Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

אנו מודים זכריה אלן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי קרן וייטהול (גרנט 2017-05-35), קליאון ג ארינגטון חניכה גרנט תכנית המחקר (מעטה-93) A.M.M. M.A.G., D.W.Y. היו שניהם נתמך על ידי מלגת 2CI Neurogenomics אוניברסיטת מדינת ג'ורג'יה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת ג'ורג'יה.
1. הכנת ראשי נוירונים בהיפוקמפוס (ב למינארי)
<ol><li>לבודד נוירונים בהיפוקמפוס הראשי מיום כמחנכת סקס מעורב (P) 0-1 עכברים כאמור תיאר36.</li>
	<li>צלחת נוירונים ב- 96-ובכן פולי-D-ליזין מצופה microplates-צפיפות של תאים4 עונה 2 פרק 10 לכל טוב.</li>
	<li>להתכונן מדיה האכלה הנוירונים על-ידי הוספת 10 מ"ל של 50 x B-27, 5 מ של 100 x גלוטמין, µL 242 של 10 מ"ג/מ"ל 5-פטור-2 ′-deoxyuridine (FUDR) ו-10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Gentamycin 485 מ של התקשורת העצבית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>נוירונים הזנה כאמור תיאר36 על-ידי הסרת חצי (100 µL) קיימים מדיה (המכונה מדיה ממוזגים, אשר מכיל את המרכיבים התומכים הישרדות עצביים) מכל קידוח, החלפת µL 100 של 37 ° C prewarmed מדיה מוכן בשלב 1.3 כל 3-4 ימים. חנות המדיה ממוזגים מן כל הנקה-4˚C עבור שלב 2.3.</li>
</ol>2. מדידת קולטן אמפא סחר בתגובה DHPG (ב למינארי)
<ol><li>בהיום בחוץ גופית (DIV) 14, להכין 500 µL מניות פתרון של טטרודוקסין (TTX)-ריכוז של 2 מ מ באמצעות תרבית תאים כיתה מים. התראה: טטרודוטוקסין הוא רעלן עצבי. לטפל בזהירות ולהימנע מגע עם העור.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, הסר 100 µL מכל קידוח של microplate 96-ובכן של נוירונים, מאגר המדיה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של הפתרון מניות TTX 1 מ"ל של המדיה ממוזגים במאגר מהשלב 2.2 כדי ליצור פתרון 4 מיקרומטר של טטרודוטוקסין. אם אין מספיק במאגר מדיה ממוזגים, ואז להשתמש בחלק המדיה ממוזגים מאוחסנות מן 1.4 שלב.</li>
	<li>פנקו נוירונים עם µL 100/טוב של הפתרון 4 מיקרומטר של TTX מהשלב 2.3. מקם את microplate CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.</li>
	<li>צרף זכוכית סטריליים פסטר פיפטה לקו יניקה, לצרף קצה פיפטה 200 µL סטרילי קצה פיפטה. להסיר את המדיה מכל טוב בקפידה. להימנע מלגעת בתחתית microplate שבו ממוקמים הנוירונים.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של התקשורת העצבית בטמפרטורת החדר מכל קידוח.</li>
	<li>דגירה של microplate בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות הדגירה 5% CO2 הוא מועדף אבל לא הכרחי.</li>
</ol>3. Immunolabelling (ב למינארי)
<ol><li>להכין 1:150 לדילול נוגדן anti-GluA1 או אנטי-GluA2 בתקשורת העצבית.</li>
	<li>הסר את כלי התקשורת העצבית שנוספו ב- 2.6 שלב. להוסיף 50 µL של פתרונות נוגדן anti-GluA1 או אנטי-GluA2 בארות המתאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר הנוגדן מחייב. להוסיף 50 µL של התקשורת העצבית הבארות שליטה נוגדנים משניים בלבד.</li>
	<li>הסר את הפתרונות נוגדן נוסף בשלב 3.2. לשטוף את microplate 3 פעמים עם 100 התקשורת העצבית בטמפרטורת החדר µL/טוב כדי להסיר את כל הנוגדנים לא מאוגד.</li>
	<li>להפוך את פתרון מניות 50 מ מ של DHPG בתקשורת העצבית או תא תרבות כיתה מים. מערבולת הפתרון בקצרה כדי לפזר באופן מלא את DHPG. להכין טרי הפתרון הזה באותו יום של הניסוי. הימנע משימוש ישנים או המופשרים פתרונות.</li>
	<li>לדלל את הפתרון מניות בתקשורת העצבית עד שבערך לעשות פתרון 100 מיקרומטר.</li>
	<li>הסר את המדיה הקיימים מכל קידוח. להוסיף 100 µL טוב של הפתרון מניות של DHPG 100 מיקרומטר שלב 3.5. דגירה של microplate בחממה ב 37 ° C 5% CO2 למשך 10 דקות.</li>
	<li>להסיר את הפתרון DHPG הוסיף בשלב 3.6 ולהוסיף 100 התקשורת העצבית µL/טוב. חזור על שלב זה עוד פעם אחת. מניחים את microplate בחממה ב 37 ° C 5% CO2 במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף את סוכרוז כדי להפוך את הפתרון סוכרוז paraformaldehyde/4% 4% ב- PBS באותו יום של הניסוי. הימנע משימוש ישנים או המופשרים פתרונות. הסר את המדיה הוסיף בשלב 3.7. להוסיף 100 µL טוב בפתרון סוכרוז paraformaldehyde/4% 4%. חזור על הצעדים 3.6 – 3.8 בכל נקודת זמן נוספים. פעם אחת להשלים, דגירה של microplate ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. התראה: לטפל paraformaldehyde מניות ברדס fume.</li>
	<li>הסרת מקבע שלב 3.8 ולהוסיף µL 100/טוב של x DPBS 1 קר.</li>
	<li>להסיר את DPBS. להוסיף 150 µL/טוב חסימת מאגר (ניסוח מוכן לשימוש ב- TBS, עיין בטבלה של חומרים), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות לחלופין, דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
</ol>4. רצפטורים משטח labelling
<ol><li>להכין לדילול 1:1500 680RD עז העכבר אנטי איג משני נוגדן במאגר חסימה.</li>
	<li>הסר חסימה מאגר שלב 3.10. הוסף µL 50/טוב של הפתרון נוגדנים משניים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דק. שמור microplate מוגן מפני אור ברגע נוגדנים משניים נוספים. הקפד להמשיך להגן על microplate את האור במהלך incubations הבאים.</li>
	<li>הסר את הפתרון משלב 4.2. הוסף µL 100/TBS (50 מ מ טריס-HCl, 150 מ מ NaCl, pH 7.6) ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.</li>
	<li>הסר TBS שלב 4.3. מוסיפים µL 100/טוב של 4% סוכרוז paraformaldehyde/4% PBS, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר את פתרון של שלב 4.4. הוסף µL 100/TBS טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על השלב 2 פעמים נוספות.</li>
</ol>5. האוכלוסייה קולטן למביטה labelling
<ol><li>להכין TBS המכיל סאפונין 0.2%. מערבולת הפתרון בקצרה מלא להמיס את האבקה סאפונין. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 µm כדי להסיר את כל החלקיקים שעלולה לגרום אוטומטי-זריחה.</li>
	<li>להוסיף 150 µL TBS המכיל סאפונין 0.2% ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר סאפונין פתרון של שלב 5.2 ולהוסיף 150 מאגר חסימה µL/טוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.</li>
	<li>להכין לדילול 1:1500 800CW חמור העכבר אנטי איג נוגדן משני במאגר חסימה.</li>
	<li>הסר חסימה מאגר שלב 5.3 ולהוסיף 50 µL טוב של הפתרון נוגדנים משניים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 100/TBS טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.</li>
</ol>6. הדמיה וניתוח
<ol><li>תמונה של microplate 96-ובכן באמצעות לייזר אינפרא-אדום של הדמיה מערכת על פי הוראות היצרן. הגדר את רזולוציית הסריקה מיקרומטר 84, את איכות הסריקה בינונית מבטיחות את קיזוז על פי גובה הבסיס microplate 96-ובכן בשימוש. לחץ על ה "תמונת סטודיו" תפריט לחצן ← לייצא ← תמונה עבור מדיה דיגיטלית ← ייצוא תמונות ברזולוציה של 300 dpi, בתבנית TIFF.</li>
	<li>הורד תמונה J "פיג'י"-https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>תמונה פתוחה ב- J תמונה "פיג'י". פצל ערוצים צבע על ידי לחיצה על תפריט 'תמונה' צבע ← פצל ערוצים.</li>
	<li>פתח את מנהל רועי מ "לנתח" ← "כלים". סמן את התיבה "תוויות" במנהל רועי לתייג את העיגולים עם מספרים.</li>
	<li>באדום ערוץ (680 nm קולטן משטח הבריכה), בחר את האזור של הריבית (ROI) על-ידי בחירת הכלי מעגל ציור מעגל שמתאים באופן מדויק את הבאר הראשונה. הקש Ctrl + T.</li>
	<li>גררו את העיגול הבא טוב והקש Ctrl + טי חוזר עד כל בארות מוקפים בעיגול.</li>
	<li>מהמנהל רועי, לחץ על "מידה". בחר את הערכים מופיעים ולהעתיק אותם אל גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>לחץ על ערוץ הצבע הירוק (800 nm קולטן פנימית הבריכה) ולאחר מכן לשקף את ROIs שנבחרה מ שלב 6.6 על התמונה. מהמנהל רועי, לחץ על "מידה". בחר את הערכים מופיעים ולהעתיק אותם אל גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>לחשב שערכי צפיפות משולב ממוצע המשני רק לשלוט בארות. להחסיר את ערכי דחיסות משולב במשך כל ניסיוני מתוך ממוצע משני היחידה בקרה משולבת צפיפות הערכים עבור מאגר קולטן משטח. חזור על שלב זה עבור הבריכה קולטן פנימי.</li>
	<li>לחשב שינויים בביטוי קולטן השטח באמצעות Rs/Rt, כאשר Rs מייצג הצפיפות משולב של קולטנים משטח ומייצג Rt הצפיפות משולב של קולטנים משטח + צפיפות משולב קולטנים פנימי.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אמפא רצפטורים הן סוג של קולטן גלוטמט ionotropic זה הוא חלק בלתי נפרד עבור פונקציות עצביים הכוללים סינפסה היווצרות סינפסה ויציבות פלסטיות סינפטית. אמפא קולטן הפרעה מקושר הפרעות נוירולוגיות מספר24 , והם נחשבים אטרקטיביים סמים מטרות40. לדוגמה, מחקרים הראו כי אחד הסימנים המוקדמים של מחלת אלצהיימר (AD) אובדן סינפסה, מופחתת סינפטית אמפא קולטן רמות41,42. מסקרן, תוספת של עמילואיד-ß oligomers פוגע ביטוי הקולטן אמפא המכילות GluA1 משטח הסינפסות43. יתר על כן, סטטוס אפילפטיקוס למטה-מסדיר GluA2 mRNA וחלבון בנוירונים בהיפוקמפוס שלפני המוות שלהם44. נוירודגנרטיביות (ALS), TAR DNA כריכת חלבון (TDP-43) פתולוגיה, חריגות מולקולרי ספציפי ALS, יש כבר אתר GluA2 Q/R מקושר לא יעיל-RNA עריכת45.
אמפא גבוהה-תוכן קולטן וזמינותו סחר מספק אמצעי יעיל למדידת שינויים בכמות גדולה בפרופילי סחר קולטן בתוך רשת עצביים בתגובה לגורמים שונים, לצרוך הרבה פחות זמן וחומרים מאשר שיטות אלטרנטיביות. Microplate 96-ובכן יחיד מספק בארות רבות כדי להפעיל טכנית מרובים משכפל ופקדים עבור תנאים שונים ניסיוני באותה הצלחת. צפיפות נמוכה ציפוי של 2 x 104 תאים/טוב יחסית צפיפות התאים/טוב 5 x 105 מפחית באופן משמעותי את מספר חיות וחומרים הדרושים עבור ניסוי (איור 1). דאגה אפשר תמונה עד שישה 96-ובכן microplates בכל פעם. גם יכול להיות שונה וזמינותו 384-ובכן microplate46, אשר הופך להיות יקר במיוחד אם וזמינותו מופעל על דגימות היקרה, קשה להשיג או יקרים לתרבות (למשל אדם ודוגמאות גזע pluripotent המושרה). וזמינותו כולו יכול להיות הושלמה וניתח באותו יום, אשר חוסך זמן יקר (איור 1).
עבור סיום מוצלח ויעיל וזמינותו, כמה נקודות צריך להיחשב. ראשית, חשוב להכין את הפתרון DHPG באותו יום של נוירון טיפול. אין לעשות שימוש חוזר או להקפיא DHPG מניות. סוכרוז paraformaldehyde/4% 4% ב- PBS פתרון צריך להתבצע גם טריים באותו יום של הניסוי. שנית, שליטה בארות שטופלו TTX בלבד או הרכב נדרשים כדי להבטיח כי ההשפעות נצפתה ספציפי לטיפול. חשוב גם כדי לכלול בארות שטופלו רק נוגדנים משניים כדי לשלוט על רקע זריחה המיוצר על-ידי איגוד שאינם ספציפיים. שימו לב כי הצעד השני קיבעון (הבאים כשלון של נוגדנים משניים) מפתח כדי להפחית את תופעות רקע נוגדנים משניים ולהשיג labelling יעיל של הקולטן subunits.
פשרות ומגבלות, כמו עם כל שיטה, קיים. Assay הזה אינו מספק רזולוציה תא בודד (או subcellular), אינו מאפשר מעקב בזמן אמת של קולטן סחר כמו שאר שיטות32,33,35. בנוסף, טיפול נאות יש לנקוט במהלך השלב permeabilization של הנוירונים, כמו בשיטה זו יהיה רגיש הדליפות מרכיבים תאיים במקרה של permeabilization יתר.

גודל ואת הדינמיקה הטמפורלי של דעתנית העצבית היא תלויה במידה רבה על זמינות, הרכב האוכלוסיות קולטן משטח מגלי אותות אלקטרוכימי. ואילו הסינתזה של קולטנים חדשים (או קולטן subunits) הוא בדרך כלל תהליך אנרגטית יקר וממושך יחסית, שורה של מכונות הסלולר מוקדש אנדו - ואת אקסוציטוזה של רצפטורים הקיימים מספקים אמצעי להכנסה מהירה שלהם והסרה של קרום1ואליה. לכן, בנוסף גנים ברמת השעתוק והתרגום ויסות רצפטורים, קולטן posttranslational סחר הוא אפנן חשוב של דעתנית עצביים.
פלסטיות סינפטית, או שינוי עוצמת קשרים בין נוירונים עם ניסיון, הוא חשב יוצרות את הבסיס של לימוד, זיכרון2,3. חיזוק והתערערות של הסינפסות לאורך זמן, כינה הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), בהתאמה, יכול להיות מאופנן דרך הסחר של רצפטורים חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) 4 , 5. אמפא רצפטורים הן heterotetramers המורכב מארבע subunits (GluA1-4), לתווך הרוב המכריע של סינאפסות מהר הסינאפסית ב המוח6. לכן, נוירון דעתנית הוא במידה רבה פונקציה של הכמות של אמפא רצפטורים על פני postsynaptic זמין תופעל על-ידי גלוטמט. בע מ מזוהה בדרך כלל עם עלייה אמפא קולטן אנדוציטוזה, ואילו LTP מזוהה בעיקר עם עלייה אמפא קולטן אקסוציטוזה. ביטוי משטח postsynaptic של אמפא רצפטורים דורש endosomal משלוח חלבונים exocytotic, איפה פיוז'ן עם קרום פלזמה אז מתרחשת באופן תלוי סידן-7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. קיימים גם שורה של מנגנונים המסדירים את פעילות תלויי אמפא קולטן אנדוציטוזה. דוגמא אחת היא דרך הגן מוקדם מיידי Arc/Arg3.1 (Arc). בין פונקציות אחרות15, Arc ידוע לתווך גלוטמט מטבוטרופי (mGluR)-תלוי בע מ באמצעות קידום אמפא אנדוציטוזה קולטן דרך שותפיה איגוד, אשר כוללים את החלבונים endocytic AP-2, endophilin-3 dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19-מצופים clathrin בורות20,21. למביטה אמפא רצפטורים יכולים להיות ממוחזרים בחזרה אל קרום פלזמה או לייעד את השטח השפלה22,23.
חשוב לציין, ההרכב יחידת משנה של אמפא רצפטורים תורמת שלהם דינמיקה סחר24. מידת הרלוונטיות העיקריים הוא תאיים C-מסוף תחום של subunits, שבו רוב השינויים posttranslational אינטראקציות חלבון סחר הקשורות להתרחש. GluA1, GluA4 המכילים יחידת משנה אמפא רצפטורים נוטים במיוחד להיות הנסחר השטח תא במהלך LTP, בין השאר בשל נוכחותם של ליגנדים PDZ שלהם, רצפים של חומצות אמיניות ~ 90 המקדמים ממברנה עיגון באמצעות אינטראקציות עם PDZ שונים תחום המכיל חלבונים25,26. מצד שני, אמפא רצפטורים המכיל GluA2, GluA1 או GluA4 נוטים להיות הנסחר צורונים אבל להצטבר intracellularly עם פעילות סינפטית27. GluA2 subunits עוברים RNA עריכה אשר, בנוסף קידום השמירה רשתית תוך-פלזמית28, רינדור הנקבובית ערוץ אטום סידן29, בהמשך שמערבות יחידת משנה ספציפי סחר כמתווך מפתח של עצביים הומאוסטזיס, פלסטיות. מעניין, שיבוש אוביקוויטין תלוית Arc השפלה הוכח להגביר אנדוציטוזה GluA1 ולהגביר את הביטוי משטח של אמפא רצפטורים של יחידת משנה המכילות GluA2 לאחר אינדוקציה של mGluR-בע מ עם סלקטיבי לקבץ אני אגוניסט mGluR (S) - 3.5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), המציין כי הרבה נשאר מה ללמוד לגבי מנגנוני ו תפקיד של יחידת משנה ספציפי אמפא קולטן סחר30.
שיטות התבוננות שינויים בביטוי משטח של קולטני לעיתים מסורבל, זמן רב, או להציג מיותרים מבלבל. מבחני מבוסס-ביוטין הן בגישה נרחבת, זמינים מסחרית. זיקה טיהור של קולטני משטח biotinylated מייצג דוגמה אחת כזו, אולם נחיצות ביצוע אלקטרופורזה דורש כמות גדולה של חומר מדגם לרנדר ההקרנה של ריבוי טיפולים ארוך מדי תהליך31. הרחבות של זה וזמינותו, איפה נקודות זמן מרובות של תיוג, immunoprecipitations מתבצעים לכמת את הידרדרות הדרגתית של אות הראשונית, בדומה להזניח את התוספת של חדש — או ממוחזרים – רצפטורים לתא השטח ורק להחריף הזמן ואת דרישות החומרים.
גישות אחרות לעשות שימוש בונה chimeric או התוספת של תגיות פלואורסצנט לצפות קולטן סחר32, לעתים תוך שימוש חי תא33,הדמיה34. בזמן פוטנציאל רב-עוצמה, עיצובים אלו יכולים להשפיע על הדפוסים לסחר בבני אדם נורמלי של קולטני עקב מוטציות או שינויים דרמטיים משקל מולקולרי הציג חלבונים אלה. השימוש של צבעי כי תאים subcellular תווית על ידי מיקוד pH נמוך34,35 הם בלתי ספציפיים ולעשות הבחנה בין תאים תאיים שונים חשוב קולטן סחר בבני אדם (למשל. lysosomes ו proteasomes) קשה. לבסוף, השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש את colocalization של קולטני עם סמנים המשויך סחר והשפלה, כגון חלבונים endosomal או clathrin, תוך מתן שעשוי להיות שימושי תובנה לוקליזציה ספציפי עם רזולוציה subcellular, האם הזמן עתירי עבודה, יקר בשל הצורך ניתוח בנפרד בכל תא לבין הדרישה קונאפוקלית או מיקרוסקופ ברזולוציה-העל.
. הנה, נדגים assay סחר קולטן גבוהה-תוכן התואם ראשי תרבות עצביים ההכנות30. שיטה זו תוויות בנפרד בבריכות קולטן משטח, תאיים של הנוירונים קבוע, המאפשר הצגת נתונים כיחס של משטח מנורמל או צפיפות קולטן למביטה לצפיפות הכוללת עבור כי קולטן. הטבע גבוהה-תוכן של שיטה זו הוא אידיאלי עבור הקרנת מספר טיפולים ו/או אחרים בתוך מסגרת זמן קצר, ודורש תא רגיל רק culturing נוגדן הדגירה ומומחיות.
בקצרה, נוירונים העיקרי גדל סטנדרטי microplates 96-ובכן, ואז שטופלו כפי שמכתיבה תכנון ניסויים, מודגרות עם נוגדנים הראשי, שטופים קבוע. תאים מודגרת אז עם נוגדן משני לתייג רצפטורים משטח, ואחריו שלב קיבוע נוסף. מתרחשת permeabilization ואז ומשמש נוגדן המשני השני לתייג בריכות קולטן פנימי. לבסוף, התאים הם צילמו באמצעות סורק microplate פלורסנט אינפרא-אדום כדי לכמת את הצפיפות משולבת של כל האוכלוסייה קולטן. איור 1 מסכמת שלנו וזמינותו גבוהים-תוכן לעומת assay biotinylation המסורתי.
בעוד הפרוטוקול הציע הנה ממוטבת וספציפי על קולטן אמפא סחר בתרבויות העיקרי נוירון בהיפוקמפוס, הליך זה, תיאורטית, להיות מורחב, מותאם קולטנים שונים במגוון סוגי תאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Postsynaptic סחר של רצפטורים על פני התא ואליה הוא מנגנון חשוב שבו נוירונים לווסת את התגובה לגירויים שונים. קולטני α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) חומצה, אשר אחראים מהר סינאפסות הסינאפסית בנוירונים, בילנאומיים מן השטח postsynaptic כדי לשנות באופן דינמי עצביים דעתנית. אמפא קולטן סחר הוא חיוני פלסטיות סינפטית, עלולות להפגע, מחלה נוירולוגית. עם זאת, גישות נפוצות עבור לכימות קולטן סחר להתעלם בריכות קולטן כולו, הם יותר מדי זמן -, עתירי עבודה, או העלול לשבש את מנגנוני לסחר בבני אדם רגיל, ולכן לסבך את הפרשנות של הנתונים המתקבלים. אנו מציגים וזמינותו גבוהים-תוכן עבור כימות של פני השטח והן פנימיים אמפא קולטן אוכלוסיות בתרבית נוירונים בהיפוקמפוס הראשי באמצעות immunolabeling פלורסנט כפול וסורק microplate 96-ובכן פלורסנט-סגול. גישה זו מקלה על הקרנת בצובר הפנימו מהירה, על פני השטח קולטן צפיפויות תוך מזעור חומר מדגם. עם זאת, השיטה שלנו יש מגבלות קבלת רזולוציה תא בודד או תא חי דימות ניצוח. לבסוף, פרוטוקול זה עשוי להיות נוטה רצפטורים אחרים, לסוגי תאים שונים, הניתנים התאמות נאות ואופטימיזציה.

Arc/Arg3.1 מאיצה אמפא אנדוציטוזה קולטן תוך אינטראקציה עם AP-2, endophilin-3 ו- dynamin-216,18 בעקבות הפעלת mGluR37. קשת בטוק העכבר (ArcKR), lysines 268, 269 בתוך החלבון קשת הם מוטציה ל ארגינין, אשר משבשת קשת ubiquitination. זה פוגע פרוטאוזום תלוית מחזור של קשת, מאריך את זמן מחצית החיים שלה בתוך הנוירונים21,30. בניסוי זה, התמדתו של קשת בוויסות אמפא קולטן סחר נבדקה באמצעות אמפא גבוהה-תוכן קולטן וזמינותו לסחר בבני אדם. נוירונים טופלו את החוסם ערוץ Na+ TTX, אשר מעכב את פוטנציאל פעולה ומקטין Arc רמות38, ואחריו DHPG, אשר מעניקה קשת ותרגום37,ubiquitination39. השטח והן למביטה בריכות של GluA1 - (איור 2 א) המכילים GluA2 (איור 3 א) אמפא קולטן subunits היו נמדד ב 5 ו-15 דקות לאחר כשלון DHPG. בניסוי מסוים משמש משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. הנוירונים ArcKR הראה אנדוציטוזה GluA1 מוגברת כאשר מטופלים עם DHPG בהשוואה WT הנוירונים, אפקט שלא נראתה כאשר נוירונים שטופלו TTX בלבד (איור 2B). ביטוי משטח GluA2 subunits היה משמעותי מוגברת בנקודות זמן קצר בהשוואה WT נוירונים (איור 3B), המציינת את החלפת יחידת משנה פוטנציאליים30. מספר בארות טופלו נוגדנים משניים בלבד כדי לשלוט על רקע זריחה הנגרמת על-ידי איגוד לא ספציפית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> איור 1: השוואה של אמפא קולטן גבוהה-תוכן סחר וזמינותו כדי וזמינותו biotinylation הקולטן. וזמינותו סחר גבוהה-תוכן צורכת פחות זמן ומשאבים לעומת וזמינותו biotinylation רגיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> איור 2: אוכלוסיות משטח ופנימיים של אמפא GluA1 subunits קולטן של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR. (א) השטח (sGluA1), subunits קולטן אמפא המכילות GluA1 למביטה (iGluA1) של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR-5 ו-15 דקות לאחר כשלון DHPG. בהשוואה ל- WT, הנוירונים ArcKR יש ירידה נוספת מין בריכה 5 ו-15 המכילות sGluA1 ' של קולטן אמפא לאחר כשלון DHPG. (B) גרף מייצג משטח פלורסצנטיות מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל. השוואות סטטיסטי בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד, בדיקות t מזווג, אינטראקצית הסטודנט. p ≤ 0.05; n = משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. ערכים מייצגים זאת אומרת ± ב- SEM... איור זה השתנה, מ' ג' ואח 201830מהחומה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> איור 3: אוכלוסיות משטח ופנימיים של אמפא GluA2 subunits קולטן של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR. (א) ניסיוני באותו המצב כמו באיור 2. בהשוואה ל- WT, הנוירונים ArcKR יש גידול המכילים sGluA2 אמפא קולטן לבריכה 5 דקות לאחר כשלון DHPG. (B) גרף מייצג משטח פלורסצנטיות מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל. השוואות סטטיסטי בוצעו באמצעות חד-כיווני אנובה, בדיקות t מזווג, אינטראקצית הסטודנט. p ≤ 0.05; n = משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. ערכים מייצגים זאת אומרת ± ב- SEM... איור זה השתנה, מ' ג' ואח 201830מהחומה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

כאן אנו מדגימים תב"ן סחר בתוכן גבוה התואם את ההכנה העיקרית לתרבות העצבית. שיטה זו מתייגת בנפרד את פני השטח מאגרי קולטן בין מרתפים של נוירונים קבועים. הפעלת הצגת נתונים כיחס של משטח מנורמל או צפיפות קולטן פנימית לצפיפות הכוללת של קולטן זה.בדיקת התוכן הגבוה והסחר בקוולטנים מספקת אמצעים מושפעים למדידת שינויים בתפזורת בפרופילי סחר בקוטנים בתוך רשת עצבית בתגובה לגורמים שונים. צריכת הרבה פחות זמן וחומרים מאשר שיטות חלופיות. שיבושים וסחר כללים קושרו הפרעות נוירולוגיות מרובות, והם נחשבים מטרות אטרקטיביות לטיפול תרופתי.לדוגמה מחקרים הראו אחד הסימנים המוקדמים ביותר של מחלת אלצהיימר הוא אובדן סינפטי ובריכות סינפטית וחלודות מופחתות. טכניקה זו דורשת שלבים רבים ושונים של קושי משתנה. במיוחד בגלל טיפול צלחת 96 היטב מניפולציה בארות יכול להוכיח קשה עבור מישהו ללא ניסיון.ומכיוון שתוצאות הניסוי רגישות מאוד לטיפול לא תקין, כדאי להציג את השלבים השונים המבוצעים. מדריך להתחיל, להאכיל את הנוירונים בצלחת 96 גם על ידי הסרת 100 microliters של המדיה הקיימת מראש מכל באר. והחלפתו ב-100 מיקרוליטרים של מדיה שהתחממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס.כל שלושה עד ארבעה ימים. יום במבחנה 14, להשתמש multi-pipet כדי להסיר 100 microliters של מדיה מכל באר בריכה התקשורת. הוסף שני מיקרוליטרים של פתרון TTX Stock למיליליטר אחד של המדיה המותנית הממוזגת כדי ליצור פתרון של ארבעה מיקרומולרים של TTX.לטפל בנוירונים בכל באר עם 100 microliters של פתרון TTX מיקרומולר. אם אין די מדיה של תנאי מאגר, הוסף חלק מהמדיה שאוחסנה קודם לכן. דגירה באינקובטור 5%CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.לאחר מכן להסיר את TTX הקיים המכיל מדיה ולהוסיף 200 microliters של מדיה עצבית מחוממת מראש, ו דגירה צלחת מיקרו בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה. ראשית להסיר את התקשורת העצבית מהצלחת מיקרו. הוסף חמישים microliters של פתרון נוגדן אנטי gluA1 או אנטי gluA2 ל בארות המתאימות של צלחת מיקרו.הוסף חמישים מיקרוליטרים של מדיה עצבית לתרנות הנוגדנים המשניות בלבד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשרים דקות כדי לאפשר כריכת נוגדנים. לאחר מכן הסר את המדיה הקיימת מ- wells.לשטוף את צלחת המיקרו שלוש פעמים עם 100 microliters של מדיה עצבית טמפרטורת החדר לכל באר כדי להסיר את כל נוגדנים מאוגדים. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים 100 מיקרומולרים של פתרון מלאי DHPG לכל באר. דגירה באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.הבא להסיר את פתרון DHPG ולהוסיף 100 microliters של מדיה עצבית לכל באר. חזור על תהליך זה פעם נוספת. ואז דגירה באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.ביום הניסוי להכין פתרון של 4% paraformaldehyde ו 4% סוכרוז NPBS. הסר את המדיה מכל באר והחלף אותה ב-100 מיקרוליטרים של פתרון הפרפורמלדהיד והסוקרוס. חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן של חיבור.דגירה צלחת מיקרו ב 4 מעלות צלזיוס במשך עשרים דקות. לאחר מכן להסיר את התיקון ולהוסיף 100 microliters של DPBS לכל באר. הסר את ה- DPBS והוסף 150 מיקרוליטרים של מאגר חסימה לכל באר.דגירה בטמפרטורת החדר במשך תשעים דקות. הסר את מאגר החסימה והוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שישים דקות תוך שמירה על הצלחת מוגנת מפני אור.הסר את פתרון הנוגדנים והוסף 100 מיקרוליטרים של TBS לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על תהליך זה, הסרת המדיה מה בארות הוספת TBS, ודגירה בטמפרטורת החדר ארבע פעמים נוספות.לאחר מכן, להסיר את TBS מהצלחת מיקרו. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון של 4%paraformaldehyde ו 4% סוכרוז ב PBS לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה.מוציאים את תספורפורמלדהיד ומוסיפים 100 מיקרוליטרים של TBS בכל באר, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות. ראשית להכין פתרון של TBS המכיל 2% סאפונין ומערבולת הפתרון בקצרה כדי להמיס באופן מלא את אבקת סאפונין.באמצעות מסנן 2 מיקרומטר, לסנן את הפתרון כדי להסיר את כל החלקיקים שיכולים לגרום לשפעת אוטומטית. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של תסנובת 2%סאפונין זו לכל באר, והם דגירה בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה. לאחר מכן הסר את פתרון סאפונין, והוסף 150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה לכל באר.דגירה בטמפרטורת החדר במשך תשעים דקות. לאחר מכן להסיר את מאגר החסימה ולהוסיף חמישים microliters של פתרון הנוגדן המשני לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שישים דקות.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של TBS לכל באר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על תהליך זה הוספת TBS ודגירה בטמפרטורת החדר ארבע פעמים נוספות. באמצעות מערכת הדמיית לייזר אינפרא אדום תמונה 96 גם מיקרו צלחת על פי הוראות היצרנים.הגדר את רזולוציית הסריקה ל-84 מיקרומטר. איכות הסריקה לבינונית וההתמקדות מתקזזת בהתאם לגובה הבסיס של צלחת המיקרו 96 באר המשמשת. לחץ על כפתור התפריט Image Studio, לייצא תמונה עבור מדיה דיגיטלית, ולייצא את התמונות עם רזולוציה של 300 dpi בפורמט TIFF.פתח את התמונה ב- ImageJ Fiji. לפצל את ערוצי הצבע על ידי לחיצה על תפריט התמונה ולאחר מכן צבע, לפצל ערוצים. לאחר מכן פתח את מנהל ההשקעות מהניתוח, כלים.סמן את התיבה עבור תוויות במנהל ההשקעות, כדי לסווג את העיגולים עם מספרים. בערוץ 6 80, או בערוץ האדום, בחר את אזור העניין על-ידי בחירת הכלי עיגול וציור עיגול שמתאים במדויק לגם הראשון. לאחר מכן הקש Ctrl plus T וגרר את העיגול ל הבא.חזור על תהליך זה עד שכל בארות הם בעיגול. ממדד לחץ על מנהל ההשקעות. בחר את הערכים המופיעים והעתק אותם לגיליון כפולה.לאחר מכן לחצו על הערוץ הירוק והעבירו את ה-ROIs שנבחרו לתמונה. ממדד לחץ על מנהל ההשקעות. בחר את הערכים המופיעים והעתק אותם לגיליון כפולה.לאחר מכן לחשב את השינויים ביטוי קולטן פני השטח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בהליך זה ההתמדה של קשת בוויסות סחר בקולטן אמפא נבדק באמצעות סחר בקולטן אמפא תוכן גבוה ובדיקה. נוירונים מטופלים עם חוסם ערוץ נתרן יון TTX אשר מעכב את פוטנציאל הפעולה ומפחית את רמות הקשת.ואחריו DHPG אשר גורם תרגום קשת בכל מקום. הן פני השטח והן להפנים בריכות של gluA1 ו gluA2 המכילות תת-יוניקות קולטן apa נמדדו בחמש ורבע שעה לאחר שטיפת DHPG. נוירונים ArcKR להראות אנדוזיטוזיס gluA1 מוגברת כאשר מטופלים עם DHPG, לעומת נוירונים סוג בזמן.אפקט זה אינו נראה כאשר נוירונים מטופלים עם TTX בלבד. ביטוי פני השטח של gluA2 subunit גדל באופן משמעותי בנקודות זמן קצרות לעומת נוירונים מסוג wile. ציון החלפת תת-אחת פוטנציאלית.לבטח כי התאים הם paraformaldehyde קבוע illiquid צריך להיות מוכן טרי ביום הניסוי. יש לתקן מחדש תאים לאחר תיוג עבור קולטני פני השטח. שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה confocal יוכלו לספק רזולוציה חד תאית כדי לאפיין עוד יותר הקשורים השתנה במבנה העצבי לוקליזציה קולטן.שיבוש הדינמיקה הזמנית של קשת משנה את הסחר קולטני אמפא בתגובה MgluR מתווך בע"מ. כיוונים עתידיים יהיה למדוד אמפא קולטנים סחר בתגובה לגירויים אחרים. הבדיקה הזו אולי ניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, טיפולים וקולטנים אחרים, בתנאי שההליך מותאם בקפידה ומותקף כראוי.יש לנקוט בזהירות כדי להבטיח כי צפיפות התא, זמני הטיפול, שלבי קיבעון, שלבי permeabilization, בחירות reagent ממוטבים המערכת של עניין. להשלמה מוצלחת ויעילה של הבדיקה חשוב להכין את פתרון DHPG ואת 4%paraformaldehyde, 4% פתרון סוכרוז ביום הניסוי. שליטה מטופלים היטב עם vakeel או TTX נדרשים כדי להבטיח כי ההשפעות שנצפו הם ספציפיים לטיפול.זה גם קריטי לכלול בארות שטופלו רק בנוגדנים המשניים כדי לשלוט על פלואורסצנטיות רקע המיוצרת על ידי כריכה לא ספציפית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

תנועת העין ניטור של זיכרון

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...