH34,35 er uspecifikke og skelne mellem forskellige intracellulære rum vigtig for receptor menneskehandel (e.g. lysosomer og proteasomes) vanskeligt. Endelig brugen af Konfokal mikroskopi til at visualisere colocalization receptorer med datamærker forbundet med handel og nedbrydning, såsom endosomal proteiner eller clathrin, samtidig potentielt nyttig indsigt i specifikke lokalisering med subcellulært opløsning, er tid, arbejdskrævende og dyrt på grund af nødvendigheden af individuelt analysere hver celle og kravet om Konfokal eller Super-resolution mikroskopi.
Her viser vi en høj-indhold receptor menneskehandel assay, der er kompatible med primære neuronal kultur præparater30. Denne metode etiketter separat overflade og intracellulære receptor puljer af faste neuroner, gør det muligt præsentation af data som et forhold af normaliserede overflade eller internaliseret receptor tæthed til den samlede massefylde for at receptor. High-indhold karakteren af denne metode er ideel til screening flere behandlinger og/eller genotyper i en kort tidsramme, og kræver kun standard celle dyrkning og antistof inkubation ekspertise.
Kort, primære neuroner er vokset i standard 96-brønd mikroplader og derefter behandlet da dikteres af eksperimentelle design, inkuberes med primære antistoffer, vasket og fast. Cellerne inkuberes derefter med en sekundær antistof at mærke overflade receptorer, efterfulgt af en anden fiksering trin. Permeabilization derefter opstår og en anden sekundær antistof bruges til at mærke interne receptor swimmingpools. Endelig er celler afbildet ved hjælp af en infrarød fluorescerende mikrotiterplade scanner til at kvantificere den integrerede befolkningstæthed hver receptor. Figur 1 opsummerer vores high-indhold analyse i forhold til en traditionel biotinylation assay.
Mens protokollen, der tilbydes her er optimeret og specifikke for AMPA-receptoren handel med primære hippocampus neuron kulturer, blive denne procedure kunne i teorien, udvidet og tilpasset forskellige receptorer i en lang række celletyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Postsynaptiske handel med receptorer til og fra cellens overflade er en vigtig mekanisme som neuroner modulere deres reaktionsevne på forskellige stimuli. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer, som er ansvarlig for hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i neuroner, der handles til og fra den postsynaptiske overflade til at ændre dynamisk neuronal ophidselse. AMPA receptor handel er essentiel for synaptisk plasticitet og kan afbrydes i neurologisk sygdom. Dog udbredt tilgange til kvantificering af receptor handel ignorere hele receptor puljer, er alt for tid - og arbejdskrævende, eller potentielt forstyrre normale handel mekanismer og således komplicere fortolkningen af resulterende data. Vi præsenterer en høj-indhold analyse til kvantificering af både overflade og indre AMPA-receptoren populationer i kulturperler primære hippocampus neuroner ved hjælp af dobbelt fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarødt fluorescerende 96-brønd mikrotiterplade scanner. Denne tilgang fremmer hurtig screening af bulk internaliseret og overflade receptor tætheder samtidig minimere prøvemateriale. Vores metode har imidlertid begrænsninger i at opnå én celle opløsning eller gennemføre levende celle billeddannelse. Endelig, denne protokol kan være modtagelig til andre receptorer og forskellige celletyper, forudsat at passende justeringer og optimering.

ARC/Arg3.1 accelererer AMPA-receptoren endocytose gennem interaktion med AP-2, endophilin-3 og dynamin-216,18 efter mGluR aktivering37. I Arc knock-i mus (ArcKR), er lysines 268 og 269 i Arc protein muteret til arginin, som forstyrrer Arc ubiquitination. Dette forringer proteasom-afhængige omsætning af Arc og forlænger dens halveringstid i neuroner21,30. I dette eksperiment, blev persistens af Arc i reguleringen af AMPA receptor handel undersøgt ved hjælp af high-indhold AMPA-receptoren menneskehandel assay. Neuroner blev behandlet med Na+ kanal blokker TTX, som hæmmer handling potentialer og reducerer Arc niveauer38, efterfulgt af DHPG, som inducerer Arc oversættelse og ubiquitination37,39. Både overflade og internaliseret puljer af GluA1 - (figur 2A) og GluA2-holdige (figur 3A) AMPA-receptoren underenheder blev målt ved 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. Denne særlige eksperiment anvendes tre tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. ArcKR neuroner viste øget GluA1 endocytose når behandlet med DHPG i forhold til WT neuroner, en effekt, der ikke blev set når neuroner blev behandlet med TTX kun (figur 2B). Overflade udtryk af GluA2 subunits øgedes betydeligt på kort tid point i forhold til WT neuroner (figur 3B), der angiver en potentiel subunit udskiftning30. Nogle brønde blev behandlet med sekundære antistoffer kun til kontrol for baggrunden fluorescens forårsaget af uspecifik bindende.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figur 1: sammenligning af AMPA-receptoren high-indhold menneskehandel analysen til receptor biotinylation assay. High-indhold menneskehandel assay forbruger mindre tid og ressourcer i forhold til standard biotinylation assayet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figur 2: overflade og indre populationer af GluA1 AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner. (A) overflade (sGluA1) og internaliseret (iGluA1) GluA1-holdige AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner ved 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. I forhold til WT, har ArcKR neuroner et yderligere fald i sGluA1-holdige AMPA-receptoren pool 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. (B) graf repræsenterer overflade fluorescens normaliseret samlede fluorescens-intensiteten. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, parrede og uparrede Student's t tests. p ≤ 0,05; n = 3 tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra mur, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figur 3: overflade og indre populationer af GluA2 AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner. (A) den samme eksperimentelle tilstand som figur 2. I forhold til WT, har ArcKR neuroner en stigning i sGluA2-holdige AMPA-receptoren pool 5 min efter DHPG nedtonet. (B) graf repræsenterer overflade fluorescens normaliseret samlede fluorescens-intensiteten. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA, parrede og uparrede Student's t tests. p ≤ 0,05; n = 3 tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra mur, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Neuronal ophidselse kan moduleres gennem en dynamisk proces af endo- og exocytose excitatoriske ionotropic glutamat receptorer. Beskrevet her er en tilgængelig, high-indhold analyse til kvantificering overflade og indre receptor deltagergrupper.

En høj-indhold analysen til overvågning af AMPA Receptor handel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Her viser vi et højt indhold receptor handel assay, der er kompatibel med primær neuronal kultur forberedelse. Denne metode separat etiketter overfladen en inter kælder receptor puljer af faste neuroner. Aktivering af data som et forhold mellem normaliseret overflade eller internaliseret receptortæthed til den samlede tæthed af denne receptor.Det høje indhold og receptor handel assay giver en gennemført midler til at måle bulk ændringer i receptorer handel profiler inden for en neurale netværk som reaktion på forskellige faktorer. Forbrugende meget mindre tid og materialer end alternative metoder. Forstyrrelser og i preceptors menneskehandel har været forbundet med flere neurologiske lidelser, og betragtes som et attraktivt mål for medicinsk behandling.For eksempler undersøgelser har vist en af de tidligste tegn på Alzheimers sygdom er synaptisk tab og formindsket synaptiske og preceptor puljer. Denne teknik kræver mange forskellige trin af varierende sværhedsgrad. Især fordi håndtering af 96 brøndpladen og manipulere brøndene kan vise sig vanskeligt for nogen uden erfaring.Og da resultaterne af eksperimentet er meget følsomme over for forkert håndtering, er det nyttigt at se de forskellige trin, der udføres. Instruktør Til at begynde, fodre neuroner i 96 godt plade ved at fjerne 100 mikroliter af de allerede eksisterende medier fra hver brønd. Og erstatte det med 100 mikroliter af medier pre-opvarmet til 37 grader Celsius.Hver tredje til fjerde dag. En dag in vitro 14, skal du bruge en multi-pipet til at fjerne 100 mikroliter af medier fra hver brønd og samle medierne. Tilføj to mikroliter TTX Stock-opløsning til en milliliter af det samlede betingede medie for at skabe en fire mikromolaropløsning af TTX.Behandl neuronerne i hver brønd med 100 mikroliter af fire mikromolar TTX-opløsning. Hvis der ikke er nok pooled condition medier tilføje nogle af de tidligere gemte medier. Inkuberes i en 5% CO2 inkubator ved 37 grader Celsius i fire timer.Efter dette fjerne de eksisterende TTX indeholder medier og tilsæt 200 mikroliter af præ-opvarmede neuronale medier, og inkubere mikropladen ved stuetemperatur i femten minutter. Først fjerne neuronal medier fra mikro plade. Der tilsættes halvtreds mikroliter af anti gluA1- eller anti gluA2-antistofopløsningen til mikropladens tilsvarende brønde.Tilføj halvtreds mikroliter af neuronale medier til det sekundære antistof kun kontrol brønde. Inkuber ved stuetemperatur i tyve minutter for at give mulighed for antistofbinding. Efter dette fjerne de eksisterende medier fra brønde.Vask mikropladen tre gange med 100 mikroliter af rumtemperatur neuronal medier pr godt at fjerne eventuelle ubundne antistoffer. Derefter tilsættes 100 mikroliter 100 mikromolar DHPG lagerløsning til hver brønd. Inkuberes i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius i ti minutter.Næste fjerne DHPG løsning og tilføje 100 mikroliter af neuronale medier til hver brønd. Gentag denne proces en anden gang. Derefter inkuberes i 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter.På forsøgsdagen forberedes en opløsning på 4% paraformaldehyd og 4% saccharose NPBS. Fjern mediet fra hver brønd og erstatte det med 100 mikroliter af paraformaldehyd og saccharose opløsning. Gentag denne proces for hvert tilføjelsestidspunkt.Inkuber mikropladen ved 4 grader Celsius i tyve minutter. Fjern derefter fiksativet og tilsæt 100 mikroliter af DPBS til hver brønd. Fjern DPBS og tilsæt 150 mikroliter af blokerende buffer til hver brønd.Inkuberes ved stuetemperatur i 90 minutter. Fjern blokeringsbufferen, og tilsæt 50 mikroliter af den sekundære antistofopløsning til hver brønd. Inkuberes ved stuetemperatur i 60 minutter, mens pladen beskyttes mod lys.Fjern antistofopløsningen, og tilsæt 100 mikroliter TBS til hver brønd. Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Gentag denne proces, fjerne medierne fra brøndene tilføje TBS, og inkubere ved stuetemperatur fire ekstra gange.Derefter fjernes TBS fra mikropladen. Der tilsættes 100 mikroliter af en opløsning på 4% paraformaldehyd og 4% saccharose i PBS til hver brønd. Inkubere ved stuetemperatur i femten minutter.Fjern paraformaldehyd opløsning og tilsæt 100 mikroliter TBS i hver brønd, og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter. Gentag dette trin to ekstra gange. Først forberede en opløsning af TBS indeholdende 2% saponin og vortex opløsningen kort til fuldt ud at opløse saponin pulver.Ved hjælp af et 2 mikrometerfilter skal du filtrere opløsningen for at fjerne eventuelle partikler, der kan forårsage automatisk vandstof. Tilsæt 150 mikroliter af denne 2% saponin opløsning til hver brønd, og inkubere ved stuetemperatur i femten minutter. Fjern derefter saponin opløsningen, og tilsæt 150 mikroliter af blokerende buffer til hver brønd.Inkuberes ved stuetemperatur i 90 minutter. Efter dette fjerne blokering buffer og tilsæt halvtreds mikroliter af den sekundære antistofopløsning til hver brønd. Inkubere ved stuetemperatur i 60 minutter.Derefter tilsættes 100 mikroliter TBS til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Gentag denne proces tilføje TBS og inkubere ved stuetemperatur fire ekstra gange. Ved hjælp af en infrarød laser billedbehandling system billede 96 godt mikro plade i henhold til producenternes anvisninger.Indstil scanningsopløsningen til 84 mikrometer. Scanningskvaliteten til medium og fokusforskydningen i henhold til basishøjden på den 96 brøndmikroplade, der anvendes. Klik på knappen Image Studio, eksporter billede til digitale medier, og eksportér billederne med en opløsning på 300 dpi i TIFF-format.Åbn billedet i ImageJ Fiji. Opdel farvekanalerne ved at klikke på billedmenuen og derefter farve, opdele kanaler. Åbn derefter roi-chefen fra analyseværktøjer.Markér afkrydsningsfeltet for etiketter i roi-chefen for at klassificere cirklerne med tal. I den 6 80 eller den røde kanal skal du vælge interesseområdet ved at vælge cirkelværktøjet og tegne en cirkel, der passer nøjagtigt til den første brønd. Tryk derefter på Ctrl plus T, og træk derefter cirklen til den næste brønd.Gentag denne proces, indtil alle brønde er omgivet. Klik på mål for investeringsafkastleder fra roi-lederen. Marker de værdier, der vises, og kopiér dem til et opslagsark.Klik derefter på den grønne kanal, og transponer de valgte ROI'er til billedet. Klik på mål for investeringsafkastleder fra roi-lederen. Marker de værdier, der vises, og kopiér dem til et opslagsark.Derefter beregnes ændringerne af overfladereceptorudtrykket som beskrevet i tekstprotokollen. I denne procedure undersøges buens persistens i reguleringen af ampareceptorhandel ved hjælp af ampareceptorhandel og -analyse med højt indhold. Neuroner behandles med natrium-ion kanal blocker TTX som hæmmer handling potentialer og reducerer bue niveauer.Efterfulgt af DHPG, som inducerer bue oversættelse og allestedsnærværende. Både overflade og internalisere puljer af gluA1 og gluA2 indeholdende apa receptor underenheder blev målt på fem og femten minutter efter DHPG udvaskning. ArcKR neuroner viser øget gluA1 endositosis, når de behandles med DHPG, sammenlignet med mens type neuroner.Denne effekt ses ikke, når neuroner kun behandles med TTX. Overfladeudtryk af gluA2-underenheden øges betydeligt på korte tidspunkter sammenlignet med wile type neuroner. Angivelse af en potentiel udskiftning af underenheden.Sørg for, at cellerne er illikvide faste paraformaldehyd, skal tilberedes frisk på forsøgsdagen. Cellerne skal refastsendes efter mærkning af overfladereceptorerne. Andre metoder såsom konfokal mikroskopi vil være i stand til at give enkelt celleopløsning til yderligere at karakterisere relaterede ændret i neuronal struktur og receptor lokalisering.Forstyrre den tidsmæssige dynamik bue ændrer ampa receptorer handel som reaktion på MgluR medieret LTD. Fremtidige retninger vil være at måle ampa receptorer handel som reaktion på andre stimuli. Denne analyse måske tilpasses til andre celletyper, behandlinger og receptorer, forudsat at proceduren er omhyggeligt justeret og behørigt valideret.Der skal sørges for, at celletætheder, behandlingstider, fikseringer skridt, permeabilization skridt, og reagens valg er optimeret dit system af interesse. For en vellykket og effektiv færdiggørelse af analysen er det vigtigt at forberede DHPG-løsningen og 4% paraformaldehyd, 4% saccharose opløsning på dagen for forsøget. Kontrol godt behandlet med vakeel eller TTX er nødvendige for at sikre, at de observerede virkninger er specifikke for behandlingen.Det er også afgørende at medtage brønde behandlet med kun de sekundære antistoffer til at kontrollere for baggrundfluorescens produceret af ikke-specifik binding.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Ved hjælp af en α-Bungarotoxin-bindingssted Tag til Study GABAA receptor membranlokalisering og handel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Et højt indhold Imaging Assay til identifikation af botulinumneurotoksin inhibitorer

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling af lugtstof Receptor aktivering ved hjælp af en Real-time lejr Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levende billeder af GLUT4 Protein handel med musen primære hypothalamus neuroner ved hjælp af Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

En simpel cellebaserede immunofluorescens Assay at opdage autoantistof mod N-Methyl-D-aspartat (NMDA) Receptor i blod

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder til opdagelsen af nye forbindelser modulerende en Gamma - aminosmørsyre Receptor Skriv en Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Real-time i Vitro overvågning af lugtstof Receptor aktivering af en lugtstof i fasen for damp

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...