Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Agradecemos assistência técnica Zachary Allen. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Whitehall (Grant 2017-05-35) e Cleon C. Arrington Research Grant programa de iniciação (RIG-93) A.M.M. M.A.G e D.W.Y. ambos foram apoiados por uma Neurogenomics de Universidade de estado de Geórgia 2CI Fellowship.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Georgia State University e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de neurônios Hippocampal preliminares (em fluxo Laminar Hood)
<ol><li>Isolar os neurônios hippocampal preliminares do dia pós-natal de sexo misto (P) 0-1 ratos como descrito anteriormente36.</li>
	<li>Neurônios de placa de 96 poços poli-D-lisina revestido microplacas com uma densidade de 2 x 104 células por poço.</li>
	<li>Preparar a mídia para alimentar os neurônios, adicionando 10 mL de 50 x B-27, 5 mL de 100 x glutamina, µ l 242 de 10 mg/mL 5-Fluoro-2-desoxiuridina (FUDR) e 10 µ l de 10 mg/mL de gentamicina a 485 mL de mídia neuronal (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Neurônios de alimentação conforme descrito anteriormente36 removendo metade (100 µ l) da pré-existente (referidas meios condicionados, que contém os componentes que oferecem suporte a sobrevivência neuronal) de mídia de cada poço e substituindo com 100 µ l de 37 ° C pré-aquecido mídia preparado na etapa 1.3 cada 3-4 dias. Armazene a mídia condicionada de cada mamada no 4˚C para o passo 2.3.</li>
</ol>2. medição do Receptor GABA tráfico em resposta a DHPG (em fluxo Laminar Hood)
<ol><li>No dia em Vitro (DIV) 14, prepare uma solução stock de 500 µ l de tetrodotoxina (TTX) em uma concentração de 2 mM, utilizando cultura de células água de grau. Atenção: TTX é uma neurotoxina. Manuseie com cuidado e evite o contacto com a pele.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, remover 100 µ l de cada poço da microplaca de 96 poços de neurônios e a mídia do pool.</li>
	<li>Adicione 2 µ l da solução-mãe TTX para 1 mL da mídia condicionada em pool da etapa 2.2 para criar uma solução µM 4 de TTX. Se não houver suficiente em pool de mídia condicionadas, então use a mídia armazenada condicionadas de passo 1.4.</li>
	<li>Trate os neurônios com 100 µ l/poço da solução de 4 µM de TTX da etapa 2.3. Coloque o microplate na incubadora 5% CO2 a 37 ° C por 4 h.</li>
	<li>Anexe um vidro estéril Pasteur pipeta para uma linha de sucção e anexar uma ponta de pipeta estéril 200 µ l para a ponta da pipeta. Remova a mídia de cada bem cuidadosamente. Evite tocar no fundo do microplate onde se situam os neurônios.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de mídia neuronal de temperatura a cada poço.</li>
	<li>Incube a microplaca em temperatura ambiente por 15 min. incubação em 5% CO2 é preferencial, mas não necessário.</li>
</ol>3. encontrava (em fluxo Laminar Hood)
<ol><li>Prepare uma diluição de 1:150 do anticorpo anti-GluA1 ou anti-GluA2 nos meios de comunicação neuronais.</li>
	<li>Remova a mídia neuronal adicionada na etapa 2.6. Adicione 50 µ l das soluções de anticorpo anti-GluA1 ou anti-GluA2 correspondente aos poços por 20 min em temperatura ambiente para permitir a ligação de anticorpos. Adicione 50 µ l de mídia neuronal nos poços de controle único anticorpo secundário.</li>
	<li>Remova as soluções de anticorpo adicionadas na etapa 3.2. Lave o microplate 3 vezes com 100 µ l/poço de temperatura mídia neuronal para remover quaisquer anticorpos não acoplados.</li>
	<li>Faça uma solução stock de 50mm de DHPG em mídia neuronal ou água de grau de cultura de células. A solução brevemente para dissolver totalmente o DHPG de vórtice. Prepare esta solução fresca no mesmo dia do experimento. Evite usar soluções velhas ou descongeladas.</li>
	<li>Dilua a solução-mãe nos meios de comunicação neuronais para tornar-se uma solução de 100 µM 1: 500.</li>
	<li>Remova a mídia existente de cada poço. Adicione 100 µ l/poço da solução-mãe DHPG 100 µM de passo 3.5. Incube o microplate na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 10 min.</li>
	<li>Remover a solução DHPG adicionada na etapa 3.6 e adicionar 100 µ l/poço neuronal mídia. Repita essa etapa mais uma vez. Coloque o microplate na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 5 min.</li>
	<li>Adicione a sacarose para tornar a solução de sacarose de paraformaldehyde/4% de 4% em PBS, no mesmo dia do experimento. Evite usar soluções velhas ou descongeladas. Remova a mídia adicionada na etapa 3.7. Adicione 100 µ l/poço de 4% paraformaldehyde/4% solução de sacarose. Repita as etapas de 3,6-3,8 para cada ponto de tempo adicional. Uma vez completo, incube a microplaca a 4 ° C por 20 min. Atenção: Lidar com estoques de paraformaldeído em uma coifa.</li>
	<li>Retire o fixador da etapa 3.8 e adicionar 100 µ l/poço de frio 1 x DPBS.</li>
	<li>Remova DPBS. Adicionar 150 µ l/poço bloqueio de buffer (uma formulação prontos para uso em TBS, consulte a Tabela de materiais) e incubar à temperatura de 90 min. Alternativamente, incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
</ol>4. rotulagem de receptores de superfície
<ol><li>Prepare uma diluição de 1:1500 do anticorpo secundário da 680RD cabra anti-rato IgG em tampão de bloqueio.</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio da etapa 3.10. Adicionar 50 µ l/poço da solução anticorpo secundário e incubar a temperatura ambiente por 60 min. Mantenha a microplaca protegida da luz, uma vez que os anticorpos secundários são adicionados. Certifique-se de continuar a proteger a microplaca de luz durante a incubação do subsequente.</li>
	<li>Remova a solução da etapa 4.2. Adicione 100 µ l/poço TBS (50 mM Tris-HCl, NaCl, de 150 mM pH 7,6) e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Repita este passo 4 vezes adicionais.</li>
	<li>Remova TBS de passo 4.3. Adicione 100 µ l/poço de 4% paraformaldehyde/4% de sacarose em PBS e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Remova a solução do passo 4.4. Adicione 100 µ l/poço TBS e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Repita este passo mais 2 vezes.</li>
</ol>5. rotulagem população interiorizada do Receptor
<ol><li>Prepare TBS contendo 0,2% saponina. A solução brevemente para dissolver completamente o pó de saponina de vórtice. Filtre a solução usando um filtro de 0,2 µm para remover quaisquer partículas que poderiam causar autofluorescência.</li>
	<li>Adicionar 150 µ l TBS contendo 0,2% de saponina e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Remover a solução de saponina de passo 5.2 e adicionar tampão de bloqueio 150 µ l/poço. Incube a temperatura ambiente por 90 min.</li>
	<li>Prepare uma diluição de 1:1500 de 800CW burro do anti-Mouse IgG anticorpo secundário em tampão de bloqueio.</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio da etapa 5.3 e adicionar 50 µ l/poço da solução anticorpo secundário. Incube a temperatura ambiente por 60 min.</li>
	<li>Adicione 100 µ l/poço TBS e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Repita este passo 4 vezes adicionais.</li>
</ol>6. geração de imagens e análise
<ol><li>A microplaca de 96 poços, usando um laser infravermelho, sistema de acordo com as instruções do fabricante de imagem da imagem. Defina a resolução de digitalização de 84 µm, a qualidade da digitalização para o médio e o foco deslocamento de acordo com a altura da base da microplaca de 96 poços usada. Clique sobre o "Estúdio de imagem" menu botão → → de exportar imagem para imagens de exportação → mídia Digital com uma resolução de 300 dpi, no formato TIFF.</li>
	<li>Download Image J "Fiji" em https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Abrir imagem no Image J "Fiji". Separação de canais de cores clicando no menu "Imagem" Canais de cor → Split.</li>
	<li>Abra o Gerenciador de ROI de "Analisar" → "ferramentas". Marque a caixa "rótulos" no Gerenciador de ROI para rotular os círculos com números.</li>
	<li>No vermelho (680 nm do receptor de superfície piscina) do canal, selecione a região de interesse (ROI), selecionando a ferramenta círculo e desenhando um círculo que se encaixa com precisão o primeiro poço. Pressione Ctrl + T.</li>
	<li>Arraste o círculo para o outro bem e pressione Ctrl + T. Repita até que todos os poços estão circulados.</li>
	<li>O gerente de ROI, clique em "Medida". Selecione os valores que aparecem e copiarão-los para uma planilha.</li>
	<li>Clique no canal verde (800 piscina interna do receptor nm) e em seguida transpor o ROIs selecionado da etapa 6.6 para a imagem. O gerente de ROI, clique em "Medida". Selecione os valores que aparecem e copiarão-los para uma planilha.</li>
	<li>Calcule que os valores de média densidade integrada do secundário só controlam poços. Subtrai os valores de densidade integrada para cada poço experimental dos secundário único controle integrado densidade valores médios para o pool de superfície do receptor. Repita essa etapa para a piscina interna do receptor.</li>
	<li>Calcular as alterações na expressão de receptores de superfície usando Rs/rt, onde Rs representa a densidade integrada de receptores de superfície e Rt representa a densidade integrada de receptores de superfície + densidade integrada de receptores internos.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os receptores GABA são um subtipo de receptor de glutamato de geleificação é integral para funções neuronais que incluem a formação de sinapses, estabilidade de sinapse e plasticidade sináptica. Interrupção de receptor GABA está ligada a vários distúrbios neurológicos24 e são considerados drogas atraentes alvos40. Por exemplo, estudos têm mostrado que um dos primeiros sinais da doença de Alzheimer (AD) é a perda de sinapse e reduzido sináptica Leandro receptor níveis41,42. Curiosamente, adição de oligômeros de ß-amiloide prejudica a expressão do receptor de superfície contendo GluA1 Leandro em sinapses43. Além disso, estado de mal epiléptico para baixo-regula GluA2 mRNA e proteína em neurônios hippocampal anterior a sua morte,44. Em esclerose lateral amiotrófica (ela), patologia de alcatrão DNA-ligando da proteína (TDP-43), uma anormalidade molecular ALS específicos, tem sido vinculada ao ineficiente local de GluA2 Q/R-RNA edição45.
O alto teor Leandro receptor de tráfico fornece meios eficazes para medir alterações em massa em perfis de tráfico do receptor dentro de uma rede neuronal em resposta a vários factores, consumindo muito menos tempo e materiais do que métodos alternativos. Uma única microplaca de 96 poços fornece inúmeros poços para executar várias técnicas Replica e controles para diferentes condições experimentais no mesmo prato. A chapeamento de baixa densidade de 2 x 104 células/poço em relação a densidade de células/poço de 5 x 105 reduz significativamente o número de animais e materiais necessários para cada experimento (Figura 1). O scanner infravermelho pode imagem microplacas de 96 poços até seis de cada vez. O ensaio também pode ser modificado para um microplacas 384-bem46, que torna-se especialmente valioso se o ensaio é executado em exemplos preciosos que são difíceis de obter ou são caros à cultura (amostras, por exemplo, humanas e células-tronco pluripotentes induzidas). O ensaio inteiro pode ser concluído e analisado no mesmo dia, que economiza tempo valioso (Figura 1).
Para a conclusão bem sucedida e eficiente do ensaio, alguns pontos precisam ser considerados. Em primeiro lugar, é importante preparar a solução DHPG no mesmo dia do tratamento do neurônio. Não reutilizar ou congelar ações DHPG. A paraformaldehyde/4% de 4% de sacarose em solução de PBS deve ser igualmente fresco no mesmo dia do experimento. Em segundo lugar, poços de controle tratadocom com TTX apenas ou veículo são necessários para assegurar que os efeitos observados são específicos para o tratamento. Também é fundamental incluir poços tratados com apenas os anticorpos secundários de Controlarar para fluorescência de fundo produzida pela ligação não-específica. Observe que a segunda etapa de fixação (seguir esmaecimento de anticorpos secundários) é a chave para reduzir efeitos de fundo de anticorpo secundário e realização efetiva rotulagem de subunidades do receptor.
Comprometimentos e limitações, como acontece com qualquer método, existem. Este ensaio não fornece resolução de célula única (ou subcellular) e não permite acompanhamento em tempo real do receptor tráfico como outros métodos32,33,35. Além disso, adequada deve ter cuidado durante a etapa de permeabilização de neurônios, como esse método será sensível para a fuga de componentes intracelulares, no caso de excesso de permeabilização.

A magnitude e dinâmica temporal da excitabilidade neuronal é largamente dependente da disponibilidade e composição das populações de receptores de superfície que transduce sinais electroquímicos. Considerando que a síntese de novos receptores (ou subunidades do receptor) é geralmente um processo energètica caro e relativamente prolongado, uma série de maquinaria celular dedicada ao endo e exocitose dos receptores existentes fornecem meios para sua inserção rápida e remoção de e para a membrana1. Portanto, além do Regulamento transcriptional e translação dos receptores, receptores posttranslational tráfico é um importante modulador da excitabilidade neuronal.
Plasticidade sináptica, ou a força de mudança de conexões entre neurônios com experiência, é pensada para formar a base da aprendizagem e memória2,3. O fortalecimento e o enfraquecimento das sinapses ao longo do tempo, denominadas potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), respectivamente, podem ser modulados através do tráfico de receptores de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) 4 , 5. os receptores GABA são heterotetramers, composta de quatro subunidades (GluA1-4) e mediar a maioria da transmissão sináptica excitatória rápida no cérebro6. Assim, a excitabilidade do neurônio é em grande parte uma função da quantidade de receptores GABA na superfície pós-sináptica disponível para ser ativado pelo glutamato. LTD é comumente associado com um aumento na endocitose de receptores GABA, Considerando que a LTP é predominantemente associada com um aumento na exocitose de receptor GABA. Expressão de superfície pós-sináptico de receptores GABA requer CDDP entrega os proteínas, onde ocorre a fusão com a membrana plasmática então em uma maneira cálcio-dependente7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. também existem uma série de mecanismos que regulam a endocitose de receptor GABA atividade-dependente. Um exemplo disso é através do gene início imediato Arc/Arg3.1 (Arc). Entre outras funções,15, o arco é conhecido para mediar o receptor metabotrópico de glutamato (mGluR)-dependente LTD, promovendo a endocitose de receptor GABA através dos seus parceiros de ligação, que incluem as proteínas endocítica AP-2, endophilin-3 e Dinamina-2 16 , 17 , 18 , 19, a clatrina revestido coloca20,21. Interiorizado os receptores GABA podem ser reciclados volta para a membrana plasmática ou destinados à degradação22,23.
Importante, a composição da subunidade de receptores GABA contribui para seu tráfico dinâmica24. De grande relevância é o domínio C-terminal intracelular das subunidades, onde ocorre a maioria das modificações do posttranslational e interações da proteína relacionada ao tráfico. GluA1 e GluA4 que contêm o subunit receptores GABA são particularmente aptos a ser traficadas à superfície da célula durante a LTP, em parte devido à presença de seus ligantes PDZ, ~ 90 sequências de aminoácidos que promovem a membrana ancoragem através de interações com vários PDZ domínio-contendo proteínas25,26. Por outro lado, os receptores GABA contendo GluA2 e falta de GluA1 ou GluA4 tendem a ser traficadas constitutivamente mas acumular intracelular com atividade sináptica27. Subunidades GluA2 passam por RNA edição que, além de promover a retenção no retículo endoplasmático28, processa o poro do canal impermeável ao cálcio29, implicando mais específicas do subunit do tráfico como um mediador chave de neuronal homeostase e plasticidade. Curiosamente, interrupção da degradação de arco ubiquitina dependente foi mostrada para aumentar GluA1 endocitose e aumentar a expressão de superfície de GluA2 que contêm o subunit receptores GABA após indução de mGluR-LTD com o seletivo grupo I mGluR agonista (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), indicando que há ainda muito para ser aprendido sobre os mecanismos e o papel da subunidade específica Leandro receptor tráfico de30.
Métodos para observar as mudanças na expressão de receptores de superfície são muitas vezes complicado, demorado, ou introduzir desnecessários confunde. Ensaios baseados em biotina são uma abordagem abrangente e comercialmente disponível. Purificação da afinidade dos receptores de superfície biotinilado representa um exemplo, no entanto, a necessidade da realização de eletroforese requer uma grande quantidade de material de amostra e pode processar o rastreio de vários tratamentos um proibitivamente longo processo de31. Extensões deste ensaio, onde vários pontos de tempo de rotulagem e moleculas são executados para quantificar a degradação gradual de um sinal inicial, da mesma forma negligenciam a adição de novo — ou reciclado — receptores à célula superfície e apenas exacerbam o tempo e necessidades de materiais.
Outras abordagens fazem uso de construções quiméricas ou a adição de etiquetas fluorescentes para observar o receptor tráfico de32, às vezes usando ao vivo celular imagem33,34. Enquanto potencialmente poderoso, estes projetos podem afetar os padrões de tráfico normais dos receptores devido a mutações ou mudanças drásticas no peso molecular introduzido nestas proteínas. O uso de corantes que rotulam compartimentos subcellular alvejando baixo pH34,35 são inespecíficos e fazer a distinção entre diferentes compartimentos intracelulares importantes para receptor de tráfico (ex.. lisossomos e proteasomes) difícil. Finalmente, o uso da microscopia confocal Visualizar o colocalization de receptores com marcadores associados ao tráfico e degradação, tais como proteínas CDDP ou clatrina, proporcionando potencialmente útil introspecção localização específica com resolução subcellular, são tempo, trabalhoso e caro devido à necessidade de analisar individualmente cada célula e a exigência de confocal ou microscopia de super-resolução.
Aqui, demonstramos um ensaio de tráfico alto teor do receptor que seja compatível com a cultura neuronal primária preparações30. Esse método etiquetas separadamente as piscinas de superfície e intracelular do receptor dos neurônios fixos, permitindo a apresentação dos dados como uma relação de superfície normalizado ou densidade interiorizada do receptor para a densidade global para o receptor. A natureza de alto teor desse método é ideal para a seleção de vários tratamentos e/ou genótipos em um curto espaço de tempo e requer experiência de incubação de cultivo e anticorpo só padrão de célula.
Brevemente, neurônios primários são cultivados em microplacas de 96 poços padrão e então tratados como ditado pelo delineamento experimental, incubados com anticorpos primários, lavados e fixo. As células são então incubadas com um anticorpo secundário para rotular a receptores de superfície, seguidos de outra etapa de fixação. Permeabilização então ocorre e um segundo anticorpo secundário é usado para rotular piscinas interna do receptor. Finalmente, as células são fotografadas usando um scanner infravermelho microplate fluorescente para quantificar a densidade integrada de cada população de receptores. A Figura 1 resume o nosso ensaio de alto teor em comparação com um ensaio biotinylation tradicional.
Enquanto o Protocolo oferecido aqui é otimizado e específicos para receptores GABA tráfico de culturas primárias neurônio hippocampal, este procedimento poderia, em teoria, é alargado e adaptado para receptores diferentes em uma variedade de tipos de células.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Pós-sináptico de receptores de superfície celular e para o tráfico é um importante mecanismo pelo qual os neurônios modulam a sua capacidade de resposta a diferentes estímulos. Os receptores (GABA) ácidos α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic, que são responsáveis pela transmissão sináptica excitatória rápida nos neurônios, são traficados para e da superfície de alterar dinamicamente a excitabilidade neuronal pós-sináptica. Leandro receptor tráfico é essencial para a plasticidade sináptica e pode ser perturbado na doença neurológica. No entanto, abordagens predominantes para quantificação do receptor tráfico ignoram piscinas inteira do receptor, são demasiado tempo - e trabalhoso, ou potencialmente interromper mecanismos normais de tráfico e, portanto, complicar a interpretação dos dados resultantes. Nós apresentamos um ensaio de alto teor para a quantificação das populações de receptores GABA superfície tanto internas em culturas neurônios hippocampal preliminares usando dual immunolabeling fluorescente e um scanner infravermelho fluorescente microplacas de 96 poços. Esta abordagem facilita a rápida seleção de granel interiorizado e densidades de receptores de superfície, minimizando o material da amostra. No entanto, o nosso método tem limitações na obtenção de célula única resolução ou realização de imagens de células vivas. Finalmente, este protocolo pode ser receptivo a outros receptores e diferentes tipos de células, desde otimização e ajustes adequados.

Arc/Arg3.1 acelera a endocitose de receptor GABA através da interação com a AP-2, endophilin-3 e 2-Dinamina16,18 mGluR ativação37a seguir. No arco bater-no mouse (ArcKR), lisinas 268 e 269 na proteína Arc são mutações de arginina, que interfere com arco ubiquitination. Isto prejudica a rotatividade de proteossomo dependente de arco e prolonga a sua meia-vida em neurônios21,30. Neste experimento, a persistência do arco na regulação Leandro receptor tráfico foi examinada usando o ensaio de tráfico de alto teor Leandro do receptor. Os neurônios foram tratados com o bloqueador de canal de at+ TTX, que inibe os potenciais de ação e reduz a arco níveis38, seguido por DHPG, que induz a tradução do arco e da ubiquitination37,39. Tanto a superfície e interiorizadas piscinas de GluA1 - (Figura 2A) e subunidades de receptores GABA (Figura 3A), contendo GluA2 foram medidas em 5 e 15 min após o fracasso DHPG. Esta experiência particular usado três repetições de técnicas de 3 experimentos independentes. Neurônios ArcKR mostraram aumento GluA1 endocitose quando tratados com DHPG em comparação com os neurônios WT, um efeito que não foi observado quando os neurônios foram tratados com TTX apenas (Figura 2B). Expressão de superfície de GluA2 subunidades aumentou significativamente em curto espaço de tempo pontos em comparação com neurônios WT (Figura 3B), indicando um potencial de substituição de subunidade30. Alguns poços foram tratados com anticorpos secundários apenas ao controle para fluorescência de fundo causada pela ligação inespecífica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figura 1: comparação do Leandro receptor alto teor tráfico de ensaio para o ensaio de biotinylation receptor. O ensaio de alto teor de tráfico consome menos tempo e recursos em comparação com o ensaio de biotinylation padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figura 2: populações internas e superfície de subunidades de receptor de GluA1 GABA nos neurônios hippocampal WT e ArcKR. (A) superfície (sGluA1) e interiorizado (iGluA1) Leandro GluA1-contendo subunidades de receptor nos neurônios hippocampal WT e ArcKR às 5 e 15 min após o fracasso DHPG. Comparado a WT, ArcKR neurônios tem uma nova diminuição do sGluA1 contendo Leandro receptor piscina 5 e 15 min após o fracasso DHPG. (B) gráfico representa superfície fluorescência normalizada para a intensidade de fluorescência total. Comparações estatísticas foram realizadas utilizando uma One-Way ANOVA, testes t de Student emparelhadas e não emparelhadas. p ≤ 0,05; n = 3 repetições de técnicas de 3 experimentos independentes. Valores representam a média ± SEM. Esta figura foi modificada da parede, M. J. et al 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figura 3: populações internas e superfície de subunidades de receptor de GluA2 GABA nos neurônios hippocampal WT e ArcKR. (A) a mesma condição experimental como Figura 2. Comparado ao WT, ArcKR neurônios tem um aumento na sGluA2-contendo Leandro receptor piscina 5 min após desbotar DHPG. (B) gráfico representa superfície fluorescência normalizada para a intensidade de fluorescência total. Comparações estatísticas foram realizadas utilizando o One-Way ANOVA, testes t de Student emparelhadas e não emparelhadas. p ≤ 0,05; n = 3 repetições de técnicas de 3 experimentos independentes. Valores representam a média ± SEM. Esta figura foi modificada da parede, M. J. et al 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Aqui demonstramos um ensaio de tráfico de receptores de alto conteúdo compatível com a preparação da cultura neuronal primária. Este método rotula separadamente a superfície de uma piscina de receptores interdegadores de neurônios fixos. Permitindo a apresentação de dados como uma razão de densidade de superfície normalizada ou receptor internalizada à densidade geral desse receptor.O alto teor de conteúdo e o ensaio de tráfico de receptores fornecem um meio efetuado para medir mudanças em massa nos perfis de tráfico de receptores dentro de uma rede neural em resposta a vários fatores. Consumindo muito menos tempo e materiais do que métodos alternativos. Interrupções e no tráfico de preceptores têm sido ligados a múltiplos distúrbios neurológicos, e são considerados alvos atraentes para a terapia medicamentosa.Por exemplos, estudos mostraram que um dos primeiros sinais da Doença de Alzheimer é a perda sináptica e a diminuição das piscinas sinápticas e preceptoras. Esta técnica requer muitas etapas diferentes de dificuldade variada. Especialmente porque manusear a placa 96 e manipular os poços pode ser difícil para alguém sem experiência.E como os resultados do experimento são altamente sensíveis ao manuseio inadequado, é útil visualizar as várias etapas que estão sendo realizadas. Instrutor Para começar, alimente os neurônios na placa do poço 96 removendo 100 microliters da mídia pré-existente de cada poço. E substituindo-o por 100 microliters de mídia pré-aquecida a 37 graus Celsius.A cada três ou quatro dias. Um dia in vitro 14, use um multi-pipet para remover 100 microliters de mídia de cada poço e juntar a mídia. Adicione dois microliters da solução TTX Stock a um mililitro da mídia condicionada agrupada para criar uma solução de quatro micromolares de TTX.Trate os neurônios em cada poço com 100 microlitres de quatro soluçãos TTX micromolar. Se não houver mídia de condição agrupada suficiente, adicione alguns dos meios de comunicação armazenados anteriormente. Incubar em uma incubadora de 5%CO2 a 37 graus Celsius por quatro horas.Depois disso, remova o TTX existente contendo mídia e adicione 200 microliters de mídia neuronal pré-aquecida, e incubar a micro placa em temperatura ambiente por quinze minutos. Primeiro remova a mídia neuronal da micro placa. Adicione cinquenta microliters da solução anti gluA1 ou anticorpos anti gluA2 aos poços correspondentes da micro placa.Adicione 50 microliters de mídia neuronal ao anticorpo secundário apenas controlam poços. Incubar em temperatura ambiente por vinte minutos para permitir a ligação de anticorpos. Depois disso, remova a mídia existente dos poços.Lave a micro placa três vezes com 100 microliters de mídia neuronal de temperatura ambiente por poço para remover quaisquer anticorpos desvinculados. Em seguida, adicione 100 microliters 100 micromolar de solução de estoque DHPG para cada poço. Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por dez minutos.Em seguida, remova a solução DHPG e adicione 100 microliters de mídia neuronal a cada poço. Repita este processo uma segunda vez. Em seguida, incubar na incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por cinco minutos.No dia do experimento prepare uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de SNA de sacarose. Remova a mídia de cada poço e substitua-a por 100 microliters da solução paraformaldeída e sacarose. Repita este processo para cada ponto de tempo de adição.Incubar a micro placa a 4 graus Celsius por vinte minutos. Em seguida, remova o fixador e adicione 100 microliters de DPBS a cada poço. Remova o DPBS e adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço.Incubar em temperatura ambiente por noventa minutos. Remova o tampão de bloqueio e adicione 50 microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por sessenta minutos, mantendo a placa protegida da luz.Remova a solução de anticorpos e adicione 100 microliters de TBS a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Repita este processo, removendo a mídia dos poços adicionando TBS e incubando à temperatura ambiente quatro vezes adicionais.Depois disso, remova a TBS da micro placa. Adicione 100 microliters de uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS para cada poço. Incubar em temperatura ambiente por quinze minutos.Remova a solução de paraformaldeído e adicione 100 microliters de TBS em cada poço e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta etapa duas vezes adicionais. Primeiro prepare uma solução de TBS contendo 2% de saponina e vórtice a solução brevemente para dissolver totalmente o pó de saponina.Usando um filtro de 2 micrômetros, filtrar a solução para remover quaisquer partículas que possam causar autofluorescência. Adicione 150 microliters desta solução de saponina de 2% a cada poço, e incubar à temperatura ambiente por quinze minutos. Em seguida, remova a solução de saponina e adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço.Incubar em temperatura ambiente por noventa minutos. Depois disso, remova o tampão de bloqueio e adicione cinquenta microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por sessenta minutos.Em seguida, adicione 100 microliters de TBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita este processo adicionando TBS e incubando à temperatura ambiente quatro vezes adicionais. Usando uma imagem a laser infravermelha imagem do sistema de imagem a laser a placa 96 bem de acordo com as instruções do fabricante.Defina a resolução da varredura para 84 micrômetros. A qualidade da varredura para médio e o foco compensam de acordo com a altura base da micro placa de 96 poços utilizada. Clique no botão do menu Image Studio, exporte imagem para mídia digital e exporte as imagens com uma resolução de 300 dpi no formato TIFF.Abra a imagem em ImageJ Fiji. Divida os canais de cores clicando no menu de imagem e, em seguida, colorir, dividir canais. Em seguida, abra o gerente do ROI a partir de análise, ferramentas.Verifique na caixa as etiquetas do gerenciador de ROI, a fim de classificar os círculos com números. No canal 6 80, ou vermelho, selecione a região de interesse selecionando a ferramenta de círculo e desenhando um círculo que se encaixa com precisão no primeiro poço. Em seguida, pressione Ctrl mais T, arrastando o círculo para o próximo poço.Repita este processo até que todos os poços sejam circulados. Da medida de clique do gerenciador de ROI. Selecione os valores que aparecem e copie-os em uma planilha.Clique em seguida no canal verde e transponha os ROIs selecionados para a imagem. Da medida de clique do gerenciador de ROI. Selecione os valores que aparecem e copie-os em uma planilha.Depois disso, calcule as alterações da expressão do receptor de superfície, conforme descrito no protocolo de texto. Neste procedimento, a persistência do arco na regulação do tráfico de receptores ampa é examinada utilizando-se o tráfico e ensaio de receptores ampa de alto teor. Os neurônios são tratados com o bloqueador de canais de íons de sódio TTX que inibe potenciais de ação e reduz os níveis de arco.Seguido por DHPG que induz a tradução do arco e a ubiquização. Ambas as piscinas de superfície e internalização de gluA1 e gluA2 contendo subunidades receptoras de apa foram medidas em cinco e quinze minutos após a lavagem do DHPG. Os neurônios ArcKR mostram aumento da endositose gluA1 quando tratados com DHPG, em comparação com os neurônios do tipo.Este efeito não é visto quando os neurônios são tratados apenas com TTX. A expressão superficial da subunidade gluA2 é aumentada significativamente em pontos de tempo curtos em comparação com neurônios do tipo wile. Indicando uma possível substituição de subunidade.Certifique-se de que as células são ilíquidas paraformaldeídas devem ser preparadas frescos no dia do experimento. As células devem ser refixas após a rotulagem dos receptores de superfície. Outros métodos, como a microscopia confocal, serão capazes de fornecer resolução celular única para caracterizar ainda mais mudanças relacionadas na estrutura neuronal e localização do receptor.Interromper a dinâmica temporal do arco altera o tráfico de receptores ampa em resposta ao MgluR mediado LTD. As direções futuras serão medir o tráfico de receptores ampa em resposta a outros estímulos. Este ensaio talvez adaptável a outros tipos de células, tratamentos e receptores, desde que o procedimento seja cuidadosamente ajustado e validado adequadamente.Deve-se tomar cuidado para garantir que as densidades celulares, os tempos de tratamento, as etapas de fixação, as etapas de permeabilização e as seleções de reagentes sejam otimizadas para o seu sistema de interesse. Para uma conclusão bem-sucedida e eficiente do ensaio é importante preparar a solução DHPG e a solução de 4%paraformaldeído, 4% de sacarose no dia do experimento. O controle bem tratado com vakeel ou TTX é necessário para garantir que os efeitos observados sejam específicos para o tratamento.Também é fundamental incluir poços tratados apenas com anticorpos secundários para controlar a fluorescência de fundo produzida por ligações não específicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Monitoramento Eye Movement of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Neurociência

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Imagens ao vivo da proteína GLUT4 tráfico de Mouse de neurônios hipotálamo primário usando microscopia de deconvolução

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...