Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Vi takker Zachary Allen for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Cleon C. Arrington forskning innvielsen Grant Program (RIGG-93) å A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. ble begge støttet av en Georgia State University Neurogenomics 2CI fellesskap.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Georgia State University.
1. forberedelse av primære hippocampus nerveceller (i laminær strømning Hood)
<ol><li>Isolere primære hippocampus neurons fra blandet sex postnatal dag (P) 0-1 mus som tidligere beskrevet36.</li>
	<li>Plate nerveceller i 96-brønnen poly-D-lysine belagt microplates på en tetthet av 2 x 104 celler per brønn.</li>
	<li>Forberede medier fôring neurons ved å legge 10 mL av 50 x B-27, 5 mL av 100 x glutamin, 242 µL av 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) og 10 µL av 10 mg/mL Gentamycin til 485 mL neuronal media (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Feed nerveceller som tidligere beskrevet36 ved å fjerne halvparten (100 µL) av eksisterende media (referert til som betinget media, som inneholder bestanddeler som støtter neuronal overlevelse) fra hver brønn og erstatte med 100 µL av 37 ° C prewarmed media utarbeidet i trinn 1.3 hver 3-4 dager. Lagre betinget media fra hver fôring på 4 ˚c høyere trinn 2.3.</li>
</ol>2. måle AMPA reseptor menneskehandel som svar på DHPG (i laminær strømning Hood)
<ol><li>På dagen i Vitro (DIV) 14, forberede en 500 µL lagerløsning av Tetrodotoxin (TTX) i en konsentrasjon av 2 mM bruker cellekultur klasse vann. Forsiktig: TTX er en neurotoxin. Håndtaket forsiktig og unngå hudkontakt.</li>
	<li>Bruke en flerkanals pipette, fjerne 100 µL fra hver brønn i 96-brønnen microplate av neurons og basseng media.</li>
	<li>Legge til 2 µL av TTX lager løsning 1 mL av grupperte betinget media fra trinn 2.2 å lage en 4 µM løsning av TTX. Hvis det ikke er nok gruppert betinget media, deretter bruke noen av de lagrede betinget mediene fra trinn 1.4.</li>
	<li>Behandle neurons med 100 µL/vel av 4 µM løsningen av TTX fra trinn 2.3. Sett microplate i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C 4 h.</li>
	<li>Knytte et sterilt glass Pasteur Pipetter til sugekraft linje og legge en steril 200 µL pipette slutt til spissen av pipette. Fjern utskriftsmaterialet fra hver også nøye. Unngå å berøre bunnen av microplate hvor neurons er plassert.</li>
	<li>Legge til 200 µL romtemperatur neuronal medier i hver brønn.</li>
	<li>Inkuber microplate ved romtemperatur for 15 min. inkubasjon 5% CO2 er foretrukket, men ikke nødvendig.</li>
</ol>3. Immunolabelling (i laminær strømning Hood)
<ol><li>Klargjør en 1:150 fortynning av anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistoffer i neuronal medier.</li>
	<li>Fjerne neuronal media lagt til i trinn 2.6. Legge til 50 µL av anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistoff løsninger tilsvarende brønner for 20 min ved romtemperatur å tillate antistoff binding. Legge til 50 µL av neuronal media sekundære antistoff bare kontroll brønnene.</li>
	<li>Fjerne antistoff løsningene la til i trinn 3.2. Vask microplate 3 ganger med 100 µL/vel romtemperatur neuronal media å fjerne en ubundet antistoffer.</li>
	<li>Foreta en 50 mM lager løsning av DHPG i neuronal media eller celle kultur klasse vann. Vortex løsningen kort for å fullstendig løse opp DHPG. Klargjør denne løsning frisk på samme dag av eksperimentet. Unngå å bruke gamle eller tinte løsninger.</li>
	<li>Fortynne lager løsningen i neuronal medier til 1:500 å lage en 100 µM løsning.</li>
	<li>Fjern eksisterende media fra hver brønn. Legge til 100 µL/vel 100 µM DHPG lager løsningen fra trinn 3.5. Inkuber microplate i kuvøse på 37 ° C i 5% CO2 i 10 min.</li>
	<li>Fjern DHPG løsningen la til i trinn 3.6 og legge 100 µL/vel neuronal media. Gjenta dette trinnet en gang. Plasser microplate i kuvøse på 37 ° C i 5% CO2 i 5 min.</li>
	<li>Legg sukrose å gjøre 4% paraformaldehyde/4% sucrose løsning i PBS på samme dag av eksperimentet. Unngå å bruke gamle eller tinte løsninger. Fjern mediene la til i trinn 3.7. Legg 100 µL/godt av 4% paraformaldehyde/4% sucrose løsning. Gjenta trinn 3.6-3.8 for hver ekstra tidspunkt. Når fullført, ruge microplate på 4 ° C for 20 min. Forsiktig: Håndtere paraformaldehyde aksjer i avtrekksvifte.</li>
	<li>Fjern bindemiddel fra trinn 3.8 og tilsett 100 µL/godt av kaldt 1 x DPBS.</li>
	<li>Fjern DPBS. Legge til 150 µL/vel blokkerer buffer (klar til bruk formulering i SS, se Tabellen for materiale) og ruge ved romtemperatur for 90 min. Alternativt, ruge over natten på 4 ° C.</li>
</ol>4. merking overflate reseptorer
<ol><li>Klargjør en 1:1500 fortynning av 680RD geit anti-musen IgG sekundære antistoffer blokkere buffer.</li>
	<li>Fjerne blokkering buffer fra trinn 3.10. Legg til 50 µL/vel av sekundær antistoff løsningen og ruge ved romtemperatur for 60 min. holde microplate beskyttet fra lys når sekundær antistoffer er lagt. Sørg for å beskytte microplate fra lys under påfølgende incubations.</li>
	<li>Fjerne løsningen fra trinn 4.2. Legg 100 µL/vel TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6) og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 4 ganger.</li>
	<li>Fjerne TBS fra trinn 4.3. Legg 100 µL/vel av 4% paraformaldehyde/4% sukrose i PBS og ruge ved romtemperatur i 15 min.</li>
	<li>Fjerne løsningen fra trinn 4.4. Legg 100 µL/vel TBS og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 2 ganger.</li>
</ol>5. merking befolkningen internalisert reseptor
<ol><li>Forberede TBS inneholder 0,2% saponin. Vortex løsningen kort for å fullstendig løse opp pulveret saponin. Filtrere løsningen ved å benytte et 0,2 µm filter fjerner partikler som kan auto-fluorescens.</li>
	<li>Legge til 150 µL TBS inneholder 0,2% saponin og ruge ved romtemperatur i 15 min.</li>
	<li>Fjern saponin løsning fra trinn 5.2 og legge 150 µL/vel blokkerer buffer. Inkuber ved romtemperatur for 90 min.</li>
	<li>Klargjør en 1:1500 fortynning av 800CW esel anti-musen IgG sekundære antistoffer blokkere buffer.</li>
	<li>Fjern blokkering buffer fra trinn 5.3 og legge 50 µL/vel av sekundær antistoff løsningen. Inkuber ved romtemperatur for 60 min.</li>
	<li>Legg 100 µL/vel TBS og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 4 ganger.</li>
</ol>6. bildebehandling og analyse
<ol><li>Bildet i 96-brønnen microplate ved hjelp av en infrarød laser imaging i henhold til produsentens instruksjoner. Angi skanneoppløsningen 84 µm, skannekvaliteten medium og fokus motposteres i samsvar med base høyden på 96-brønnen microplate brukes. Klikk på "Bilde Studio" meny-knappen → eksportere → bilde for digitale medier → eksport bilder med en oppløsning på 300 dpi, i TIFF-format.</li>
	<li>Last ned bilde J "Fiji" på https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Åpne bilde i bilde J "Fiji". Dele fargekanaler ved å klikke på "Bilde"-menyen → Split fargekanaler.</li>
	<li>Åpne ROI manager fra "Analysere" → "verktøy". Merk av for "Merkelapper" i Avkastningen manager Merk sirkler med tall.</li>
	<li>I rødt kanal (680 nm overflaten reseptor bassenget), Velg Region av interesse (ROI) ved å velge sirkelverktøyet og tegne en sirkel som passer nøyaktig den første brønnen. Trykk Ctrl + T.</li>
	<li>Dra sirkelen til neste godt og trykk Ctrl + T. Gjenta til alle brønnene er sirklet.</li>
	<li>ROI manager, klikk "Tiltak". Velg verdiene som vises, og kopiere dem til et regneark.</li>
	<li>Klikk på den grønne kanalen (800 nm interne reseptor bassenget) og deretter transponere de valgte ROIs fra trinn 6.6 til bildet. ROI manager, klikk "Tiltak". Velg verdiene som vises, og kopiere dem til et regneark.</li>
	<li>Beregne gjennomsnittlig integrert tetthet verdiene fra sekundære bare kontrollere brønner. Trekke integrert tetthet verdiene for hver eksperimentelle godt fra sekundær bare kontroll integrert tetthet gjennomsnittsverdiene for overflate reseptor bassenget. Gjenta dette trinnet for interne reseptor bassenget.</li>
	<li>Beregne endringer i overflaten reseptor uttrykk bruker Rs/rt, der Rs representerer integrert tetthet overflate reseptorer og Rt representerer integrert tetthet overflate reseptorer + integrert tetthet intern reseptorer.</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

AMPA reseptorer er en ionotropic glutamat reseptor undertype som er integrert for neuronal funksjoner inkluderer synapse formasjon, synapse stabilitet og synaptiske plastisitet. AMPA reseptor avbrudd er koblet til flere nevrologiske lidelser24 og betraktes attraktive narkotika mål40. For eksempel har studier vist at en av de tidligste tegnene på Alzheimers sykdom (AD) synapse tap og redusert synaptic AMPA reseptor nivåer41,42. Intriguingly, svekker tillegg av Amyloid-ß oligomers overflate GluA1 inneholder AMPA reseptor uttrykk synapser43. Videre regulerer status epilepticus ned-GluA2 mRNA og protein i hippocampus neurons før deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-spesifikke molekylær abnormitet, har vært knyttet til ineffektiv GluA2 Q/R området-RNA redigering45.
Høyt innhold AMPA reseptor menneskehandel analysen gir et effektivt middel for å måle masseendringer i reseptor menneskehandel profiler innenfor et nevrale nettverk svar på ulike faktorer, forbruker mye mindre tid og materialer enn alternative metoder. En enkelt 96-brønnen microplate gir mange brønner for å kjøre flere tekniske replikerer og kontrollerer for ulike eksperimentelle forhold i samme plate. Lav plating tetthet 2 x 104 celler/godt i forhold til 5 x 105 celler/vel tetthet reduserer antall dyr og materialer kreves for hvert eksperiment (figur 1). Infrarød skanneren kan bildet opptil seks 96-brønnen microplates samtidig. Analysen kan også endres til en 384-vel microplate46, som blir spesielt verdifull hvis analysen kjøres på dyrebare prøver som er vanskelig å få eller er dyrt å kultur (f.eks menneskelige prøver og indusert pluripotent stamceller). Hele analysen kan fullført og analyseres på samme dag, som sparer verdifull tid (figur 1).
For vellykket og effektiv gjennomføring av analysen må noen punkter vurderes. Først er det viktig å forberede DHPG løsningen på samme dag av Nevron. Ikke gjenbruk eller fryse DHPG aksjer. 4% paraformaldehyde/4% sukrose i PBS løsning bør også gjøres frisk på samme dag av eksperimentet. Andre kontroll brønner behandlet med TTX bare eller kjøretøy er nødvendig å sikre at effektene observert er spesifikke for behandling. Det er også viktig med brønner behandlet med bare de sekundære Antistoffene mot kontroll for bakgrunnen fluorescens produsert av ikke-spesifikk bindende. Merk at andre fiksering trinn (følgende bleke av sekundær antistoffer) er nøkkelen til å redusere sekundære antistoff bakgrunn effekter og oppnå effektiv merking av reseptor underenheter.
Kompromisser og begrensninger, eksisterer som med enhver metode. Denne analysen gir ikke encellede (eller subcellular) og tillater ikke sanntidssporing reseptoren menneskehandel som andre metoder32,33,35. I tillegg må riktig omsorg tas under permeabilization trinnet av neurons, som denne metoden vil være følsomme for lekkasje av intracellular komponentene i over permeabilization.

Størrelsen og tidsmessige dynamikken i neuronal excitability er i stor grad avhengig av tilgjengelighet og sammensetningen av overflaten reseptor populasjoner som transduce elektrokjemiske signal. Mens syntese av ny reseptorer (eller reseptor underenheter) er vanligvis en relativt langvarige og energisk dyrt prosess, en rekke cellulære maskiner dedikert til endo- og exocytosis av eksisterende reseptorer sørge for sine raskt innsetting og flytting til og fra membranen1. Derfor, i tillegg til transcriptional og translasjonsforskning regulering av reseptorer, posttranslational reseptor menneskehandel er en viktig modulator av neuronal excitability.
Synaptiske plastisitet, eller endre styrken av forbindelser mellom neurons med erfaring, antas å danne grunnlaget for læring og hukommelse2,3. Styrke og svekkelse av synapser over tid, kalles langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), henholdsvis kan være modulert via smugling av α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) reseptorer 4 , 5. AMPA reseptorer er heterotetramers består av fire underenheter (GluA1-4), og formidle fleste fort eksitatoriske synaptic overføring i hjernen6. Dermed er Nevron excitability i stor grad en funksjon av antallet AMPA reseptorer på postsynaptic overflaten tilgjengelig aktiveres av glutamat. LTD er vanligvis forbundet med en økning i AMPA reseptor endocytose, mens LTP er hovedsakelig knyttet til en økning i AMPA reseptor exocytosis. Postsynaptic overflate uttrykk for AMPA reseptorer krever endosomal levering til exocytotic proteiner, der sammensmelting med plasma membranen deretter oppstår i en kalsium-avhengig måte7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. det finnes også en rekke mekanismer som regulerer aktiviteten avhengig AMPA reseptor endocytose. Et eksempel på dette er via umiddelbar tidlig genet Arc/Arg3.1 (Arc). Blant andre funksjoner15, Arc er kjent for å megle metabotropic glutamat reseptor (mGluR)-avhengige LTD ved å fremme AMPA reseptor endocytose gjennom sin binding partnere, som inkluderer endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt groper20,21. Internalisert AMPA reseptorer kan enten resirkulert tilbake til plasma membranen eller øremerket fornedrelse22,23.
Viktigere, bidrar delenhet sammensetningen av AMPA reseptorer til deres menneskehandel dynamics24. Av stor relevans er intracellulær C-terminalen domenet til underenheter, hvor fleste posttranslational modifikasjoner og handel-relaterte protein interaksjoner skje. GluA1 og GluA4 delenhet inneholder AMPA reseptorer er spesielt passende til som smugles til celleoverflaten under LTP, delvis på grunn av deres PDZ ligander, ~ 90 amino acid sekvenser som fremmer membran forankring via interaksjon med ulike PDZ domenet inneholder proteiner25,26. På den annen side, pleier AMPA reseptorer som inneholder GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 å være trafikkerte constitutively men samle intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 underenheter gjennomgå RNA redigering, i tillegg til fremme oppbevaring i det endoplasmatiske retikulum28, gjengir kanal pore ugjennomtrengelig kalsium29, ytterligere implicating delenhet-spesifikke smugling som en viktig formidler av neuronal homeostasis og plastisitet. Interessant, har avbrudd i ubiquitin-avhengige Arc fornedrelse vist seg å øke GluA1 endocytose og øke overflaten uttrykk for GluA2 delenhet inneholder AMPA reseptorer etter induksjon av mGluR-LTD med selektiv gruppe I mGluR Agonistiske (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), som angir at mye er fortsatt for å lære om mekanismer og rollen som delenhet-spesifikke AMPA reseptor menneskehandel30.
Metoder for å observere endringer i overflaten uttrykk av reseptorer er ofte tungvint, tidkrevende, eller introdusere unødvendige forundrer. Biotin-baserte analyser er en gjennomgripende og kommersielt tilgjengelig tilnærming. Affinitet rensing biotinylated overflate reseptorer representerer et slikt eksempel, men nødvendigheten av å utføre geleelektroforese krever en stor mengde utvalget materialet og kan gjengi screening av flere behandlinger en uoverkommelig lengre behandle31. Utvidelser av denne analysen, der flere tidspunkt med merking og immunoprecipitations utføres for å kvantifisere gradvis nedbrytning av et innledende signal, tilsvarende forsømmelse tillegg av ny- eller resirkulert-reseptorer til cellen overflaten og bare forverre tid og materielle krav.
Andre tilnærminger gjør bruk av chimeric konstruksjoner eller tillegg av fluorescerende koder å observere reseptor menneskehandel32, noen ganger bruke live celle tenkelig33,34. Mens potensielt mektig, kan designene påvirke normale menneskehandel mønstre av reseptorer på grunn av mutasjoner eller dramatiske endringer i molekylvekt introdusert i disse proteinene. Bruk av fargestoffer at etiketten subcellular avdelinger av målretting lav pH34,35 er uspesifikke og skille mellom forskjellige intracellulær rom viktig for reseptor menneskehandel (f.eks. lysosomer og proteasomes) vanskelig. Til slutt, bruk av AC confocal mikroskopi å visualisere colocalization av reseptorer med markører knyttet til handel og fornedrelse, for eksempel endosomal proteiner eller clathrin, mens å gi nyttig innsikt i bestemte lokalisering med subcellular oppløsning, er tid, arbeidskrevende og dyrt på grunn av nødvendigheten av individuelt analysere hver celle og kravet til AC confocal eller super-oppløsning mikroskopi.
Her viser vi en høyt innhold reseptor menneskehandel analysen som er kompatibel med primære neuronal kultur forberedelser30. Denne metoden merker separat overflate og intracellulær reseptor bassengene fast neurons, slik at presentasjonen av data som et forhold mellom normalisert overflaten eller internalisert reseptor tetthet til den samlede tettheten for at reseptor. Høyt innhold natur denne metoden er ideell for screening flere behandlinger og/eller genotyper i et kort tidsrom, og krever kun celle dyrking og antistoff inkubasjon kompetanse.
Kort, primære neurons er dyrket i standard 96-brønnen microplates og deretter behandlet som diktert av eksperimentell design, inkubert med primære antistoffer, vasket og fast. Celler er deretter inkubert med en sekundær antistoff merke overflate reseptorer, etterfulgt av en annen fiksering trinn. Permeabilization deretter oppstår og en andre sekundære antistoff brukes til å navngi interne reseptor bassenger. Endelig er celler fotografert ved hjelp av en infrarød fluorescerende microplate skanner for å kvantifisere integrert tettheten av hver reseptor befolkningen. Figur 1 oppsummerer analysen vår høyt innhold i forhold til en tradisjonell biotinylation analysen.
Mens protokollen tilbys her er optimalisert og spesifikke for AMPA reseptor menneskehandel primære hippocampus Nevron kulturer, bli denne prosedyren kan, i teorien, utvidet og tilpasset ulike reseptorer i forskjellige celletyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Postsynaptic smugling av reseptorer til og fra celleoverflaten er en viktig mekanisme som neurons modulerer deres respons på ulike stimuli. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA)-reseptorene, som er ansvarlig for rask eksitatoriske synaptic overføring i nerveceller, smugles til og fra postsynaptic overflaten til å dynamisk endre neuronal excitability. AMPA reseptor handel er avgjørende for synaptiske plastisitet og kan bli forstyrret i nevrologisk sykdom. Imidlertid utbredt metoder for kvantifisering reseptor menneskehandel ignorere hele reseptor bassenger, er altfor tid - og arbeidskrevende, eller potensielt forstyrre normal menneskehandel mekanismer og derfor komplisere tolkningen av resultatdataene. Vi presenterer en høyt innhold analysen for kvantifisering av både overflate og interne AMPA reseptor bestander i kulturperler primære hippocampus neurons bruker dobbel fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarøde fluorescerende 96-brønnen microplate skanner. Denne tilnærmingen muliggjør rask screening av bulk internalisert og overflaten reseptor tettheter samtidig minimere utvalget materialet. Vår metode har imidlertid begrensninger i å skaffe encellede oppløsning eller gjennomføre levende celle bildebehandling. Til slutt kan denne protokollen være mottakelig for andre reseptorer og ulike celletyper, forutsatt riktig justeringer og optimalisering.

Arc/Arg3.1 akselererer AMPA reseptor endocytose gjennom samspill med AP-2, endophilin-3 og dynamin-216,18 etter mGluR aktivisering37. I Arc banke i musen (ArcKR), er lysines 268 og 269 i Arc protein mutert til arginin, som forstyrrer Arc ubiquitination. Dette svekker proteasome-avhengige omsetning på Arc forlenger halveringstiden i neurons21,30. I dette eksperimentet, ble utholdenhet bue i å regulere AMPA reseptor handel undersøkt med høyt innhold AMPA reseptor menneskehandel analysen. Neurons ble behandlet med Na+ kanal blokker TTX, som hemmer handling potensialer og reduserer Arc nivå38, etterfulgt av DHPG, som induserer Arc oversettelse og ubiquitination37,39. Både overflaten og internalisert bassenger av GluA1 - (figur 2A) og inneholder (figur 3A) GluA2 AMPA reseptor underenheter ble målt 5 og 15 minutter etter DHPG bleke. Dette bestemte eksperimentet brukt tre tekniske gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. ArcKR neurons viste økt GluA1 endocytose når behandlet med DHPG forhold til WT neurons, en effekt som ikke ble sett når neurons ble behandlet med TTX bare (figur 2B). Overflaten uttrykk for GluA2 tenkes betydelig økt på kort tid poeng sammenlignet WT neurons (figur 3B), som indikerer en potensiell delenhet erstatning30. Noen brønner ble behandlet med sekundær antistoffer bare å kontrollere til bakgrunnen fluorescens skyldes uspesifikke bindende.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figur 1: sammenligning av AMPA reseptor høyt innhold menneskehandel analysen til reseptoren biotinylation analysen. Høyt innhold menneskehandel analysen forbruker mindre tid og ressurser i forhold til standard biotinylation analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figur 2: overflate og interne bestander av GluA1 AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons. (A) overflate (sGluA1) og internalisert (iGluA1) GluA1 inneholder AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons 5 og 15 minutter etter DHPG bleke. Sammenlignet med WT, har ArcKR neurons en ytterligere nedgang i sGluA1 inneholder AMPA reseptor bassenget 5 og 15 min etter DHPG bleke. (B) grafen representerer overflaten fluorescens normalisert til totalt fluorescens intensitet. Statistiske sammenligninger ble utført med en enveis ANOVA, sammenkoblet og kort Student t tester. p ≤ 0,05; n = 3 teknisk gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er endret fra veggen, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figur 3: overflate og interne bestander av GluA2 AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons. (A) den samme eksperimentelle tilstanden som figur 2. Sammenlignet med WT, har ArcKR neurons en økning i sGluA2 inneholder AMPA reseptor bassenget 5 min etter DHPG bleke. (B) grafen representerer overflaten fluorescens normalisert til totalt fluorescens intensitet. Statistiske sammenligninger ble utført med enveis ANOVA, sammenkoblet og kort Student t tester. p ≤ 0,05; n = 3 teknisk gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er endret fra veggen, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Neuronal excitability kan være modulert gjennom en dynamisk prosess endo- og exocytosis av eksitatoriske ionotropic glutamat reseptorer. Beskrevet her er tilgjengelig, høyt innhold analysen for kvantifisering overflate og interne reseptor befolkningen bassenger.

En høyt innhold analysen for overvåking AMPA reseptor menneskehandel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Her demonstrerer vi en høyinnholdsreseptorhandelsanalyse som er kompatibel med primær nevronal kulturforberedelse. Denne metoden merker separat overflaten en inter kjeller reseptor bassenger av faste nevroner. Aktivering av presentasjon av data som et forhold mellom normalisert overflate eller internalisert reseptortetthet til den generelle tettheten til reseptoren.Den høye innholdet og reseptorhandel analyse gir en effekt for å måle bulk endringer i reseptorer menneskehandel profiler i et nevrale nettverk som svar på ulike faktorer. Forbruker mye mindre tid og materialer enn alternative metoder. Forstyrrelser og i forutinntatte menneskehandel har vært knyttet til flere nevrologiske lidelser, og regnes som et attraktivt mål for medisinering.For eksempler studier har vist en av de tidligste tegn på Alzheimers sykdom er synaptisk tap og redusert synaptisk og preceptor bassenger. Denne teknikken krever mange forskjellige trinn av varierende vanskelighetsgrad. Spesielt fordi håndtering av 96 brønnplate og manipulering av brønnene kan være vanskelig for noen uten erfaring.Og fordi resultatene av eksperimentet er svært følsomme for feil håndtering, er det nyttig å vise de ulike trinnene som utføres. Instruktør For å begynne, mate nevronene i 96 brønnplaten ved å fjerne 100 mikroliter av det eksisterende mediet fra hver brønn. Og erstatte den med 100 mikroliter media forhåndsoppvarmet til 37 grader Celsius.Hver tredje til fjerde dag. Bruk en multipipet til å fjerne 100 mikroliter medier fra hver brønn og ta opp mediene. Legg til to mikroliter av TTX Stock-løsning i én milliliter av det samlede, bevisste mediet for å skape en fire mikromolarløsning av TTX.Behandle nevronene i hver brønn med 100 mikroliter fire mikromolar TTX-løsning. Hvis det ikke er nok samlet tilstandsmedier, legg til noen av de tidligere lagrede mediene. Inkuber i en 5% CO2 inkubator ved 37 grader Celsius i fire timer.Etter dette fjerner du eksisterende TTX som inneholder medier og legger til 200 mikroliter forhåndsoppvarmede nevronale medier, og inkuber mikroplaten ved romtemperatur i femten minutter. Fjern først det nevronale mediet fra mikroplaten. Tilsett femti mikroliter av antiglal1 eller antigla2 antistoffløsning til de tilsvarende brønnene på mikroplaten.Tilsett femti mikroliter av nevronale medier til det sekundære antistoffet bare kontrollere brønner. Inkuber ved romtemperatur i tjue minutter for å tillate antistoffbinding. Deretter fjerner du eksisterende medier fra brønner.Vask mikroplaten tre ganger med 100 mikroliter romtemperatur neuronal media per brønn for å fjerne eventuelle ubundet antistoffer. Tilsett deretter 100 mikroliter 100 mikromos av DHPG lagerløsning til hver brønn. Inkuber i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i ti minutter.Deretter fjerner DHPG-løsningen og legger til 100 mikroliter av nevronale medier til hver brønn. Gjenta denne prosessen en gang til. Inkuber deretter i 5% karbondioksidinkubatoren ved 37 grader Celsius i fem minutter.På dagen for eksperimentet forberede en løsning på 4% paraformaldehyd og 4% sukrose NPBS. Fjern mediet fra hver brønn og erstatt det med 100 mikroliter av paraformaldehyd- og sukroseløsningen. Gjenta denne prosessen for hvert tilføyelsestidspunkt.Inkuber mikroplaten ved 4 grader Celsius i tjue minutter. Fjern deretter fikseringen og legg til 100 mikroliter DPBS til hver brønn. Fjern DPBS og legg til 150 mikroliter blokkerer buffer til hver brønn.Inkuber ved romtemperatur i nitti minutter. Fjern blokkeringsbufferen og legg til 50 mikroliter av den sekundære antistoffløsningen til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i seksti minutter mens platen er beskyttet mot lys.Fjern antistoffløsningen og tilsett 100 mikroliter tbs til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne prosessen, fjern mediet fra brønnene som legger til TBS, og inkuber ved romtemperatur fire ekstra ganger.Deretter fjerner du TBS fra mikroplaten. Tilsett 100 mikroliter av en løsning på 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i PBS til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i femten minutter.Fjern paraformaldehydløsningen og tilsett 100 mikroliter TBS i hver brønn, og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta dette trinnet to ganger til. Først forberede en løsning av TBS som inneholder 2% saponin og vortex løsningen kort for å fullstendig oppløse saponin pulver.Ved hjelp av et 2 mikrometerfilter filtrerer du løsningen for å fjerne partikler som kan forårsake autofluorescence. Tilsett 150 mikroliter av denne 2% saponinløsningen til hver brønn, og inkuber ved romtemperatur i femten minutter. Fjern deretter saponinløsningen, og legg til 150 mikroliter blokkerer bufferen til hver brønn.Inkuber ved romtemperatur i nitti minutter. Etter dette fjerner blokkeringsbufferen og legger til femti mikroliter av den sekundære antistoffløsningen til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i seksti minutter.Tilsett deretter 100 mikroliter tbs til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne prosessen legge TBS og inkubere ved romtemperatur fire ekstra ganger. Ved hjelp av et infrarødt laserbildesystem bilde 96 godt mikroplate i henhold til produsentens instruksjoner.Sett skanneoppløsningen til 84 mikrometer. Skannekvaliteten til middels og fokusforskyvningen i henhold til bunnhøyden på 96-brønnmikroplaten som brukes. Klikk på Image Studio-menyknappen, eksporter bilde for digitale medier, og eksporter bildene med en oppløsning på 300 dpi i TIFF-format.Åpne bildet i ImageJ Fiji. Del fargekanalene ved å klikke på bildemenyen og deretter farge, dele kanaler. Deretter åpner du ROI manager fra analyse, verktøy.Merk av i boksen for etiketter i roi-lederen for å klassifisere sirklene med tall. I 6 80 eller den røde kanalen velger du interesseområdet ved å velge sirkelverktøyet og tegne en sirkel som passer nøyaktig til den første brønnen. Trykk deretter på Ctrl pluss T, dra sirkelen til neste brønn.Gjenta denne prosessen til alle brønnene er sirklet. Klikk mål fra roi manager. Velg verdiene som vises, og kopier dem til et oppslagsark.Neste klikk på den grønne kanalen og transponere de valgte ROM-ene til bildet. Klikk mål fra roi manager. Velg verdiene som vises, og kopier dem til et oppslagsark.Etter dette beregner endringene overflaten reseptoruttrykket som beskrevet i tekstprotokollen. I denne prosedyren undersøkes vedvarende bue i regulering av ampareseptorhandel ved hjelp av ampareseptorsmugling og analyse av høyinnhold. Nevroner behandles med natrium-ion kanalblokker TTX som hemmer virkningspotensialer og reduserer lysbuenivåer.Etterfulgt av DHPG som induserer bueoversettelse og ubiquitination. Både overflate- og internalisere bassenger av gluA1 og gluA2 som inneholder apareseptorunderenheter ble målt til fem og femten minutter etter DHPG-utvasking. ArcKR nevroner viser økt glukose1 enditose når de behandles med DHPG, sammenlignet med mens type nevroner.Denne effekten ses ikke når nevroner behandles kun med TTX. Overflateuttrykket til limA2-underenheten økes betydelig på korte tidspunkter sammenlignet med wile type nevroner. Angir en potensiell erstatning for underenhet.Forsikre deg om at cellene er illikvide fast paraformaldehyd bør tilberedes friskt på dagen for eksperimentet. Cellene må festes på nytt etter merking for overflatereseptorene. Andre metoder som konfokal mikroskopi vil kunne gi encellet oppløsning for å ytterligere karakterisere relatert endret i nevronal struktur og reseptorlokalisering.Forstyrre den timelige dynamikken i bue endrer ampa reseptorer trafficking som svar på MgluR mediert LTD. Fremtidige retninger vil være å måle ampa reseptorer trafficking som svar på andre stimuli. Denne analysen kan tilpasses andre celletyper, behandlinger og reseptorer, forutsatt at prosedyren er nøye justert og riktig validert.Det må tas hensyn til at celletettheter, behandlingstider, fikseringstrinn, permeabiliseringstrinn og reagensvalg optimaliseres systemet av interesse. For vellykket og effektiv gjennomføring av analysen er det viktig å forberede DHPG-løsningen og 4% paraformaldehyd, 4% sukroseløsning på dagen for eksperimentet. Kontroll godt behandlet med vakeel eller TTX er nødvendig for å sikre at effektene som observeres er spesifikke for behandling.Det er også viktig å inkludere brønner behandlet med bare sekundære antistoffer for å kontrollere for bakgrunnsfluorescens produsert av ikke-spesifikk binding.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Ved hjelp av en α-bungarotoxin Binding Side Tag til Study GABA A-reseptoren Membran Lokalisering og menneskehandel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Et høyt innhold Imaging Assay for Identifisering av botulinumneurotoksin hemmere

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling av Odorant reseptor aktivisering benytter en sanntid leiren analysen

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live bilder av GLUT4 Protein menneskehandel musen primære hypothalamus nevroner bruker Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Analysen utvikling for høy innhold kvantifisering av Sod1 Mutant Protein samlet formasjon i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

En enkel cellebasert Immunofluorescence analysen å oppdage Autoantibody mot N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) reseptoren i blod

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder for oppdagelsen av romanen forbindelser modulerende en Gamma - Aminobutyric Acid reseptor skriver en Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Sanntid i Vitro overvåking av Odorant reseptor aktivering av en Odorant i damp fase

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...