Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
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ザカリー ・ アレンは、技術支援を感謝いたします。この作品は、ホワイト ホール財団 (グラント 2017年-05-35) によって支えられた、クレオン C. アーリントンの研究開始助成 (リグ-93) A.M.M マグと D.W.Y. の両方のジョージア州立大学ゲノミクス 2CI 交わりでサポートされていた。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージア州立大学によって承認されています。
1. (層流フード) で第一次海馬ニューロンの準備
<ol><li>分離混合セックス生後 (P) から一次海馬ニューロン 0 136前述したようにマウス。</li>
	<li>96 ウェル ポリ-D-リジン プレート ニューロンは、ウェルあたり 2 x 10 の4セルの密度でマイクロ プレートをコーティングしました。</li>
	<li>50 の 10 mL を追加することによって、ニューロンを供給するためのメディアの準備 B-27、グルタミン x 100 の 5 mL, 10 mg/mL 5-フルオロ-2 '-デオキシウリジン (FUDR) の 242 μ L と 10 x μ L 485 mL 神経メディア (材料の表を参照してください) にゲンタマイシンを 10 mg/mL の。</li>
	<li>フィード ニューロン前述36半分を削除することによって (100 μ L) 各ウェルから既存メディア (神経細胞の生存をサポートする成分が含まれているエアコンのメディアと呼ばれる) と 37 ° C の 100 μ L で交換の prewarmed メディア手順 1.3 の準備すべての 3-4 日。ステップ 2.3 の 4˚C でそれぞれの餌からエアコンのメディアを格納します。</li>
</ol>2. 人身売買 (層流フード) で DHPG への応答で AMPA 受容体の測定
<ol><li>一日で体外 (DIV) 14、準備細胞培養を使用して 2 mM の濃度で 500 μ L 在庫ソリューション テトロドトキシン (TTX) のグレードの水。 注意:TTX は神経毒です。慎重に扱うし、皮膚との接触を避けてください。</li>
	<li>マルチ チャンネル ピペットを使用すると、ニューロンの 96 ウェル マイクロ プレートの各ウェルから 100 μ L を削除し、メディアをプールします。</li>
	<li>TTX の 4 μ M 溶液を作成する 2.2 の段階からプールされた調節されたメディアの 1 mL に TTX ストック溶液 2 μ L を追加します。十分なプール付きのメディアが存在しない場合は、手順 1.4 からストアド エアコン メディアのいくつかを使用します。</li>
	<li>ステップ 2.3 から TTX の 4 μ M 溶液 100 μ L/ウェル ニューロンを扱います。4 h の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターでマイクロ プレートを配置します。</li>
	<li>パスツール ピペットのサクション ラインに、ピペットの先端を滅菌 200 μ L ピペット片方滅菌ガラスを取り付けます。まあ慎重にそれぞれからメディアを削除します。ニューロンがあるマイクロ プレートの底に触れないでください。</li>
	<li>各ウェルに室温神経メディアの 200 μ L を追加します。</li>
	<li>15 分インキュベーション 5% CO2が望ましいですが、必須ではありませんは、室温でマイクロ プレートを孵化させなさい。</li>
</ol>3. Immunolabelling (層流フード) で
<ol><li>神経のメディアにおける反 GluA1 または抗 GluA2 抗体の 1: 150 希釈を準備します。</li>
	<li>ステップ 2.6 で追加された神経のメディアを削除します。抗体の結合を許可する室温で 20 分間対応する井戸に反 GluA1 または抗 GluA2 抗体溶液の 50 μ L を追加します。二次抗体のみ制御井戸に神経メディアの 50 μ L を追加します。</li>
	<li>3.2 の手順で追加抗体ソリューションを削除します。任意の非連結の抗体を除去するため 100 μ L/ウェル室温神経メディアで 3 回マイクロ プレートを洗います。</li>
	<li>神経のメディアや細胞培養グレードの水 DHPG の 50 mM の原液を作る。渦簡潔に、DHPG を完全に解消するソリューション。実験の同じ日にこのソリューションの新鮮なを準備します。古いまたは解凍ソリューションを使用しないでください。</li>
	<li>1: 500 100 μ M の解決をするために神経のメディアで原液を希釈します。</li>
	<li>各ウェルから既存のメディアを削除します。ステップ 3.5 から 100 μ M DHPG 原液の 100 μ L/ウェルを追加します。マイクロ プレート 5% CO2の 37 ° C で 10 分間のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>3.6 の手順で追加 DHPG ソリューションを削除し、100 μ L/ウェル神経メディアを追加します。この手順をあと 1 回繰り返します。5% CO2の 37 ° C で 5 分間のインキュベーターでマイクロ プレートを配置します。</li>
	<li>実験の同じ日に PBS で 4 %paraformaldehyde/4% スクロース溶液にショ糖を追加します。古いまたは解凍ソリューションを使用しないでください。3.7 の手順で追加メディアを削除します。4 %paraformaldehyde/4% ショ糖溶液 100 μ L/ウェルを追加します。追加時期ごとに、手順 3.6-3.8.完了すると、20 分のための 4 ° C でマイクロ プレートを孵化させなさい。 注意:ヒューム フードのパラホルムアルデヒド株式を処理します。</li>
	<li>ステップ 3.8 から定着剤を削除し、100 μ L/ウェルの冷たい 1 x DPBS を追加します。</li>
	<li>DPBS を削除します。追加 150 μ L/ウェル バッファー (TBS で使用する準備ができての定式化は材料表を参照) をブロックまたは 90 分間室温でインキュベート、4 ° C で一晩インキュベート</li>
</ol>4. 表面の受容器のラベル
<ol><li>680RD ヤギの抗マウス IgG の抗体のブロック バッファー内の 1:1500 希釈を準備します。</li>
	<li>3.10 のステップからのブロック バッファーを削除します。二次抗体溶液 50 μ L/ウェルを加えて 60 分続ける二次抗体を追加したら、光から保護されているマイクロ プレートは室温で孵化させなさい。その後孵化中に光からマイクロ プレートを保護するために継続することを確認します。</li>
	<li>4.2 のステップからソリューションを削除します。100 μ L/ウェル TBS (50 mM トリス-HCl、150 mM の NaCl、pH 7.6) を追加し、5 分は、この手順を繰り返します 4 追加の時間のために、室温でインキュベートします。</li>
	<li>4.3 のステップから TBS を削除します。PBS で 4 %paraformaldehyde/4% ショ糖の 100 μ L/ウェルを追加し、15 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>4.4 ステップからソリューションを削除します。100 μ L/ウェル TBS を追加し、5 分繰り返しこの手順 2 の追加時間の室温でインキュベートします。</li>
</ol>5. 内面化された受容体人口のラベリング
<ol><li>0.2% サポニンを含む TBS を準備します。渦サポニン粉末を完全に溶解を簡単に解決します。自動蛍光を引き起こす可能性のある粒子を除去する 0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。</li>
	<li>150 μ l 添加 TBS 0.2% サポニンを含むと 15 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>サポニンのソリューション ステップ 5.2 から削除し、150 μ L/ウェル ブロック バッファーを追加します。90 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>800CW ロバ抗マウス igg 抗体二次抗体ブロッキング バッファー内の 1:1500 希釈を準備します。</li>
	<li>ステップ 5.3 からブロック バッファーを削除し、二次抗体溶液 50 μ L/ウェルを追加します。60 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>100 μ L/ウェル TBS を追加し、5 分繰り返しこの手順 4 の追加時間の室温でインキュベートします。</li>
</ol>6. 画像処理と解析
<ol><li>製造元の指示に従ってシステムをイメージング赤外線レーザを用いた 96-well マイクロ プレートをイメージします。84 μ m、媒体、フォーカスを 96 ウェル マイクロ プレート使用の基準の高さによるとオフセット スキャン品質のスキャン解像度を設定します。「イメージ スタジオ」メニュー ボタン → をクリックしてエクスポート → TIFF 形式で、300 dpi の解像度でデジタル メディア → エクスポート画像のイメージ。</li>
	<li>Https://imagej.net/Fiji/Downloads でイメージ J「フィジー」をダウンロードします。</li>
	<li>画像 J「フィジー」で画像を開く。「イメージ」メニューをクリックしてしてカラー チャンネルを分割 色 → チャンネルの分割。</li>
	<li>「分析」→「ツール」から ROI マネージャーを開きます。数字とサークルをラベルする ROI マネージャーで「ラベル」ボックスを確認します。</li>
	<li>赤のチャネル (680 nm 表面受容体プール) で、[円] ツールを選択し、最初の井戸を正確に収まる円を描いて、関心領域 (ROI) を選択します。Ctrl キーを押しながら T キーを押します。</li>
	<li>まあ次の円をドラッグし、Ctrl + t. 繰り返しを押してすべての井戸が囲んでいます。</li>
	<li>ROI マネージャーから「メジャー」をクリックします。表示され、スプレッドシートにコピーする値を選択します。</li>
	<li>グリーン チャンネル (800 nm 受容体の内部プール) をクリックし、イメージに手順 6.6 から選択した Roi を転置します。ROI マネージャーから「メジャー」をクリックします。表示され、スプレッドシートにコピーする値を選択します。</li>
	<li>井戸を制御するだけセカンダリから統合された密度の平均値を計算します。表面受容体プールの平均のセカンダリのみ統合制御の密度の値から各実験も統合密度値を減算します。内部の受容体プールのこの手順を繰り返します。</li>
	<li>Rの/RtRsは、表面の受容器の集積密度を表す Rtを表す表面の受容器の集積密度 + の集積密度を用いた表面受容体発現の変化を計算します。内部の受容体。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

AMPA 受容体は、シナプス形成、シナプスの安定性、可塑性など神経の機能に不可欠ですがイオン型グルタミン酸受容体サブタイプです。AMPA 受容体の破壊は複数の神経疾患24にリンクされているし、魅力的な薬目標40。たとえば、研究では、アルツハイマー病 (AD) の初期の兆候の一つがシナプス損失し、シナプス AMPA 受容体レベル41,42の減少を示しています。興味を持って、アミロイド β オリゴマーの添加は、シナプス43で表面の GluA1 含む AMPA 受容体の発現を損ないます。さらに、てんかん発作重積状態を下降調節 GluA2 mRNA および蛋白質海馬ニューロン44彼らの死の前に。筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、タール DNA 結合タンパク質 (TDP-43) 病理学、ALS の分子異常、非効率的にリンクされている GluA2 Q/R サイト RNA 編集をしている45。
高コンテンツ AMPA 受容体輸送アッセイは、受容体応答をはるかに少ない時間と代替方法よりも材料を消費して、さまざまな要因での神経ネットワーク内で人身売買プロファイル一括変更を測定するための効果的な手段を提供します。単一の 96 ウェル マイクロ プレートは、複数技術を複製し、同じプレートに異なる実験条件の制御を実行する多数の井戸を提供します。2 x 104 5 x 10 の5細胞/ウェル密度に関連して細胞/ウェルの低いめっき密度動物や各実験 (図 1) に必要な材料の数が激減します。赤外線スキャナーは、同時に最大六つの 96 ウェル マイクロ プレートを映すことができます。入手が困難または文化 (例えば人間のサンプル、誘導多能性幹細胞) に高価な貴重なサンプルの分析を実行する場合に特に貴重になる 384 ウェル マイクロ プレート46に、アッセイを変更もできます。全体アッセイを完了し、分析し、同じ日に、(図 1) の貴重な時間を節約することができます。
アッセイの正常な完了、いくつかの点は考慮する必要があります。まず、神経治療の同じ日に DHPG ソリューションを準備することが重要です。再利用、DHPG 株を凍結したりしないでください。PBS 溶液中 4 %paraformaldehyde/4% ショ糖もしなければならない新鮮な実験の同じ日に。第二に、制御井戸処理 TTX のみまたは車両が見られる効果が治療に固有であることを確認する必要。また、井戸の非固有のバインディングによって生成された背景の蛍光性のコントロールに対する二次抗体のみで治療を含めることが重要です。2 番目の固定ステップ (二次抗体の次ウォッシュ アウト) は二次抗体の背景の影響を減らすと受容体サブユニットの効果的な分類を達成するための鍵であることに注意。
妥協と制限、任意のメソッドと同様存在します。この試金は単一セル (または細胞) の解像度を提供しません、他方法32,33,35のような人身売買受容体の実時間追跡を許可しません。さらに、適切な注意が必要、ニューロンの透過の段階としてこのメソッドは過透過の場合細胞内成分の漏洩に敏感になります。

大きさと神経細胞の興奮のダイナミクスは、可用性と電気信号を変換する表面受容体集団の構成に大きく依存。専用の遠藤と既存の受容体の分泌細胞機械装置のホストが彼らの高速な挿入の手段を提供する新たな受容体 (または受容体サブユニット) の合成は精力的にかかると比較的長引くプロセスでは一般的に、除去膜1から。したがって、受容体の転写と翻訳の規制に加えて、神経細胞の興奮の重要な変調器には翻訳受容体トラフィッ キングです。
シナプス可塑性や経験と、ニューロン間の接続に変化する強度は学習およびメモリの2,の3の基礎を形作ると考えられます。長期増強 (LTP) や長期抑圧 (LTD) と呼ばれる時間をかけて、シナプスの弱体化と強化, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体の人身売買を変調することができます。4,5. AMPA 受容体は、heterotetramers (GluA1 4)、4 つのサブユニットから成る脳の6高速興奮性シナプス伝達の大半を仲介します。したがって、ニューロン興奮性は大部分に AMPA 受容体シナプス表面のグルタミン酸によってアクティブにする使用可能な量の関数であります。LTP は主に AMPA 受容体分泌の増加に関連付けられているに対し、LTD は一般的 AMPA 受容体エンドサイトーシスの増加に関連付けられて。AMPA 受容体のシナプス表面発現分泌蛋白質、カルシウム依存的7,8,9,のどこ、細胞膜との融合が発生したエンドソーム配信が必要です。10,11,12,13,14. 活動依存的 AMPA 受容体のエンドサイトーシスを制御するメカニズムのホストも存在します。これの 1 つの例は即時の早い遺伝子アーク/Arg3.1 (アーク) を経由です。代謝型グルタミン酸受容体 (mGluR) を仲介する他の関数の15日間でアークは知られている-結合パートナー、エンドサイトーシス蛋白質 AP 2、エンドフィリン-3 ダイナミン 2 などを通じて AMPA 受容体のエンドサイトーシスを促進することによって依存 (株)16,17,18,19、クラスリン被覆ピット20,21です。内面化された AMPA 受容体は細胞膜に戻ってリサイクルまたは、劣化22,23のために充当できます。
重要なは、AMPA の受容器の亜単位の構成は、人身売買のダイナミクス24に貢献します。主要な関連の翻訳後修飾と人身売買関連蛋白質の相互作用の大半が発生する、サブユニットの細胞内 C 末端ドメインです。GluA1 と GluA4 サブユニットを含む AMPA 受容体人身売買されている細胞表面に LTP、中に一部 PDZ リガンド、様々 な PDZ との相互作用を介してアンカー膜を促進する 〜 90 アミノ酸配列の存在のために特にがちであります。ドメインを含むタンパク質25,26。その一方で、AMPA 受容体 GluA2 を含む、GluA1、または GluA4 に欠ける恒常取り引きされるが、シナプス活動27と細胞内に蓄積する傾向にあります。GluA2 サブユニット RNA 編集、28の小胞体に保持の促進に加えてレンダリング チャネルの気孔カルシウム29、不浸透性でありさらにサブユニット固有神経の重要な因子として人身売買関与を受ける恒常性と可塑性。興味深いことに、ユビキチン依存性アーク劣化の中断は GluA1 エンドサイトーシスと mGluR アゴニスト群選択と mGluR 株式会社の誘導後の GluA2 サブユニットを含む AMPA 受容体の発現を増加が示されています。(S) - 3, 5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG)、メカニズムとサブユニット固有 AMPA 受容体人身売買30の役割について学んだこと多く残っていることを示します。
表面受容体発現の変化を観察するためメソッド煩雑で時間がかかり、多くの場合、または不要な紹介を困惑させます。ビオチンに基づく試金、普及し、商業的に利用可能なアプローチです。ビオチン化表面受容体の親和性の浄化などの 1 つの例を表しますは、しかし、電気泳動の実行の必要性サンプル材料の大きい量を必要とし、非常に長い複数の治療法のスクリーニングをレンダリングできます。31を処理します。最初の信号の漸進的な劣化を定量化するラベルと immunoprecipitations の複数の時間ポイントを実行する、このアッセイの拡張機能は同様に新しい添加を無視- やリサイクル-受容器細胞の表面だけを悪化させる時間と材料の要件。
他のアプローチはキメラ コンストラクトの使用または受容体人身売買32を観察する蛍光タグの追加、セル画像33,34の時にライブを使用します。一方、強力なこれらのデザイン受容体の突然変異またはこれらのタンパク質に導入された分子の重量の劇的な変化のための正常な人身売買パターンに影響します。ラベル低 pH34,35をターゲットによって細胞内コンパートメントは非固有であり、異なる細胞内コンパートメント人身売買 (例えば.のリソソームの受容体の重要な区別を作る染料の使用プロテアソーム) 困難であります。最後に、人身売買とエンドソーム タンパク質やクラスリンなど、潜在的に特定のローカリゼーションの有用な洞察を提供しながらの劣化と関連するマーカーを持つ受容体の共存を視覚化する共焦点顕微鏡を使用細胞内の解像度は、時間、手間、費用のために各セルと共焦点の要件を個別に分析する必要性や超解像顕微鏡法。
ここでは、初代神経細胞培養の準備30と互換性のある高コンテンツ受容体人身売買法を示す.このメソッドは、別々 に正規化された表面または内面化された受容体密度とその受容体の全体的な密度の比率としてデータのプレゼンテーションを有効にする固定のニューロンの表面と細胞内受容体プールをラベル付けします。このメソッドの高自然複数の治療および/または短いタイム フレームで遺伝子をスクリーニングに最適です、唯一の標準細胞培養と抗体インキュベーションの専門知識が必要があります。
簡潔に、一次ニューロンは標準の 96 ウェル マイクロ プレートで栽培実験デザインによって決定として扱われ、一次抗体の孵化、洗浄、固定します。細胞に続き、別の固定ステップの表面の受容器のラベルに二次抗体と、孵化します。透過し発生し、2 番目の二次抗体は内部受容体プールをラベルとして使われます。最後に、細胞は、各受容体人口の集積密度を定量化する蛍光マイクロ プレートの赤外線スキャナーを使用して作成されます。図 1は、伝統的なビオチン化アッセイと比較して我々 の高いコンテンツ分析をまとめたものです。
プロトコルは、ここでは最適化とプライマリの海馬ニューロンの文化で人身売買 AMPA 受容体の特定を提供して、この手順、理論的には、拡張でき様々 な種類の細胞の異なる受容体に適応。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

シナプス後受容器細胞の表面との間の売買は、ニューロンは、さまざまな刺激に敏感さを調節する重要なメカニズムです。ニューロンの速い興奮性シナプス伝達の責任ですが、α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容は、神経細胞の興奮を動的に変更するシナプスの表面との間に人身売買します。AMPA 受容体トラフィッ キング シナプス可塑性のため不可欠ですし、神経疾患で破壊することができます。ただし、受容体トラフィッ キングを定量化するための一般的なアプローチは、全体の受容体プールを無視するが過度に時間と労働集約的な通常の人身売買メカニズムが中断される可能性やその結果データの解釈を複雑にします。デュアル蛍光反応と近赤外蛍光 96 ウェル マイクロ プレート レーザスキャナーを用いた培養一次海馬ニューロンの表面と内部の両方の AMPA 受容体集団の定量化のための高コンテンツ分析を提案します。このアプローチは、一括内面の迅速なスクリーニングを容易に、サンプル材料を最小限に抑えながら受容体密度の表面。ただし、手法には、単一セルの解像度を取得または生きているセルイメージ投射を行うに制限があります。最後に、このプロトコルは、他の受容体と異なったセルタイプに適切な調整と最適化を提供を受けやすい可能性があります。

アーク/Arg3.1 は、,AP 2、エンドフィリン 3 とダイナミン 21618 mGluR 活性化37次との対話を通じて AMPA 受容体のエンドサイトーシスを加速します。アーク ノックイン マウス (ArcKR)、リシン 268 とアーク蛋白質 269 はアルギニン、アークのユビキチン化を妨害する突然変異されます。これはアークのプロテアソーム依存転換を損なうし、ニューロン21,30でその半減期を延長します。この実験高コンテンツ AMPA 受容体輸送アッセイを用いた AMPA 受容体トラフィッ キングの調節にアークの持続性を検討しました。ニューロンは、Na+拮抗活動電位を抑制するとアーク レベル38アークの翻訳とユビキチン化37,39を誘導する DHPG 続いて TTX と扱われました。表面や内面のプールの GluA1-の両方 (図 2 a) (図 3 a) を GluA2 含む AMPA 受容体サブユニットを DHPG ウォッシュ後 5 〜 15 分で測定しました。この実験は、3 の独立した実験から 3 つの技術的な複製を使用します。ArcKR ニューロンを示した増加 GluA1 エンドサイトーシス DHPG に比べて WT ニューロン、ニューロンは TTX のみ (図 2 b) と扱われたとき見られなかった効果で処理します。GluA2 サブユニットの発現を示す潜在的なサブユニット交換30WT ニューロン (図 3 b) と比較して短時間ポイントで有意に増加しました。いくつかの井戸は、非特異的な結合によるバック グラウンド蛍光を制御するだけの二次抗体と扱われました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> 図 1: 受容体ビオチン化アッセイに AMPA 受容体高コンテンツ人身売買法の比較。高コンテンツ人身売買アッセイは、時間と標準のビオチン化アッセイと比較してリソースを消費します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> 図 2: WT ・ ArcKR の海馬ニューロンにおける GluA1 AMPA 受容体サブユニットの表面および内部の集団。(A) 表面 (sGluA1) と内面 (iGluA1) GluA1 含む AMPA 受容体サブユニット DHPG ウォッシュ後 5 〜 15 分で WT と ArcKR の海馬ニューロンで。ArcKR ニューロン WT と比較して、DHPG ウォッシュ後 AMPA 受容体の sGluA1 を含むプール 5、15 分でさらに減少があります。(B) グラフは、合計蛍光強度に正規化された表面の蛍光を表します。統計上の比較は、一方向の分散分析、ペアとペアになっていない学生の t テストを使用して行われました。p ≦ 0.05;n = 3 の独立した実験から技術的なレプリケートします 3。値は平均 ± SEM. を表しますこの図は、m. j. ら 201830の壁から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> 図 3: WT ・ ArcKR の海馬ニューロンにおける GluA2 AMPA 受容体サブユニットの表面および内部の集団。(A)図 2と同じ実験条件。重量と比較して、ArcKR ニューロン増加している sGluA2 を含む AMPA 受容体プール 5 分で DHPG ウォッシュ後。(B) グラフは、合計蛍光強度に正規化された表面の蛍光を表します。統計上の比較は、瞳孔、対と対になっていない学生の t テストを使用して行われました。p ≦ 0.05;n = 3 の独立した実験から技術的なレプリケートします 3。値は平均 ± SEM. を表しますこの図は、m. j. ら 201830の壁から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

神経細胞の興奮は、遠藤の動的過程と興奮性イオン型グルタミン酸受容体の開口放出を変調することができます。表面と内部の受容体人口プールを定量化するためのアクセス可能な高アッセイは、ここで説明しました。

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

ここでは、一次神経培養準備に適合する高含有受容体の入稿アッセイを示す。この方法は、表面に固定ニューロンのセラー間受容体プールを別々に標識する。その受容体の全体的な密度に対する正規化された表面または内在化された受容体密度の比率としてのデータの提示を可能にする。高い含有量および受容体の密売アッセイは、様々な要因に応答してニューラルネットワーク内の受容体の密売プロファイルのバルク変化を測定するための効果のある手段を提供する。代替方法よりもはるかに少ない時間と材料を消費します。破壊やプリセプターの人身売買は、複数の神経疾患に関連しており、薬物療法の魅力的な標的と考えられています。例えば研究は、アルツハイマー病の最も初期の兆候の1つはシナプス損失と減少シナプスおよびプリセプタープールであることを示しています。この手法では、さまざまな難易度の多くの異なる手順が必要です。特に、96ウェルプレートを扱い、井戸を操作することは、経験のない人にとっては難しいことが証明されるからです。実験の結果は不適切な処理に対して非常に敏感であるため、実行されるさまざまな手順を確認すると便利です。講師 開始するには、各ウェルから既存の培地の 100 マイクロリットルを除去することにより、96 ウェルプレートのニューロンを供給します。そして、摂氏37度に予温された100マイクロリットルのメディアに置き換えます。3~4日おき。1日のvitro 14では、マルチピペットを使用して各井戸から100マイクロリットルのメディアを取り除き、メディアをプールする。2マイクロリットルのTTXストック溶液をプールされたコンディショムメディアの1ミリリットルに加え、TTXの4マイクロモル溶液を作成します。4マイクロモルTTX溶液の100マイクロリットルで各ウェルのニューロンを治療します。プール条件メディアが十分でない場合は、以前に保存されたメディアの一部を追加します。摂氏37度で5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートします。この後、既存のTTX含有培地を除去し、200マイクロリットルの予め温めた神経培地を加え、マイクロプレートを室温で15分間インキュベートする。まず、マイクロプレートから神経培地を取り出します。マイクロプレートの対応するウェルに抗gluA1または抗gluA2抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。2次抗体の制御ウェルにのみ50マイクロリットルの神経培地を加えます。抗体結合を可能にするために室温で20分間インキュベートする。この後、既存のメディアを井戸から削除します。マイクロプレートを1ウェルあたり100マイクロリットルの室温ニューロン培地で3回洗浄し、非結合抗体を除去します。その後、DHPGストック溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加えます。摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで10分間インキュベートします。次に、DHPG溶液を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルの神経培地を加えます。このプロセスをもう一度繰り返します。その後、5%の二酸化炭素インキュベーターを摂氏37度で5分間インキュベートします。実験の日に4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースNPBSの溶液を準備します。各ウェルから培地を取り出し、パラホルムアルデヒドとスクロース溶液の100マイクロリットルに交換します。追加する時間ポイントごとにこのプロセスを繰り返します。マイクロプレートを摂氏4度で20分間インキュベートします。その後、固定剤を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルのDPBSを加えます。DPBSを取り外し、各ウェルに150マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。室温で90分間インキュベートします。ブロッキングバッファーを取り外し、各ウェルに2次抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。プレートを光から保護したまま、室温で60分間インキュベートします。抗体溶液を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加えます。室温で5分間インキュベートします。このプロセスを繰り返し、TBSを添加するウェルから培地を取り出し、室温で4回インキュベートする。この後、マイクロプレートからTBSを取り出します。各ウェルに4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースの溶液の100マイクロリットルを追加します。室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加え、室温で5分間インキュベートします。この手順を 2 回繰り返します。まず、2%サポニンを含むTBSの溶液を調製し、溶液をボルテックス溶液を短時間で調製し、サポニン粉末を完全に溶解させた。2マイクロメートルのフィルターを使用して、自己蛍光を引き起こす可能性のある粒子を除去するために溶液をフィルターします。この2%サポニン溶液を150マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートします。次いでサポニン溶液を取り出し、各ウェルに150マイクロリットルのブロッキングバッファーを加える。室温で90分間インキュベートします。この後、ブロッキングバッファーを取り除き、各ウェルに2次抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。室温で60分間インキュベートします。その後、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加え、室温で5分間インキュベートします。このプロセスを繰り返し、TBSを加え、室温で4回インキュベートします。赤外線レーザーイメージングシステムを使用して、メーカーの指示に従って96ウェルマイクロプレートをイメージします。スキャン解像度を84マイクロメートルに設定します。使用される96ウェルマイクロプレートのベース高さに応じたスキャン品質と焦点オフセット。イメージスタジオメニューボタンをクリックし、デジタルメディア用の画像をエクスポートし、300 dpi の解像度でTIFF形式で画像をエクスポートします。イメージをイメージ J フィジーで開きます。画像メニューをクリックしてカラーチャンネルを分割し、チャンネルを分割してカラーを表示します。次に、分析ツールからROIマネージャを開きます。数字で円を分類するには、ROI マネージャのラベルのチェックボックスをオンにします。6 80(または赤いチャネル)で、円ツールを選択し、最初のウェルに正確にフィットする円を描くことによって、対象領域を選択します。次に、Ctrl キーを押しながら T キーを押し、円を次のウェルにドラッグします。すべてのウェルが丸で囲まれるまで、このプロセスを繰り返します。ROI マネージャーからメジャーをクリックします。表示される値を選択し、スプレッドシートにコピーします。次に、緑色のチャンネルをクリックし、選択したROIを画像に移調します。ROI マネージャーからメジャーをクリックします。表示される値を選択し、スプレッドシートにコピーします。この後、テキストプロトコルで概説されているように表面受容体の発現を計算します。この手順では、アンパ受容体の密売を調節する際のアークの持続性を高含量アンパ受容体の人身売買およびアッセイを用いて検討する。ニューロンは、作用電位を阻害し、アークレベルを低下させるナトリウムイオンチャネルブロッカーTTXで処理されます。続いて、アーク翻訳とユビキチン化を誘導するDHPGが続く。アパ受容体サブユニットを含むgluA1およびgluA2の表面および内在化プールの両方を、DHPG洗浄後5分および15分で測定した。ArcKRニューロンは、タイプニューロンの間に比べて、DHPGで治療するとグルA1エンドシトーシスの増加を示す。この効果は、ニューロンがTTXのみで処理される場合には見られない。gluA2サブユニットの表面発現は、ワイル型ニューロンと比較して短い時点で有意に増加する。サブユニットの置換候補を示します。細胞が液体でない固定パラホルムアルデヒドであることを保証し、実験の日に新鮮な準備をする必要があります。細胞は、表面受容体の標識後に再固定する必要があります。共焦点顕微鏡のような他の方法は、ニューロン構造および受容体の局在化における関連する変化をさらに特徴付けるために単一細胞化分解能を提供することができる。アークの時間的ダイナミクスを破壊すると、MgluR媒介LTD.の将来の方向は、他の刺激に応答して密売するアンパ受容体を測定することである。このアッセイは、処置が慎重に調整され、適切に検証されることを条件として、他の細胞タイプ、治療および受容体に適応可能である可能性がある。細胞密度、処理時間、固定ステップ、透過性ステップ、試薬選択が目的のシステムを最適化されるように注意する必要があります。アッセイの成功と効率的な完了のためには、実験の日にDHPG溶液と4%パラホルムアルデヒド、4%スクロース溶液を調製することが重要です。観察された効果が治療に特異的であることを確認するために、バキールまたはTTXでよく処理されたコントロールが必要です。また、非特異的結合によって産生されるバックグラウンド蛍光を制御するために二次抗体のみで処理されたウェルを含めることも重要です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

メモリの眼球運動のモニタリング

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッキング