Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Nous remercions Zachary Allen pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par la fondation de Whitehall (Grant 2017-05-35) et Cléon C. Arrington recherche Initiation programme de subventions (RIG-93) pour M.A.G. a.m.M. et D.W.Y. tous deux appuyés par une bourse de 2CI Georgia State University Neurogénomique.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Georgia State University.
1. préparation des neurones de l’hippocampe primaires (dans une hotte à flux laminaire)
<ol><li>Isoler les neurones de l’hippocampe primaires de jour après la naissance de sexe mixte (P) 0-1 souris décrite précédemment36.</li>
	<li>Neurones de la plaque à 96 puits poly-D-lysine enduite microplaques à une densité de 2 x 104 cellules par puits.</li>
	<li>Préparer les médias pour nourrir les neurones en ajoutant 10 mL de 50 x B-27, 5 mL de 100 x Glutamine, 242 µL de 10 mg/mL 5-Fluoro-2′-désoxyuridine (FUDR) et 10 µL de 10 mg/mL de gentamycine à 485 mL de médias neuronale (voir Table des matières).</li>
	<li>Alimentation des neurones comme décrit précédemment36 en supprimant la moitié (100 µL) de la préexistants médias (dénommé milieux conditionnés, qui contient des composants qui prennent en charge la survie neuronale) dans chaque puits et la remplaçant par 100 µL de 37 ° C préchauffé médias préparé à l’étape 1.3 tous les 3-4 jours. Stocker les milieux conditionnés de chaque tétée à 4 ° c pour l’étape 2.3.</li>
</ol>2. mesure du récepteur AMPA traite en réponse à la DHPG (dans une hotte à flux laminaire)
<ol><li>À jour In Vitro (DIV) 14, préparer une solution 500 µL de la tétrodotoxine (TTX) à une concentration de 2 mM à l’aide de culture cellulaire, l’eau de qualité. Mise en garde : TTX est une neurotoxine. Manipuler avec précaution et évitez tout contact avec la peau.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette multicanaux, enlever 100 µL de chaque puits de la microplaque 96 puits de neurones et mettre en commun les médias.</li>
	<li>Ajouter 2 µL de la solution mère de TTX à 1 mL de la mise en commun milieux conditionnés de l’étape 2.2 pour créer une solution de 4 µM de TTX. S’il n’y a pas assez de mise en commun des milieux conditionnés, puis utiliser une partie du média conditionné stocké par étape 1.4.</li>
	<li>Traiter les neurones avec 100 µL/puits de la solution de 4 µM de TTX étape 2.3. Placer la microplaque dans un incubateur à CO 5 %2 à 37 ° C pendant 4 h.</li>
	<li>Attacher un verre stérile Pasteur pipeter à un tuyau d’aspiration et attachez une extrémité de pipette stérile 200 µL à l’extrémité de la pipette. Retirez le support de chaque bien soigneusement. Évitez de toucher le fond de la microplaque où se trouvent les neurones.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de température ambiante médias neuronale dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber la microplaque à température ambiante pendant 15 minutes d’Incubation à 5 % de CO2 est préférable mais pas nécessaire.</li>
</ol>3. l’immunomarquage (dans une hotte à flux laminaire)
<ol><li>Préparer une dilution de 1 : 150 de l’anticorps anti-GluA1 ou anti-GluA2 dans les médias neuronales.</li>
	<li>Retirez le support neuronal ajouté à l’étape 2.6. Ajouter 50 µL des solutions d’anticorps anti-GluA1 ou anti-GluA2 aux puits correspondants pendant 20 min à température ambiante pour permettre la liaison de l’anticorps. Ajouter 50 µL de médias neuronale dans les puits de contrôle seul anticorps secondaire.</li>
	<li>Supprimer les solutions d’anticorps a ajouté à l’étape 3.2. Laver la microplaque 3 fois avec 100 µL/puits température de la pièce neuronale médias pour enlever n’importe quel anticorps non fixés.</li>
	<li>Préparer une solution stock de 50 mM de DHPG dans médias neuronale ou eau de qualité de culture cellulaire. Vortex la solution brièvement pour dissoudre complètement la DHPG. Préparer cette solution fraîche le jour même de l’expérience. Évitez d’utiliser des solutions anciennes ou décongelées.</li>
	<li>Diluer la solution mère dans des médias neuronales à 1/500 à préparer une solution à 100 µM.</li>
	<li>Retirez le support existant dans chaque puits. Ajouter 100 µL/puits de la solution mère de 100µm DHPG d’étape 3,5. Incuber la microplaque dans l’incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 10 min.</li>
	<li>Enlever la solution de la DHPG ajoutée à l’étape 3.6 et ajouter 100 µL/puits neuronales médias. Répétez cette étape une fois de plus. Placer la microplaque dans l’incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter le saccharose pour rendre la solution de saccharose de paraformaldehyde/4% de 4 % dans du PBS le jour même de l’expérience. Évitez d’utiliser des solutions anciennes ou décongelées. Retirez le support ajouté à l’étape de 3,7. Ajouter 100 µL/puits d’une solution de saccharose paraformaldehyde/4% 4 %. Répétez les étapes 3,6 à 3,8 pour chaque point de temps supplémentaire. Une fois terminé, incuber la microplaque à 4 ° C pendant 20 min. Mise en garde : Gérer les stocks de paraformaldéhyde sous une hotte.</li>
	<li>Retirer le fixateur du étape 3,8 et ajouter 100 µL/puits de froid 1 x DPBS.</li>
	<li>Retirez le SPD. Ajouter 150 µL/puits bloquant un tampon (une formulation prête à l’emploi au SCT, reportez-vous à la Table des matières) et incuber à température ambiante pendant 90 min. alternativement, incuber une nuit à 4 ° C.</li>
</ol>4. étiquetage des récepteurs de Surface
<ol><li>Préparer une dilution de 1:1500 de 680RD Goat anti-Mouse IgG anticorps secondaire dans un tampon bloquant.</li>
	<li>Retirer un tampon de blocage de l’étape 3.10. Ajouter 50 µL/puits de la solution d’anticorps secondaire et incuber à température ambiante pendant 60 min. Gardez la microplaque à l’abri de la lumière une fois que les anticorps secondaires sont ajoutés. Assurez-vous de continuer à protéger la microplaque de lumière durant des incubations subséquentes.</li>
	<li>Enlever la solution de l’étape 4.2. Ajouter 100 µL/puits du SCT (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) et incuber à température ambiante pendant 5 min. Répétez cette étape 4 fois supplémentaires.</li>
	<li>Enlever du SCT de l’étape 4.3. Ajouter 100 µL/puits de 4 % paraformaldehyde/4% saccharose dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Retirez la solution de l’étape 4.4. Ajouter 100 µL/puits du SCT et incuber à température ambiante pendant 5 min. répéter cette étape 2 fois supplémentaires.</li>
</ol>5. la Population de récepteurs intériorisé l’étiquetage
<ol><li>Préparer le SCT contenant 0,2 % de saponine. Vortex la solution brièvement pour bien dissoudre la poudre de saponine. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 µm pour éliminer les particules qui pourraient provoquer des auto-fluorescence.</li>
	<li>Ajouter 150 µL du SCT contenant des saponines de 0,2 % et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
	<li>Enlever la solution de saponine de l’étape 5.2 et ajouter 150 µL/puits tampon de blocage. Incuber à température ambiante pendant 90 min.</li>
	<li>Préparer une dilution de 1:1500 de 800CW âne anti-souris IgG anticorps secondaire dans un tampon bloquant.</li>
	<li>Retirer le tampon de blocage de l’étape 5.3 et ajouter 50 µL/puits de la solution d’anticorps secondaire. Incuber à température ambiante pendant 60 min.</li>
	<li>Ajouter 100 µL/puits du SCT et incuber à température ambiante pendant 5 min. répéter cette étape 4 fois supplémentaires.</li>
</ol>6. imagerie et analyse
<ol><li>Image de la microplaque 96 puits à l’aide d’un laser infrarouge d’imagerie système conformément aux instructions du fabricant. Réglez la résolution de numérisation sur 84 µm, la qualité de la numérisation au milieu et à la mise au point compensée selon la hauteur de base de la microplaque 96 puits utilisée. Cliquez sur le bouton de menu « Studio Image » → exporter → Image pour médias numériques → Export images à une résolution de 300 dpi, au format TIFF.</li>
	<li>Télécharger Image J « Fidji » à https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Ouvrir une image dans l’Image J « Fidji ». Séparer les couches de couleur en cliquant sur le menu « Image » Couches de couleur → Split.</li>
	<li>Ouvrez le gestionnaire de ROI de « Analyser » → « outils ». Cochez la case « étiquettes » dans le gestionnaire de ROI d’étiqueter les cercles avec des nombres.</li>
	<li>Dans le rouge (le pool de récepteur de surface 680 nm) de canal, sélectionnez la région d’intérêt (ROI) en sélectionnant l’outil cercle et en dessinant un cercle qui correspond précisément au premier puits. Appuyez sur Ctrl + T.</li>
	<li>Faites glisser le cercle à l’autre bien et appuyez sur Ctrl + T. répéter jusqu'à ce que tous les puits sont encerclés.</li>
	<li>Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Mesure ». Sélectionner les valeurs qui s’affichent et les copier dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Cliquez sur la couche verte (le pool de récepteur interne 800 nm) et ensuite transposer la ROIs sélectionnée à l’étape de 6,6 à l’image. Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Mesure ». Sélectionner les valeurs qui s’affichent et les copier dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Calculer que les valeurs moyenne densité intégrée de l’enseignement secondaire uniquement contrôlent les puits. Soustraire les valeurs de densité intégrée pour chaque puits expérimental de secondaire seul contrôle intégré densité moyennes pour le pool de récepteur de surface. Répétez cette étape pour le pool de récepteur interne.</li>
	<li>Calculer les changements dans l’expression des récepteurs de surface à l’aide de Rs/rt, où Rs représente la densité intégrée des récepteurs de surface et Rt représente la densité intégrée des récepteurs de surface + densité intégrée de récepteurs internes.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les récepteurs AMPA sont un sous-type de récepteur de glutamate ionotropiques qui fait partie intégrante des fonctions neuronales qui comprennent la formation des synapses, la stabilité de la synapse et la plasticité synaptique. Perturbation des récepteurs AMPA est liée à plusieurs troubles neurologiques24 et sont considérés comme des cibles de drogue attrayante40. Par exemple, des études ont montré que l’un des premiers signes de la maladie d’Alzheimer (ma) est la perte de la synapse et réduit synaptique AMPA receptor niveaux41,,42. Curieusement, ajout d’oligomères de ß-amyloïde altère surface expression des récepteurs AMPA contenant du GluA1 à synapses43. En outre, état de mal épileptique bas-régule GluA2 ARNm et protéines dans les neurones de l’hippocampe précédant leur mort44. Dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA), pathologie de TAR DNA-binding protein (TDP-43), une anomalie moléculaire spécifique ALS, a été lié à inefficace GluA2 Q/R site-ARN édition45.
L’analyse traite de récepteurs AMPA haute teneur constitue un moyen efficace pour mesurer les modifications en bloc dans les profils de trafic du récepteur au sein d’un réseau neuronal en réponse à divers facteurs, consommant beaucoup moins de temps et des matériaux que des méthodes alternatives. Une microplaque 96 puits unique fournit de nombreux puits pour exécuter plusieurs techniques réplique et des contrôles pour des conditions expérimentales différentes dans la même assiette. La densité faible bordé de 2 x 104 cellules/puits par rapport à la densité de cellules/puits de 5 x 105 réduit considérablement le nombre d’animaux et de matériel requis pour chaque expérience (Figure 1). Le scanner infrarouge peut à la fois l’image jusqu'à six microplaque 96 puits. Le dosage peut également être modifié pour une microplaque 384 puits46, qui devient particulièrement utile si l’essai est exécuté sur des échantillons précieux qui sont difficiles à obtenir ou qui sont chers à la culture (p. ex. des échantillons et les cellules souches pluripotentes induites). Le test complet peut être rempli et analysé le jour même, ce qui permet d’économiser un temps précieux (Figure 1).
Achèvement réussi et efficace de l’essai, certains points doivent être considérés. Tout d’abord, il est important de préparer la solution de la DHPG le jour même du traitement de neurone. Ne pas réutiliser ou geler les stocks DHPG. Le saccharose de paraformaldehyde/4% de 4 % dans une solution de PBS convient également frais le jour même de l’expérience. Deuxièmement, puits témoins traitement avec TTX uniquement, ou le véhicule sont tenus de veiller à ce que les effets observés sont spécifiques au traitement. Il est également important d’inclure les puits traités avec seulement l’anticorps secondaires au contrôle pour la fluorescence de fond produit par non-spécifiques. Notez que la deuxième étape de fixation (suivant affouillement des anticorps secondaires) est la clé pour réduire les effets de fond anticorps secondaire et réaliser un étiquetage efficace des sous-unités du récepteur.
Compromis et limitations, comme avec n’importe quelle méthode, existent. Ce test ne fournit pas de résolution unicellulaire (ou subcellulaire) et ne permet pas de suivi en temps réel du récepteur trafic comme autres méthodes32,33,35. En outre, bon il faut pendant l’étape de la perméabilisation de neurones, car cette méthode sera sensible à la fuite des composants intracellulaires dans le cas de la perméabilisation excessive.

L’ampleur et la dynamique temporelle de l’excitabilité neuronale est largement tributaire de la disponibilité et la composition de la population de récepteurs superficiels qui transduce signaux électrochimiques. Alors que la synthèse de nouveaux récepteurs (ou sous-unités du récepteur) est généralement un processus cher en énergie et relativement prolongé, une foule de machinerie cellulaire dédié à l’endo - et exocytose des récepteurs existants de fournir un moyen pour leur insertion rapide et l’enlèvement d’et vers la membrane1. En plus de la transcription et translationnelle régulation négative des récepteurs, récepteurs post-traductionnelle traite est donc un important modulateur de l’excitabilité neuronale.
La plasticité synaptique, ou la force changeante de connexions entre les neurones avec expérience, est censée constituer la base de l’apprentissage et la mémoire2,3. Le renforcement et l’affaiblissement des synapses au fil du temps, appelés potentialisation à long terme (LTP) et dépression à long terme (DLT), respectivement, peuvent être modulées par le trafic des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 4 , 5. récepteurs AMPA sont heterotetramers composé de quatre sous-unités (GluA1-4) et agir comme médiateur de la majorité de la transmission synaptique excitatrice rapide dans le cerveau de6. Ainsi, excitabilité du neurone est en grande partie fonction de la quantité de récepteurs d’AMPA à la surface postsynaptique disponible pour être activés par le glutamate. LTD est souvent associée à une augmentation dans l’endocytose de récepteurs AMPA, tandis que LTP est principalement associée à une augmentation de l’exocytose du récepteur AMPA. Postsynaptique expression en surface des récepteurs AMPA nécessite endosomale livraison aux protéines exocytotique, où la fusion avec la membrane plasmique puis se produit dans une manière dépendante du calcium7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. il existe également une multitude de mécanismes qui régulent l’endocytose de récepteurs AMPA activité dépendante. Un exemple de ceci se fait par le gène précoce immédiat Arc/Arg3.1 (Arc). Parmi les autres fonctions15, Arc est connu à la médiation metabotropic récepteurs de glutamate (mGluR)-dépendante LTD en promouvant l’endocytose du récepteur AMPA grâce à ses partenaires de liaison, qui incluent l’endocytose protéines AP-2 et endophiline-3 dynamine-2 16 , 17 , 18 , 19, à enrobées de clathrine fosses20,21. Des récepteurs AMPA intériorisées peuvent soit être recyclés vers la membrane plasmique ou encore affectés à dégradation22,23.
Ce qui est important, la composition des sous-unités des récepteurs AMPA contribue à leur trafic dynamique24. Intérêt majeur est le domaine de C-terminale intracellulaire des sous-unités, où la majorité des modifications post-traductionnelles et interactions entre les protéines liées à la traite se produire. GluA1 et GluA4 contenant des sous-unités des récepteurs AMPA sont particulièrement susceptibles aux victimes de la traite à la surface de la cellule au cours de LTP, en partie due à la présence de leurs ligands PDZ, ~ 90 des séquences d’acides aminés qui favorisent la membrane ancrage via des interactions avec divers PDZ domaine contenant protéines25,26. En revanche, des récepteurs AMPA contenant GluA2 et manquant de GluA1 ou GluA4 ont tendance à être victimes de traite constitutivement mais s’accumulent dans les cellules avec l’activité synaptique27. GluA2 sous-unités subissent RNA édition qui, en plus de favoriser le maintien dans le réticulum endoplasmique28, rend le pore du canal imperméable au calcium29, impliquant davantage sous-unité spécifique traite comme un médiateur clé des neurones l’homéostasie et la plasticité. Fait intéressant, perturbation de dégradation ubiquitine dépendante de l’Arc s’est avérée augmenter l’endocytose de GluA1 et l’expression en surface des GluA2 contenant des sous-unités des récepteurs AMPA après induction de mGluR-LTD avec le sélectif agoniste de mGluR du groupe I (S) - 3, 5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), ce qui indique qu’il reste beaucoup à apprendre sur les mécanismes et le rôle de la sous-unité spécifique AMPA récepteur trafic30.
Méthodes pour l’observation des changements dans l’expression des récepteurs à la surface sont souvent lourde et longue, ou d’introduire des inutiles confond. Biotine analyses sont une approche généralisée et disponible dans le commerce. Purification d’affinité des récepteurs de surface biotinylé représente un bon exemple, mais la nécessité d’exécuter l’électrophorèse nécessite une grande quantité d’échantillons et peut rendre l’examen préalable des traitements multiples une trop longue processus de31. Les extensions de ce test, où plusieurs points dans le temps de l’étiquetage et l’immunoprécipitation sont effectuées pour quantifier la dégradation progressive d’un signal initial, de même négligent l’ajout de nouveaux — ou recyclés — exacerbent les récepteurs de la cellule de surface et seulement le temps et les matériaux requis.
Autres approches font usage de constructions chimériques ou l’ajout de balises fluorescentes pour observer le récepteur trafic32, parfois à l’aide de direct cellulaire d’imagerie33,,34. Alors que potentiellement puissant, ces dessins peuvent affecter la structure de trafic normale des récepteurs causés par des mutations ou des changements spectaculaires dans le poids moléculaire introduit dans ces protéines. L’utilisation de colorants que les compartiments subcellulaires étiquette en ciblant un pH faible34,35 sont non spécifiques et faire la distinction entre les différents compartiments intracellulaires importants pour récepteur trafic (par exemple. lysosomes et protéasomes) difficile. Enfin, l’utilisation de la microscopie confocale à visualiser la co-localisation des récepteurs avec marqueurs liés à la traite et de la dégradation, comme les protéines d’endosomale ou clathrine, tout en fournissant éventuellement des observations utiles sur la localisation spécifique avec résolution subcellulaire, sont temps, fastidieuse et coûteuse en raison de la nécessité d’analyser individuellement chaque cellule et l’exigence de confocale ou microscopie super-résolution.
Ici, nous démontrons un essai de trafic haute teneur du récepteur qui est compatible avec les cultures primaires de neurones préparations30. Cette méthode étiquettes séparément les bassins récepteurs intracellulaires et surface des neurones fixes, ce qui permet la présentation des données comme un ratio de surface normalisée ou la densité des récepteurs intériorisée à la densité globale pour ce récepteur. La nature de la forte teneur de cette méthode est idéale pour contrôler de multiples traitements et/ou des génotypes dans un court laps de temps et nécessite une expertise de cellule standard uniquement cultivant et anticorps d’incubation.
Brièvement, neurones primaires sont cultivés en standard microplaque 96 puits et puis traitées dans les limites de conception expérimentale, incubées avec l’anticorps primaires, lavés et fixe. Les cellules sont ensuite incubées avec un anticorps secondaire d’étiqueter des récepteurs de surface, suivies d’une autre étape de fixation. Perméabilisation puis se produit et un second anticorps secondaire est utilisé pour étiqueter des bassins récepteurs internes. Enfin, les cellules sont imagés à l’aide d’un scanner infrarouge microplaque fluorescent pour quantifier la densité intégrée de chaque population de récepteurs. La figure 1 résume notre essai de la forte teneur en comparaison avec un dosage biotinylation traditionnels.
Tandis que le protocole proposé ici est spécifique pour les récepteurs AMPA traite des cultures primaires de neurones hippocampiques et optimisée, cette procédure pourrait, en théorie, être étendue et adaptée aux différents récepteurs dans une variété de types de cellules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Le trafic des récepteurs vers et depuis la surface de la cellule postsynaptique est un mécanisme important par lequel les neurones modulent leur réactivité aux stimuli différents. Les récepteurs (AMPA) acides α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic, qui sont responsables de la transmission synaptique excitatrice rapide dans les neurones, sont victimes de trafic vers et à partir de la surface postsynaptique de modifier dynamiquement l’excitabilité neuronale. Traite des récepteurs AMPA est essentielle pour la plasticité synaptique et peut être perturbée dans la maladie neurologique. Cependant, approches courantes pour quantifier le récepteur trafic ignorent piscines tout récepteur, sont trop de temps - et beaucoup de travail, ou potentiellement perturber les mécanismes normaux de trafic et donc compliquer l’interprétation des données obtenues. Nous présentons une analyse de haute teneur pour la quantification des populations de récepteurs AMPA surfaces tant internes en culture primaires neurones de l’hippocampe à l’aide de double immunomarquage fluorescent et un scanner infrarouge fluorescent microplaque 96 puits. Cette approche facilite la projection rapide de produits en vrac intériorisé et densités de récepteurs de surface tout en minimisant le matériau de l’échantillon. Cependant, notre méthode a des limites pour obtenir la résolution unicellulaire ou effectuer l’imagerie de cellules vivantes. Enfin, ce protocole peut être se prêtent à d’autres récepteurs et les différents types de cellules, fournis l’optimisation et les ajustements appropriés.

Arc/Arg3.1 accélère endocytosis récepteur AMPA via l’interaction avec l’AP-2, 3-endophiline et dynamine-216,18 suite mGluR activation37. Dans l’Arc souris knock-in (ArcKR), les lysines 268 et 269 dans la protéine de l’Arc sont mutés à l’arginine, qui interfère avec l’Arc ubiquitination. Cela altère le chiffre d’affaires de protéasome dépendante d’Arc et prolonge sa demi-vie dans les neurones21,30. Dans cette expérience, la persistance de l’Arc dans la régulation du trafic des récepteurs AMPA a été étudiée en utilisant l’analyse de trafic des récepteur AMPA de haute teneur. Les neurones ont été traités avec le bloqueur des canaux Na+ TTX, qui inhibe les potentiels d’action et réduit l’Arc niveau38, suivie de la DHPG, qui induit une traduction de l’Arc et l’ubiquitination37,,39. Surface et intériorisées piscines de GluA1 - (Figure 2 a) et sous-unités de récepteurs AMPA contenant du GluA2 (Figure 3 a) ont été mesurées à 5 et 15 min après le lavage de la DHPG. Cette expérience particulière utilisée trois répétitions techniques de 3 expériences indépendantes. ArcKR neurones ont montré une augmentation GluA1 endocytose lorsque traités avec DHPG comparée aux neurones WT, un effet qui n’était pas considéré lorsque les neurones étaient traités avec TTX uniquement (Figure 2 b). Expression à la surface des sous-unités GluA2 augmente significativement aux points de peu de temps par rapport aux neurones WT (Figure 3 b), ce qui indique un potentiel de remplacement de sous-unité30. Certains puits ont été traitées avec des anticorps secondaires uniquement au contrôle pour la fluorescence de fond provoquée par la liaison non spécifique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figure 1 : comparaison du test traite AMPA récepteur haute teneur à l’analyse de biotinylation des récepteurs. L’analyse de trafic de haute teneur consomme moins de temps et ressources par rapport à l’essai biotinylation standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figure 2 : populations internes et Surface de sous-unités du récepteur AMPA GluA1 dans des neurones hippocampal WT et ArcKR. Surface (A) (sGluA1) et des sous-unités de récepteurs AMPA contenant GluA1 intériorisé (iGluA1) dans les neurones de l’hippocampe WT et ArcKR à 5 et 15 min après le lavage de la DHPG. Par rapport au WT, ArcKR neurones ont une baisse dans le récepteur AMPA contenant du sGluA1 piscine 5 et 15 min après le lavage de la DHPG. (B) graphique représente surface fluorescence normalisée selon l’intensité de la fluorescence totale. Comparaisons statistiques ont été réalisées à l’aide d’une ANOVA à, tests t appariés et non appariés de l’étudiant. p ≤ 0,05 ; n = 3 répétitions techniques de 3 expériences indépendantes. Les valeurs représentent la moyenne ± sem Ce chiffre a été modifié par mur, M. J. et coll. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figure 3 : Surface et internes de populations des sous-unités du récepteur AMPA GluA2 dans des neurones hippocampal WT et ArcKR. (A) la même condition expérimentale que la Figure 2. Par rapport au WT, ArcKR neurones ont une augmentation dans la piscine du récepteur d’AMPA contenant du sGluA2 5 min après le lavage de la DHPG. (B) graphique représente surface fluorescence normalisée selon l’intensité de la fluorescence totale. Comparaisons statistiques ont été réalisées à l’aide d’ANOVA, à tests t appariés et non appariés de l’étudiant. p ≤ 0,05 ; n = 3 répétitions techniques de 3 expériences indépendantes. Les valeurs représentent la moyenne ± sem Ce chiffre a été modifié par mur, M. J. et coll. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

L’excitabilité neuronale peut être modulée par un processus dynamique d’endo - et exocytose des récepteurs du glutamate ionotropiques excitateurs. Décrit ici, est un test accessible, à haute teneur pour quantifier les pools de population de récepteurs de surface et interne.

Un dosage de haute teneur de surveillance AMPA récepteur trafic

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Ici, nous démontrons un essai de trafic de récepteurs à haute teneur qui est compatible avec la préparation de la culture neuronale primaire. Cette méthode marque séparément la surface d’une piscine de récepteurs inter cave de neurones fixes. Présentation habilitante des données en tant que rapport entre la densité normalisée de la surface ou des récepteurs intériorisés et la densité globale de ce récepteur.L’analyse de trafic de contenu et de récepteurs à haute teneur fournit un moyen efficace de mesurer les changements en vrac dans les profils de trafic de récepteurs au sein d’un réseau neuronal en réponse à divers facteurs. Consommer beaucoup moins de temps et de matériaux que les méthodes alternatives. Les perturbations et le trafic de précepteurs ont été liés à de multiples troubles neurologiques et sont considérés comme des cibles attrayantes pour la pharmacothérapie.Par exemple, des études ont montré que l’un des premiers signes de la maladie d’Alzheimer est la perte synaptique et la diminution des bassins synaptiques et précepteurs. Cette technique nécessite de nombreuses étapes différentes de difficulté variable. D’autant plus que la manipulation de la plaque de puits 96 et la manipulation des puits peuvent s’avérer difficiles pour quelqu’un sans expérience.Et parce que les résultats de l’expérience sont très sensibles à une mauvaise manipulation, il est utile de visualiser les différentes étapes en cours d’effectuer. Instructeur Pour commencer, nourrissez les neurones dans la plaque de puits 96 en enlevant 100 microlitres des supports préexistants de chaque puits. Et le remplacer par 100 microlitres de médias préchauffés à 37 degrés Celsius.Tous les trois à quatre jours. Une journée in vitro 14, utilisez un multi-pipet pour enlever 100 microlitres de médias de chaque puits et mettre en commun les médias. Ajoutez deux microlitres de la solution TTX Stock à un millilitre des supports conditionnés mis en commun pour créer une solution quatre micromolaires de TTX.Traiter les neurones dans chaque puits avec 100 microlitres de quatre micromolaires TTX solution. S’il n’y a pas assez de supports d’état mis en commun, ajoutez certains des supports précédemment stockés. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.Après cela, retirez le TTX existant contenant des supports et ajoutez 200 microlitres de supports neuronaux préchauffés, et incubez la micro plaque à température ambiante pendant quinze minutes. Retirez d’abord le média neuronal de la micro plaque. Ajouter cinquante microlitres de la solution anticorps anti gluA1 ou anti gluA2 aux puits correspondants de la micro plaque.Ajouter cinquante microlitres de supports neuronaux aux puits de contrôle des anticorps secondaires. Incuber à température ambiante pendant vingt minutes pour permettre la liaison anticorps. Après cela, retirez les supports existants des puits.Lavez la micro plaque trois fois avec 100 microlitres de médias neuronaux à température ambiante par puits pour éliminer les anticorps non liés. Ajoutez ensuite 100 microlitres 100 micromolaires de solution de stock DHPG à chaque puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant dix minutes.Ensuite, retirez la solution DHPG et ajoutez 100 microlitres de médias neuronaux à chaque puits. Répétez ce processus une deuxième fois. Puis incuber dans l’incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Le jour de l’expérience préparer une solution de 4% paraformaldéhyde et 4% saccharose NPBS. Retirez le média de chaque puits et remplacez-le par 100 microlitres de la solution de paraformaldéhyde et de saccharose. Répétez ce processus pour chaque point de temps d’ajout.Incuber la micro plaque à 4 degrés Celsius pendant vingt minutes. Retirez ensuite le fixatif et ajoutez 100 microlitres de DPBS à chaque puits. Retirez le DPBS et ajoutez 150 microlitres de tampon de blocage à chaque puits.Incuber à température ambiante pendant quatre-vingt-dix minutes. Retirez le tampon de blocage et ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant soixante minutes tout en gardant la plaque à l’abri de la lumière.Retirez la solution anticorps et ajoutez 100 microlitres de SCT à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce processus, en enlevant le média des puits en ajoutant le SCT et en couveant à température ambiante quatre fois de plus.Après cela, retirez le SCT de la micro plaque. Ajouter 100 microlitres d’une solution de 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose en PBS à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant quinze minutes.Retirer la solution de paraformaldéhyde et ajouter 100 microlitres de SCT dans chaque puits, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez cette étape deux fois supplémentaires. Préparez d’abord une solution de SCT contenant 2% de saponine et vortex de la solution brièvement pour dissoudre complètement la poudre de saponine.À l’aide d’un filtre de 2 micromètres, filtrer la solution pour éliminer les particules qui pourraient causer l’autofluorescence. Ajouter 150 microlitres de cette solution de 2% de saponine à chaque puits, et incuber à température ambiante pendant quinze minutes. Retirez ensuite la solution saponine et ajoutez 150 microlitres de tampon de blocage à chaque puits.Incuber à température ambiante pendant quatre-vingt-dix minutes. Après cela, retirez le tampon de blocage et ajoutez cinquante microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant soixante minutes.Ajouter ensuite 100 microlitres de SCT à chaque puits et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce processus en ajoutant le SCT et en couveant à température ambiante quatre fois de plus. À l’aide d’un système d’imagerie laser infrarouge, imagez la micro plaque de puits 96 selon les instructions des fabricants.Réglez la résolution d’analyse à 84 micromètres. La qualité de l’analyse à moyen et la mise au point offset en fonction de la hauteur de base de la plaque micro 96 puits utilisé. Cliquez sur le bouton menu Image Studio, exportez l’image pour les médias numériques et exportez les images avec une résolution de 300 dpi en format TIFF.Ouvrez l’image dans ImageJ Fiji. Divisez les canaux de couleur en cliquant sur le menu de l’image, puis la couleur, diviser les canaux. Ensuite, ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement à partir d’analyses, d’outils.Cochez la case pour les étiquettes dans le gestionnaire de retour sur investissement, afin de classer les cercles avec des nombres. Dans le canal 6 80, ou rouge, sélectionnez la région d’intérêt en sélectionnant l’outil cercle et en dessinant un cercle qui s’adapte exactement au premier puits. Ensuite, appuyez sur Ctrl plus T, en faisant glisser le cercle vers le puits suivant.Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les puits soient encerclés. À partir de la mesure de clic de gestionnaire de roi. Sélectionnez les valeurs qui apparaissent et copiez-les sur une feuille de diffusion.Cliquez ensuite sur le canal vert et transposez les ROM sélectionnés à l’image. À partir de la mesure de clic de gestionnaire de roi. Sélectionnez les valeurs qui apparaissent et copiez-les sur une feuille de diffusion.Après cela calculer les changements de l’expression du récepteur de surface tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette procédure, la persistance de l’arc dans la régulation du trafic des récepteurs ampa est examinée à l’aide du trafic et de l’essai des récepteurs ampa à haute teneur. Les neurones sont traités avec le bloqueur de canal sodium-ion TTX qui inhibe les potentiels d’action et réduit les niveaux d’arc.Suivi par DHPG qui induit la traduction d’arc et l’ubiquitination. Les sous-unités de récepteur de surface et d’internalisation de gluA1 et de gluA2 contenant des sous-unités de récepteur d’apa ont été mesurées à cinq et quinze minutes après le lavage de DHPG. Les neurones ArcKR montrent une endositose gluA1 accrue lorsqu’ils sont traités par DHPG, par rapport aux neurones de type.Cet effet n’est pas vu lorsque les neurones sont traités avec TTX seulement. L’expression de surface du sous-unité gluA2 est augmentée de façon significative à des moments courts par rapport aux neurones de type flétrissement. Indiquant un remplacement sous-unit potentiel.Assurez-vous que les cellules sont illiquides paraformaldéhyde fixe doit être préparé frais le jour de l’expérience. Les cellules doivent être réparées après l’étiquetage des récepteurs de surface. D’autres méthodes telles que la microscopie confocale seront en mesure de fournir une résolution unicellulaire pour caractériser davantage les modifiés connexes dans la structure neuronale et la localisation des récepteurs.Perturber la dynamique temporelle de l’arc modifie le trafic des récepteurs ampa en réponse à MgluR médiatisé LTD. Les orientations futures seront de mesurer le trafic des récepteurs ampa en réponse à d’autres stimuli. Cet essai peut-être adaptable à d’autres types de cellules, traitements et récepteurs, à condition que la procédure soit soigneusement ajustée et validée de manière appropriée.Il faut veiller à ce que les densités cellulaires, les temps de traitement, les étapes de fixation, les étapes de perméabilisation et les sélections de reagent soient optimisés pour votre système d’intérêt. Pour une réalisation réussie et efficace de l’analyse, il est important de préparer la solution DHPG et le paraformaldéhyde à 4 %, solution de saccharose à 4 % le jour de l’expérience. Contrôle bien traité avec vakeel ou TTX sont nécessaires pour s’assurer que les effets observés sont spécifiques au traitement.Il est également essentiel d’inclure les puits traités avec seulement les anticorps secondaires à contrôler pour la fluorescence de fond produite par la liaison non spécifique.

Research

JoVE Journal

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