Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Мы благодарим Zachary Allen для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Фондом Уайтхолл (Грант 2017-05-35) и Клеон C. Arrington инициации Грант программы исследований (RIG-93) A.M.M. M.A.G. и D.W.Y. были оба поддерживается стипендий 2CI Грузии государственного университета Neurogenomics.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университета штата Джорджия.
1. Подготовка первичных Нейроны гиппокампа (в Ламинарный шкаф)
<ol><li>Изолировать первичной гиппокампа нейронов из смешанного пола послеродовой день (P) 0-1 мышей как описано36.</li>
	<li>Пластина нейронов в 96-луночных поли D-лизин покрытием планшет на плотности 2 х 104 клетки на хорошо.</li>
	<li>Подготовить СМИ для кормления нейронов, добавив 10 мл 50 x B-27, 5 мл 100 x глутамина, 242 мкл 10 мг/мл 5-фтор 2′ дезоксиуридина (FUDR) и 10 мкл 10 мг/мл гентамицина 485 мл нейрональных СМИ (см. Таблицу материалы).</li>
	<li>Корма нейроны как описано36 , удалив половина (100 мкл) уже существующих СМИ (именуемый кондиционером СМИ, который содержит компоненты, которые поддерживают выживаемость нейронов) от каждой скважины и замены 100 мкл 37 ° C подогретую СМИ подготовлено в шаге 1.3 каждые 3-4 дня. Храните кондиционером от каждого кормления на 4˚C на шаге 2.3.</li>
</ol>2. Измерение АМПА рецептор людьми в ответ ДХПГ (в Ламинарный шкаф)
<ol><li>В день в пробирке (DIV) 14, подготовьте 500 мкл Стоковый раствор Тетродотоксин (TTX) в концентрации 2 мм с помощью клеточной культуры качества воды. ОСТОРОЖНОСТЬЮ: TTX это нейротоксин. Бережно и избегать контакта с кожей.</li>
	<li>С помощью многоканальных дозаторов, удалить 100 µL из каждой скважины 96-луночных микропланшетов нейронов и пул средств массовой информации.</li>
	<li>Мкл 2 TTX Стоковый раствор 1 мл пуле кондиционером СМИ из шага 2.2 для создания раствором 4 мкм TTX. Если не достаточно пуле кондиционером СМИ, затем используйте некоторые из хранимой кондиционером СМИ от 1.4 шаг.</li>
	<li>Лечить нейронов с 100 мкл/хорошо 4 мкм решения TTX из шага 2.3. Место в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C 4 h микроплиты.</li>
	<li>Прикрепите стерильных стеклянных Пастер Пипетка на линии всасывания и прикрепить стерильные пипетки конец 200 мкл до кончика пипетки. Также тщательно удалите средства массовой информации от каждого. Не прикасайтесь к нижней части микроплиты, где расположены нейронов.</li>
	<li>Добавьте 200 мкл комнатной температуре нейрональных СМИ для каждой скважины.</li>
	<li>Инкубируйте микроплиты при комнатной температуре 15 минут инкубации в 5% CO2 является предпочтительным, но не обязательно.</li>
</ol>3. Immunolabelling (в Ламинарный шкаф)
<ol><li>Подготовьте 1: 150 разбавления антитела анти GluA1 или анти GluA2 в нейрональных СМИ.</li>
	<li>Удаление нейронов СМИ, добавленных в шаге 2.6. Добавьте 50 мкл решений антитела анти GluA1 или анти GluA2 соответствующие скважин для 20 мин при комнатной температуре, чтобы позволить антитела связывая. 50 мкл нейрональных СМИ, вторичное антитело только контроля скважин.</li>
	<li>Удаление решения антитела, добавленной на шаге 3.2. Вымойте микроплиты 3 раза с 100 мкл/хорошо комнатной температуре нейрональных СМИ для удаления любых несвязанные антитела.</li>
	<li>Сделайте раствор 50 мм запасов ДХПГ в нейрональных СМИ или клеток культуры качества воды. Вихрь решение кратко, чтобы полностью растворить ДХПГ. Подготовьте этот свежие решения в тот же день эксперимента. Избегайте использования старых или талой решения.</li>
	<li>Разбавьте раствор в нейрональных СМИ до 1: 500, чтобы сделать раствор 100 мкм.</li>
	<li>Удалите существующий носитель из каждой скважины. Добавьте 100 мкл/колодец ДХПГ Стоковый раствор 100 мкм с шагом 3.5. Инкубируйте микроплиты в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO2 за 10 мин.</li>
	<li>Удалите решение ДХПГ, добавленной на шаге 3.6 и добавьте 100 мкл/хорошо нейрональных средств массовой информации. Повторите этот шаг еще раз. Место микроплиты в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO2 на 5 мин.</li>
	<li>Добавьте сахарозы сделать 4% paraformaldehyde/4% раствор сахарозы в ФБР в тот же день эксперимента. Избегайте использования старых или талой решения. Удалите средства массовой информации, добавленной на шаге 3.7. Добавьте 100 мкл/хорошо 4% раствора сахарозы в paraformaldehyde/4%. Повторите шаги 3,6-3,8 для каждого дополнительного времени точки. После завершения, Инкубируйте микроплиты на 4 ° C в течение 20 мин. ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Обработайте параформальдегида запасов в зонта.</li>
	<li>Снимите фиксатор из шаг 3,8 и добавьте 100 мкл/скважина 1 x DPBS холодную.</li>
	<li>Удалите DPBS. Добавить 150 мкл/также блокирует буфер (готовые к использованию формулировки в TBS, обратитесь к Таблице материалы) и инкубации при комнатной температуре для 90 мин в качестве альтернативы, инкубировать на ночь при 4 ° C.</li>
</ol>4. Маркировка поверхности рецепторы
<ol><li>Подготовьте разбавления 1: 1500 680RD коза анти мыши IgG вторичные антитела в блокирующем буфере.</li>
	<li>Удалите блокирующий буфер из шага 3.10. Добавьте 50 мкл/хорошо решения вторичного антитела и инкубации при комнатной температуре на 60 мин держать микроплиты, защищенном от света, когда добавляются вторичные антитела. Убедитесь в том продолжать защищать микроплиты от света во время последующих инкубаций.</li>
	<li>Удаление решения из шага 4.2. Добавьте 100 мкл/хорошо TBS (50 мм трис-HCl, 150 мм NaCl, рН 7,6) и инкубации при комнатной температуре за 5 мин повторить этот шаг 4 еще раз.</li>
	<li>Удалите из шаг 4.3 TBS. Добавить 100 мкл/хорошо 4% paraformaldehyde/4% сахарозы в ФБР и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.</li>
	<li>Удаление решения из шага 4.4. Добавьте 100 мкл/хорошо TBS и инкубации при комнатной температуре на 5 мин повторить этот шаг 2 дополнительных раз.</li>
</ol>5. Маркировка интернализированных рецептор населения
<ol><li>Подготовьте TBS, содержащие 0,2% сапонинов. Вихрь решение кратко, чтобы полностью растворить порошок сапонины. Фильтр решения с помощью 0,2 мкм фильтр для удаления частиц, которые могут привести к авто флуоресценции.</li>
	<li>Добавить 150 мкл TBS содержащие 0,2% сапонинов и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.</li>
	<li>Удалять сапонин решение из шага 5.2 и добавьте 150 мкл/хорошо блокирующий буфер. Инкубации при комнатной температуре 90 мин.</li>
	<li>Подготовьте разбавления 1: 1500 800CW осла анти мыши IgG вторичные антитела в блокирующем буфере.</li>
	<li>Удалить блокирующий буфер из шага 5.3 и добавьте 50 мкл/хорошо решения вторичного антитела. Инкубации при комнатной температуре в течение 60 мин.</li>
	<li>Добавьте 100 мкл/хорошо TBS и инкубации при комнатной температуре на 5 мин повторить этот шаг 4 еще раз.</li>
</ol>6. обработка изображений и анализ
<ol><li>Изображения 96-луночных микропланшетов с помощью инфракрасной лазерной системы согласно инструкциям производителя. Установите разрешение сканирования до 84 мкм, качество сканирования для средних и смещение согласно базовая высота 96-луночных микропланшетов используется фокус. Нажмите на «Имидж студия» меню кнопку → Экспорт → изображения для цифровых медиа → экспорт изображений с разрешением 300 dpi, в формате TIFF.</li>
	<li>Скачать Image J «Фиджи» на https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Открыть изображение в изображении J «Фиджи». Сплит цветовые каналы, нажав на меню «Изображение» Цвет → разделить каналы.</li>
	<li>Откройте диспетчер ROI от «Анализировать» → «инструменты». Установите флажок «ярлыки» в менеджере ROI на этикетке круги с числами.</li>
	<li>В красном канале (680 нм поверхности рецептор бассейн), выберите регион интерес (ROI), выбрав инструмент «круг» и рисование круга, который точно соответствует первой скважины. Нажмите Ctrl + T.</li>
	<li>Перетащите кружок на следующий хорошо и нажмите Ctrl + T. повторять до тех пор, пока в непосредственной от всех скважин.</li>
	<li>От менеджера ROI нажмите кнопку «Мера». Выберите значения, которые появляются и скопировать их в электронную таблицу.</li>
	<li>Нажмите на зеленый канал (800 Нм внутренних рецепторов бассейн) и затем Транспонировать выбранные трансформирования из шага 6.6 к изображению. От менеджера ROI нажмите кнопку «Мера». Выберите значения, которые появляются и скопировать их в электронную таблицу.</li>
	<li>Расчет средней плотности комплексных значений из вторичного только контроль скважины. Вычитание комплексного плотности значений для каждой экспериментальной хорошо от средняя вторичных только значений элемента управления интегрированы плотность поверхности рецептор пула. Повторите этот шаг для внутренних рецепторов пула.</li>
	<li>Рассчитать изменения в экспрессии рецепторов поверхности, используя R/rst, где Rs представляет собой интегрированный плотность поверхности рецепторы и Rt представляет интегрированный плотность поверхности рецепторы + интегрированный плотность внутренних рецепторов.</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

АМПА рецепторы являются подтип рецепторов глутамата ИОНОТРОПНЫХ, которая является неотъемлемой частью для нейронов функций, которые включают в себя формирование синапсов, синапса стабильность и синаптической пластичности. АМПА рецептор нарушение связано с несколько неврологических расстройств24 и считаются привлекательными наркотиков цели40. Например исследования показали, что один из первых признаков болезни Альцгеймера (AD) Нейронные потерю и снижение синаптических АМПА рецепторов уровень41,42. Интригующе Добавление амилоид ß олигомеров повреждает поверхности экспрессии рецепторов GluA1-содержащих АМПА синапсы43. Кроме того эпилептический статус вниз регулирует GluA2 мРНК и белка в нейронах гиппокампа, предшествующих их смерти44. В боковой амиотрофический склероз (ALS), TAR ДНК-связывающих белков (TDP-43) патологии, ненормальность молекулярных ALS-конкретных были связаны с неэффективным GluA2 Q/R сайт-редактирования РНК45.
Высоким содержанием АМПА рецептор людьми assay является эффективным средством для измерения массовых изменений в рецептор людьми профили в нейронной сети в ответ на различные факторы, потребляя значительно меньше времени и материалов, чем альтернативные методы. Один 96-луночных микропланшетов предоставляет многочисленные скважины для запуска нескольких технических реплицирует и управления для различных экспериментальных условий в том же пластины. Плотность низкая покрытие 2 х 104 клетки/хорошо по отношению к плотности клеток/хорошо 5 x 105 значительно уменьшает количество животных и материалы, необходимые для каждого эксперимента (рис. 1). Инфракрасного сканера можно изображения до шести 96-луночных планшетов одновременно. Assay также могут быть изменены до 384-ну Гонав46, которая становится особенно ценной, если assay выполняется на ценные образцы, которые трудно получить или дорогой к культуре (например человеческих образцов и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток). Весь assay могут быть завершены и проанализированы в тот же день, что экономит ценное время (рис. 1).
Для успешного и эффективного завершения анализа некоторые моменты необходимо учитывать. Во-первых важно подготовить ДХПГ решение в тот же день лечения нейрона. Не использовать повторно или заморозить ДХПГ запасов. 4% paraformaldehyde/4% сахарозы в PBS решения следует также свежие в тот же день эксперимента. Во-вторых лечить контроля скважин с TTX только или транспортного средства требуются для обеспечения что эффект являются специфическими для лечения. Важно также, чтобы включить скважин, получавших только вторичные антитела к элементу управления для фона флуоресценции, производимые неспецифической привязки. Обратите внимание, что на втором этапе фиксации (следующие размыва вторичных антител) ключ для сокращения вторичное антитело фоновые эффекты и достижения эффективного маркировки рецептор субъединиц.
Компромиссы и ограничения, как и в случае с любым методом, существуют. Этот assay не предоставляет одну ячейку (или субцеллюлярные) резолюции и не позволяет в реальном времени отслеживать рецептора людьми как другие методы по32,,3335. Кроме того надлежащего ухода должны приниматься на этапе permeabilization нейронов, как этот метод будет чувствительны к утечка внутриклеточных компонентов в случае чрезмерной permeabilization.

Масштабы и временная динамика возбудимости нейронов в значительной степени зависит от доступности и состав поверхности рецептор популяций, которые передают электрохимических сигналов. Тогда как синтез новых рецепторов (или субъединиц рецептор) вообще энергетически дорогостоящих и сравнительно длительный процесс, множество клеточными посвященный эндо - и экзоцитоз существующих рецепторов предоставляют средства для их быстрой вставки и удаления и из мембраны1. Таким образом помимо транскрипционный анализ и трансляционная регуляции рецепторов, Посттрансляционная рецептор торговля является важным модулятор возбудимости нейронов.
Считается, что синаптической пластичности, или изменение прочности соединений между нейронами с опытом, основой обучения и памяти2,3. Усиление и ослабление синапсы с течением времени, называют долгосрочный потенцирование (LTP) и долгосрочные депрессии (LTD), соответственно, можно модулировать через торговлю α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) рецепторы 4 , 5. АМПА рецепторы являются heterotetramers, состоящий из четырех подразделений (GluA1-4) и посредником большинство быстро возбуждающим синаптической передачи в мозг6. Таким образом в значительной степени возбудимости нейрона является функцией количество АМПА рецепторов на поверхности постсинаптических доступных активироваться глутамата. LTD является обычно ассоциируется с увеличением АМПА рецептор эндоцитоза, тогда как LTP преимущественно связана с увеличением АМПА рецептор экзоцитоз. Проявление АМПА рецепторов постсинаптической поверхности требует от англ доставки exocytotic белков, где слияние с плазматической мембраны затем происходит в манере кальций зависимых7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Существует также целый ряд механизмов, которые регулируют деятельность зависимых АМПА рецептор эндоцитоза. Одним из примеров этого является через немедленное раннего Джин дуги/Arg3.1 (Arc). Среди других функций15, дуги, как известно, быть посредником Метаботропные рецептор глутамата (mGluR)-зависимых LTD путем поощрения АМПА рецептор эндоцитоза через своих партнеров привязки, которые включают в себя endocytic белки AP-2, endophilin-3 и Динамин-2 16 , 17 , 18 , 19, на Клатрин покрытием ямы20,21. Интернализированных АМПА рецепторов можно либо рециркулированных обратно к плазматической мембраны или предназначенных для деградации22,23.
Важно отметить, что состав Субблок АМПА рецепторов способствует их людьми динамика24. Большое значение — Внутриклеточный домен C-терминал подразделений, где большинство Посттрансляционная модификаций и торговлей белковых взаимодействий происходит. GluA1 и GluA4 Субблок содержащих АМПА рецепторов особенно склонны вывозятся в клеточной поверхности во время LTP, отчасти из-за присутствия их PDZ лигандов, ~ 90 аминокислотных последовательностей, способствующих мембраны, якорь через взаимодействие с различными PDZ домен содержащих белков25,26. С другой стороны АМПА рецепторов, содержащие GluA2 и не GluA1 или GluA4, как правило, продают конститутивно но внутриклеточно накапливаются с синаптической активности27. GluA2 подразделений проходят РНК, редактирования, который, помимо поощрения удержания в эндоплазматический ретикулум28, оказывает поровых каналов непроницаемы для кальция29, далее о причастности Субблок конкретных людьми как ключевым посредником нейронов гомеостаза и пластичности. Интересно, что нарушение убиквитин зависимой деградации дуги было показано увеличение GluA1 эндоцитоза и увеличения поверхности выражение GluA2 Субблок содержащих АМПА рецепторов после индукции mGluR-LTD с выборочной группы я mGluR агонист (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (ДХПГ), указав, что многое еще предстоит выяснить относительно механизмов и роль субъединицы конкретных АМПА рецептор людьми30.
Методы для наблюдения изменений в поверхности экспрессии рецепторов часто громоздки, много времени, или ввести ненужные путает. Биотин основе анализов являются широко распространенной и коммерчески доступных подход. Очищение сродства биотинилированным поверхности рецепторы представляет собой один из таких примеров, однако необходимость проведения электрофореза требуется большое количество образцов материала и может оказать чрезмерно длительный показ нескольких лечения процесс31. Расширения этого анализа, где несколько точек время маркировки и immunoprecipitations выполняются для количественного определения постепенное ухудшение состояния исходного сигнала, аналогично пренебрегать добавлением новых — или рециркулированных — рецепторов клеток поверхности и только усугубляют время и материальные требования.
Другие подходы использовать химерных конструкции или добавлением флуоресцентные метки соблюдать рецептор людьми32, иногда с использованием живой клетки изображений33,34. Хотя потенциально мощный, эти проекты могут повлиять на нормальной торговли людьми структуры рецепторов из-за мутаций или драматические изменения в молекулярном весе в этих белков. Использование красителей, что лейбл субцеллюлярные отсеков по ориентации низкого pH34,35 неспецифической и разграничения различных внутриклеточных отсеков, важные для рецепторов торговли людьми (например,. лизосомы и протеосомы) трудно. Наконец использование confocal микроскопии для визуализации colocalization рецепторов с маркерами, связанных с торговлей людьми и деградации, например от англ белки или Клатрин, обеспечивая потенциально полезную информацию о конкретных локализации с субцеллюлярные резолюция, время, трудоемким и дорогостоящим из-за необходимости индивидуально анализа каждой ячейки и требование конфокальный или суперразрешением микроскопии.
Здесь мы демонстрируем высоким содержанием рецепторов людьми assay, который совместим с основной культуры нейрональных подготовка30. Этот метод отдельно метки поверхности и внутриклеточные рецепторы бассейны фиксированной нейронов, позволяя представления данных как отношение нормализованных поверхности или плотности интернализированных рецепторов к общей плотности для этого рецептора. Высоким содержанием характер этого метода является идеальным для отбора нескольких процедур и/или генотипов в короткие сроки и требует только стандартная ячейка культивирования и Антитело инкубации опыта.
Кратко первичной нейронов выращенных в стандартных 96-луночных планшетов и затем рассматривается как продиктовано экспериментальный дизайн, инкубировали с первичных антител, промывают и фиксированной. Клетки затем инкубируют с вторичное антитело для обозначения поверхности рецепторы, последовал еще один шаг фиксации. Permeabilization затем возникает и второй вторичное антитело используется для обозначения внутренних рецепторов бассейнов. Наконец клетки отражаются с помощью инфракрасного флуоресцентные Гонав сканер для количественного определения комплексной плотность населения каждого рецептора. Рисунок 1 суммирует нашим высоким содержанием пробирного по сравнению с традиционной biotinylation assay.
Хотя протокол вот оптимизированный и специфических для АМПА рецептор оборота первичной гиппокампа нейрон культур, эта процедура может в теории, быть расширен и адаптированные для различных рецепторов в различных типах клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Постсинаптических оборотом рецепторов от поверхности клетки и важный механизм, по которому нейроны модулировать их реагирования на различные стимулы. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) рецепторы, которые отвечают за быстро возбуждающим синаптической передачи в нейронах, продают и от поверхности постсинаптических динамически изменять возбудимости нейронов. АМПА рецептор людьми необходим для синаптической пластичности и может быть нарушена в неврологических заболеваний. Однако, распространенных подходов для количественной оценки рецептор людьми игнорировать весь рецептор бассейны, являются чрезмерно время - и трудоемких, или потенциально нарушать обычные механизмы торговли и таким образом осложнить интерпретации полученных данных. Мы представляем высоким содержанием assay для количественной оценки населения, как поверхностных, так и внутренних рецепторов АМПА культивировали первичной гиппокампа нейронов, используя двойной флуоресцентный immunolabeling и ближней ИК люминесцентных 96-луночных микропланшетов сканера. Этот подход облегчает быстрое скрининг основную внутреннюю и поверхности рецептор плотности при сведении к минимуму образца материала. Однако наш метод имеет ограничения в получении одной ячейки резолюции или проведения живых клеток. Наконец этот протокол может поддаваться других рецепторов и различных типов клеток, условии надлежащей корректировки и оптимизации.

Дуги/Arg3.1 ускоряет АМПА рецептор эндоцитоза путем взаимодействия с AP-2, endophilin-3 и Динамин-216,18 после активации mGluR37. В дуговой стучать в мышь (ArcKR) lysines, 268 и 269 в протеине дуги мутируют аргинин, который вмешивается ubiquitination дуги. Это ухудшает протеасом зависимых оборот дуги и удлиняет период его полураспада в нейроны21,30. В этом эксперименте сохранение дуги в регулировании АМПА рецептор людьми рассматривался с высоким содержанием АМПА рецептор людьми assay. Нейроны относились с Na+ канала блокатор TTX, который препятствует потенциалы действия и уменьшает дуги уровни38, следуют ДХПГ, который индуцирует дуги перевод и ubiquitination37,39. Поверхность и интернализированных бассейны GluA1-(рисунок 2A) и GluA2-содержащих (Рисунок 3А) АМПА рецептор подразделения были измерены в 5 и 15 мин после ДХПГ размыва. Этот особый эксперимент используется три технических реплицирует из 3 независимых экспериментов. ArcKR нейроны показал увеличение GluA1 эндоцитоза при обработке ДХПГ по сравнению с WT нейронов, эффект, который не был замечен, когда нейроны лечили TTX только (рис. 2B). Поверхности выражение GluA2 подразделений был значительно увеличен на короткое время пунктов по сравнению с WT нейронов (рис. 3B), указанием потенциальных Субблок замена30. Некоторые скважины лечили вторичные антитела только для управления для фона флуоресценции, вызванные неспецифического связывания.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Рисунок 1: сравнение АМПА рецептор высоким содержанием людьми assay для assay biotinylation рецептор. Высоким содержанием людьми assay потребляет меньше времени и ресурсов, по сравнению с стандартным biotinylation assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Рисунок 2: поверхностные и внутренние населения АМПА GluA1 рецептор подразделений в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа. (A) поверхность (sGluA1) и внутреннюю (iGluA1) GluA1-содержащих АМПА рецептор субблоки в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа в 5-15 мин после ДХПГ размыва. По сравнению с WT, ArcKR нейронов после вымывания ДХПГ дальнейшее снижение sGluA1-содержащих АМПА рецептор бассейн 5 и 15 мин. (B) граф представляет поверхности флуоресценции, нормированный интенсивности флуоресценции всего. Статистические сопоставления были проведены с использованием односторонней ANOVA, парные и непарные студент t тесты. p ≤ 0,05; n = 3 технические реплицирует из 3 независимых экспериментов. Значения представляют собой среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от стены, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Рисунок 3: поверхностные и внутренние населения АМПА GluA2 рецептор подразделений в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа. (A) же экспериментальные условия как на рисунке 2. По сравнению с WT, ArcKR нейроны имеют увеличение в бассейне рецептора sGluA2-содержащих АМПА 5 мин после ДХПГ размыва. (B) граф представляет поверхности флуоресценции, нормированный интенсивности флуоресценции всего. Статистические сопоставления были проведены с использованием односторонней ANOVA, парные и непарные студент t тесты. p ≤ 0,05; n = 3 технические реплицирует из 3 независимых экспериментов. Значения представляют собой среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от стены, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Возбудимость нейронов можно модулировать через динамический процесс эндо - и Экзоцитоз глутамата рецепторов возбуждающих ИОНОТРОПНЫХ. Описанные здесь является доступной, высоким содержанием assay для количественной оценки поверхностных и внутренних рецепторов населения бассейнов.

Высоким содержанием пробирного контроля АМПА рецептор людьми

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Здесь мы демонстрируем анализ высокого содержания рецепторов, который совместим с первичной подготовкой нейронной культуры. Этот метод отдельно маркирует поверхность межпоистерными рецепторными пулами фиксированных нейронов. Включение представления данных как соотношения нормализованной поверхности или интернализированной плотности рецепторов к общей плотности этого рецептора.Анализ высокого содержания и незаконного оборота рецепторов обеспечивает эффектное средство измерения массовых изменений профилей торговли рецепторами в нейронной сети в ответ на различные факторы. Потребляя гораздо меньше времени и материалов, чем альтернативные методы. Нарушения и торговля предцепторами были связаны с многочисленными неврологическими расстройствами и считаются привлекательными целями для медикаментозной терапии.Например, исследования показали, что одним из самых ранних признаков болезни Альцгеймера является синаптическая потеря и уменьшение синаптических и предцепторных бассейнов. Этот метод требует много различных шагов различной сложности. Особенно потому, что обработка 96 хорошо пластины и манипулирования скважин может оказаться трудным для кого-то без опыта.А поскольку результаты эксперимента очень чувствительны к неправильной обработке, полезно просматривать различные выполняемые шаги. Инструктор Для начала, кормить нейроны в 96 хорошо пластины, удалив 100 микролитров уже существующих средств массовой информации из каждой хорошо. И заменить его 100 микролитров средств массовой информации предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.Каждые три-четыре дня. В день в пробирке 14, использовать мульти-трубы, чтобы удалить 100 микролитров средств массовой информации из каждой хорошо и объединить средства массовой информации. Добавьте два микролитров решения TTX Stock в один миллилитр кондиционированных средств массовой информации для создания четырех микромоляного раствора TTX.Лечить нейроны в каждом хорошо с 100 микролитров из четырех микромоляных TTX раствора. Если не хватает объединяются средства массовой информации условия добавить некоторые из ранее хранящихся средств массовой информации. Инкубировать в инкубаторе 5%CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов.После этого удалите существующий TTX, содержащий мультимедиа и добавьте 200 микролитров предварительно разогретых нейрональных средств массовой информации, и инкубировать микро пластину при комнатной температуре в течение пятнадцати минут. Сначала удалите нейрональные средства массовой информации из микро-пластины. Добавьте пятьдесят микролитров антиглуА1 или антиглуа2 антитела к соответствующим скважинам микро пластины.Добавьте пятьдесят микролитров нейрональных средств массовой информации к вторичным антителам только контроль скважин. Инкубировать при комнатной температуре в течение двадцати минут, чтобы обеспечить связывание антител. После этого удалите существующие средства массовой информации из скважин.Вымойте микро пластину три раза с 100 микролитров нейрональных средств комнатной температуры на колодец, чтобы удалить любые неограниченные антитела. Затем добавьте 100 микролитров 100 микромоляров раствора DHPG для каждой хорошо. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода 5%при 37 градусах по Цельсию в течение десяти минут.Затем удалите раствор DHPG и добавьте 100 микролитров нейрональных средств массовой информации к каждой хорошо. Повторите этот процесс во второй раз. Затем инкубировать в 5%carbon двуокиси инкубатора при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.В день эксперимента подготовьем раствор 4%параформальдегида и 4%сахарозы NPBS. Удалите средства массовой информации из каждой хорошо и заменить его 100 микролитров параформальдегида и раствора сахарозы. Повторите этот процесс для каждой точки времени добавления.Инкубировать микро пластины при 4 градусах по Цельсию в течение двадцати минут. Затем удалите фиксатор и добавьте 100 микролитров DPBS к каждой колодец. Удалите DPBS и добавьте 150 микролитров блокирующего буфера к каждой колодец.Инкубировать при комнатной температуре в течение девяносто минут. Удалите блокирующий буфер и добавьте 50 микролитров вторичного раствора антител к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение шестидесяти минут, сохраняя при этом пластины защищены от света.Удалите раствор антител и добавьте 100 микролитров TBS к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот процесс, удалив средства массовой информации из скважин, добавляющих TBS, и инкубации при комнатной температуре еще четыре раза.После этого снимите TBS с микро пластины. Добавьте 100 микролитров раствора 4%параформальдегида и 4% сахарозы в PBS к каждой хорошо. Инкубировать при комнатной температуре в течение пятнадцати минут.Удалите раствор параформальдегида и добавьте 100 микролитров TBS в каждую колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот шаг еще два раза. Сначала подготовите раствор TBS, содержащий 2%saponin и вихрем раствор кратко полностью растворить порошок сапонина.Используя 2-метровый фильтр, фильтруйте раствор, чтобы удалить любые частицы, которые могут вызвать аутофторесценцию. Добавьте 150 микролитров этого 2%сапонина раствора к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре в течение пятнадцати минут. Затем удалите раствор сапонина и добавьте в каждую колодец 150 микролитров блокирующего буфера.Инкубировать при комнатной температуре в течение девяносто минут. После этого удалите блокирующий буфер и добавьте пятьдесят микролитров вторичного раствора антител к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение шестидесяти минут.Затем добавьте 100 микролитров TBS к каждой колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот процесс, добавляя TBS и инкубации при комнатной температуре четыре дополнительных раза. Использование инфракрасной лазерной системы визуализации изображения 96 хорошо микро пластины в соответствии с инструкциями производителей.Установите разрешение сканирования до 84 микрометров. Качество сканирования до среднего и фокус компенсируется в зависимости от базовой высоты 96 хорошо микро пластины используется. Нажмите на кнопку меню Image Studio, экспортировать изображение для цифровых медиа и экспортировать изображения с разрешением 300 dpi в формате TIFF.Откройте изображение в ImageJ Фиджи. Разделите цветные каналы, нажав на меню изображения, а затем цвет, разделить каналы. Затем откройте менеджера рентабельности инвестиций из анализа, инструментов.Проверьте поле для меток в менеджере рентабельности инвестиций, чтобы классифицировать круги с номерами. В 6 80, или красный канал, выберите область интереса, выбрав круг инструмент и рисунок круг, который точно соответствует первому хорошо. Затем нажмите Ctrl плюс T, перетаскивая круг к следующему колодец.Повторите этот процесс до тех пор, пока все скважины не будут обведены. Из меры roi manager нажмите кнопку. Выберите значения, которые появляются, и скопировать их на лист распространения.Следующий клик по зеленому каналу и транспонировать выбранные ROIs на изображение. Из меры roi manager нажмите кнопку. Выберите значения, которые появляются, и скопировать их на лист распространения.После этого вычислить изменения выражения поверхностных рецепторов, как указано в текстовом протоколе. В этой процедуре сохранение дуги в регулировании торговли рецепторами амфы изучается с использованием высококонтентного оборота рецепторов ампы и анализа. Нейроны обрабатываются блокатором натрия-ионных каналов TTX, который подавляет потенциал действия и снижает уровень дуги.Следуют DHPG, который вызывает дуги перевода и убиквитинации. Как поверхностные, так и интернализируемые пулы gluA1 и gluA2, содержащие субъединиты рецепторов апа, измерялись через пять-пятнадцать минут после вымывания DHPG. ArcKR нейроны показывают увеличение глюА1 эндозитоз при лечении DHPG, по сравнению с в то время как тип нейронов.Этот эффект не видел, когда нейроны лечатся только TTX. Поверхностное выражение подразделения gluA2 значительно увеличивается в короткие сроки по сравнению с нейронами типа wile. Указание потенциальной замены подразделения.Убедитесь, что клетки неликвидных фиксированных параформальдегида должны быть подготовлены свежие в день эксперимента. Клетки должны быть повторно зафиксированы после маркировки для поверхностных рецепторов. Другие методы, такие как конфокальная микроскопия, смогут обеспечить одноклеточное разрешение для дальнейшей характеристики связанных измененных в нейронной структуре и локализации рецепторов.Нарушение временной динамики дуги изменяет оборот рецепторов ампы в ответ на MgluR опосредованное LTD. Будущие направления будут измерять оборот рецепторов ампы в ответ на другие раздражители. Этот анализ, возможно, адаптируется к другим типам клеток, лечения и рецепторов, при условии, что процедура тщательно скорректированы и надлежащим образом проверены.Необходимо позаботиться о том, чтобы плотность клеток, время лечения, шаги фиксации, шаги по протеабилизации и выбор реагентов были оптимизированы вашей системой интересов. Для успешного и эффективного завершения анализа важно подготовить решение DHPG и 4%paraformaldehyde, 4% раствор сахарозы в день эксперимента. Контроль хорошо лечить с vakeel или TTX необходимы для обеспечения того, чтобы эффекты наблюдается являются специфическими для лечения.Важно также включить скважины, обработанные только вторичными антителами для контроля фоновой флуоресценции, вырабатываемой неспецифическим связыванием.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Движение глаз Мониторинг памяти

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Высокое содержание изображений Пробирной для идентификации ботулинического нейротоксина ингибиторов

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Методы для обнаружения новых соединений, модулирует гамма - аминомасляная кислота рецепторов типа синапсах

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Режиме реального времени в Vitro мониторинга одоранта рецептор активации одоранта в паровой фазе

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...