Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Vi tackar Zachary Allen för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av stiftelsen Whitehall (Grant 2017-05-35) och Kleon C. Arrington inledande Grant forskningsprogram (RIG-93) till ask. M.A.G. och D.W.Y. var båda stöds av ett Georgia State University Neurogenomics 2CI stipendium.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Georgia State University.
1. beredning av primära Hippocampus nervceller (i LAF)
<ol><li>Isolera primära Hippocampus nervceller från blandade kön postnatal dag (P) 0-1 möss som tidigare beskrivits36.</li>
	<li>Plattan nervceller i 96 brunnar poly-D-lysin belagd mikroplattor på en densitet på 2 x 104 celler per brunn.</li>
	<li>Förbered för utfodring nervceller genom att tillsätta 10 mL 50 x B-27, 5 mL 100 x glutamin, 242 µL 10 mg/mL 5-Fluoro-2′-deoxiuridin (FUDR) och 10 µL av 10 mg/mL Gentamycin 485 mL av neuronala media (se Tabell för material).</li>
	<li>Foder nervceller som tidigare beskrivits36 genom att ta bort hälften (100 µL) av den existerande media (kallad luftkonditionerade medier, som innehåller beståndsdelar som stöder neuronal överlevnad) från varje brunn och ersätter med 100 µL av 37 ° C föruppvärmd media bereddes i steg 1.3 varje 3-4 dagar. Lagra luftkonditionerade media från varje utfodring på 4˚C för steg 2,3.</li>
</ol>2. mäta AMPA Receptor människohandel som svar på DHPG (i LAF)
<ol><li>På dagen i Vitro (DIV) 14, förbereda en 500 µL stamlösning av Tetrodotoxin (TTX) vid en koncentration på 2 mM med hjälp av cellodling grade vatten. Varning: TTX är ett nervgift. Hantera försiktigt och Undvik kontakt med huden.</li>
	<li>Använda en flerkanalig pipett, ta bort 100 μl från varje brunn av 96 brunnar mikroplattan av nervceller och pool media.</li>
	<li>Tillsätt 2 µL TTX stamlösning 1 ml av poolade luftkonditionerade medier från steg 2.2 att skapa en 4 µM lösning av TTX. Om det inte finns tillräckligt poolade luftkonditionerade medier, sedan använda vissa lagrade luftkonditionerade medier från steg 1.4.</li>
	<li>Behandla nervceller med 100 µL per brunn 4 µM lösning av TTX från steg 2,3. Placera mikroplattan i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 4 h.</li>
	<li>Bifoga ett sterilt glas Pasteur Pipettera till en sugledning och fäst en steril 200 µL pipett änden till spetsen på pipetten. Ta bort mediet från varje väl försiktigt. Undvik att vidröra botten av mikroplattan där nervceller finns.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL av rumstemperatur neuronala media till varje brunn.</li>
	<li>Inkubera mikroplattan i rumstemperatur för 15 min. inkubation i 5% CO2 är rekommenderad men inte nödvändigt.</li>
</ol>3. Immunolabelling (i LAF)
<ol><li>Förbereda en 1:150 utspädning av anti-GluA1 eller anti-GluA2 antikropp i neuronala media.</li>
	<li>Ta bort neuronala media lades till i steg 2,6. Tillsätt 50 µL av de anti-GluA1 eller anti-GluA2 antikropp lösningarna till motsvarande brunnar i 20 min i rumstemperatur att tillåta antikropp bindande. Tillsätt 50 µL av neuronala media till sekundär antikropp bara kontrollbrunnarna.</li>
	<li>Ta bort de antikropp lösningar lade till i steg 3,2. Tvätta mikroplattan 3 gånger med 100 µL per brunn rumstemperatur neuronala media att ta bort några obundna antikroppar.</li>
	<li>Gör en 50 mM stamlösning av DHPG i neuronala media eller cell kultur grade vatten. Vortex lösningen kort att helt upplösa DHPG. Förbereda denna lösning frisk samma dag av experimentet. Undvik att använda gamla eller tinade lösningar.</li>
	<li>Späd stamlösningen i neuronala media till 1: 500 att göra en 100 µM-lösning.</li>
	<li>Ta bort befintliga media från varje brunn. Tillsätt 100 µL per brunn 100 µM DHPG stamlösning från steg 3,5. Inkubera mikroplattan i inkubatorn vid 37 ° C i 5% CO2 i 10 min.</li>
	<li>Ta bort den DHPG lösningen lade till i steg 3.6 och tillsätt 100 µL per brunn neuronala media. Upprepa detta en gång. Placera mikroplattan i inkubatorn vid 37 ° C i 5% CO2 för 5 min.</li>
	<li>Lägg till sackaros för att göra den 4% paraformaldehyde/4% sackaroslösning i PBS på samma dag av experimentet. Undvik att använda gamla eller tinade lösningar. Ta bort media lade till i steg 3,7. Tillsätt 100 µL per brunn av 4% paraformaldehyde/4% sackaroslösning. Upprepa steg 3,6-3,8 för varje ytterligare tidpunkt. När du är klar, inkubera mikroplattan vid 4 ° C i 20 min. Varning: Hantera PARAFORMALDEHYD bestånd i dragskåp.</li>
	<li>Ta bort fixativ från steg 3,8 och tillsätt 100 µL per brunn av kallt 1 x DPBS.</li>
	<li>Ta bort DPBS. Tillsätt 150 µL per brunn blockerande buffert (en ready-to-use formulering i TBS, se Tabell av material) och inkubera vid rumstemperatur för 90 min. Alternativt, inkubera över natten vid 4 ° C.</li>
</ol>4. märkning yta receptorer
<ol><li>Förbereda en 1: 1500 utspädning av 680RD get antimus IgG sekundär antikropp i blockerande buffert.</li>
	<li>Ta bort blockerande buffert från steg 3.10. Tillsätt 50 µL per brunn av sekundär antikropp lösningen och inkubera i rumstemperatur i 60 min. Håll mikroplattan skyddas från ljus när de sekundära antikropparna har lagts till. Se till att fortsätta att skydda mikroplattan från ljus under efterföljande inkubationer.</li>
	<li>Ta bort lösningen från steg 4,2. Tillsätt 100 µL per brunn TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) och inkubera vid rumstemperatur för 5 min. Upprepa detta steg 4 ytterligare gånger.</li>
	<li>Ta bort TBS från steg 4,3. Tillsätt 100 µL per brunn 4% paraformaldehyde/4% sackaros i PBS och odla i rumstemperatur i 15 min.</li>
	<li>Lösning ta bort steg 4,4. Tillsätt 100 µL per brunn TBS och odla i rumstemperatur i 5 min. Upprepa detta steg 2 ytterligare gånger.</li>
</ol>5. märkning internaliserade Receptor befolkningen
<ol><li>Förbereda TBS som innehåller 0,2% saponin. Vortex lösningen kort på saponin-Pulvret löses upp helt. Filtrera lösningen använder ett 0,2 µm filter för att ta bort eventuella partiklar som kan orsaka auto-fluorescens.</li>
	<li>Tillsätt 150 µL TBS som innehåller 0,2% saponin och odla i rumstemperatur i 15 min.</li>
	<li>Ta bort saponin lösning från steg 5.2 och tillsätt 150 µL per brunn blockerande buffert. Odla i rumstemperatur i 90 min.</li>
	<li>Förbereda en 1: 1500 utspädning 800CW åsna antimus IgG sekundära antikroppar i blockerande buffert.</li>
	<li>Bort steg 5.3 blockerande buffert och tillsätt 50 µL per brunn av sekundär antikropp lösningen. Odla i rumstemperatur i 60 min.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL per brunn TBS och odla i rumstemperatur i 5 min. Upprepa detta steg 4 ytterligare gånger.</li>
</ol>6. imaging och analys
<ol><li>Bild 96 brunnar mikroplattan med hjälp av en infraröd laser som tänkbar system enligt tillverkarens anvisningar. Ställa in skanningsupplösning till 84 µm, scan kvaliteten till medium och fokus motbokas enligt bas höjd 96 brunnar mikroplattan används. Klicka på ”Image Studio” menyn knappen → Exportera → bild för Digital Media → exportera bilder med en upplösning på 300 dpi, i TIFF-format.</li>
	<li>Hämta bild J ”Fiji” på https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Öppna bild i bild J ”Fiji”. Split färgkanaler genom att klicka på menyn ”bild” Färg → Split kanaler.</li>
	<li>Öppna den ROI Managerfrån från ”analysera” → ”verktyg”. Markera rutan ”etiketter” i ROI chefen att märka cirklar med siffror.</li>
	<li>I röda kanalen (680 nm ytan receptor poolen), Välj den Region av intresse (ROI) genom att välja cirkelverktyget och rita en cirkel som exakt passar den första brunnen. Tryck på Ctrl + T.</li>
	<li>Dra cirkeln till nästa väl och tryck Ctrl + T. Upprepa tills alla brunnar är inringad.</li>
	<li>Den ROI manager, klicka på ”åtgärd”. Markera de värden som visas och kopiera dem till ett kalkylblad.</li>
	<li>Klicka på den gröna kanalen (800 nm inre receptor poolen) och sedan införliva de valda ROIs från steg 6,6 till bilden. Den ROI manager, klicka på ”åtgärd”. Markera de värden som visas och kopiera dem till ett kalkylblad.</li>
	<li>Beräkna genomsnittlig integrerad täthet värdena från sekundärt endast kontrollbrunnar. Subtrahera integrerad täthet värdena för varje experimentella brunn från sekundära bara kontroll integrerad täthet medelvärdena för surface receptor poolen. Upprepa detta steg för interna receptor poolen.</li>
	<li>Beräkna förändringar i ytan receptoruttryck med tsrt, där Rs representerar integrerad tätheten av yta receptorer och Rt integrerad tätheten av yta receptorer + integrerad täthet av interna receptorer.</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

AMPA-receptorer är ett jonotropa glutamat receptor subtyp som är integrerad för neuronala funktioner som inkluderar synaps bildas, synaps stabilitet och synaptisk plasticitet. AMPA receptor störningar är kopplad till flera neurologiska24 och anses attraktiva drog mål40. Studier har exempelvis visat att en av de tidigaste tecknen på Alzheimers sjukdom (AD) är synapse förlust och minskat synaptic AMPA receptor nivåer41,42. Spännande, försämrar tillägg av Amyloid-ß oligomerer surface GluA1-innehållande AMPA receptoruttryck vid synapser43. Ytterligare, status epilepticus down-reglerar GluA2 mRNA och protein i hippocampus nervceller före sin död44. Amyotrofisk lateralskleros (ALS), tjära DNA-bindande protein (TDP-43) patologi, en ALS-specifika molekylära abnormitet, har varit kopplade till ineffektiva GluA2 Q/R webbplats-RNA redigering45.
Hög-innehåll AMPA receptor människohandel analysen ger ett effektivt medel för att mäta massredigering i receptorn människohandel profiler inom ett neuronala nätverk svar på olika faktorer, förbrukar mycket mindre tid och material än alternativa metoder. En enda 96 brunnar mikroplattan ger många brunnar för att köra flera tekniska replikerar och kontroller för olika experimentella förhållanden i samma platta. Låg plätering tätheten av 2 x 104 celler per brunn i förhållande till 5 x 105 celler per brunn densiteten minskar avsevärt antalet djur och material som krävs för varje experiment (figur 1). Infraröd skannern kan bilden upp till sex 96 brunnar mikroplattor i taget. Analysen kan också ändras till en 384-väl mikroplattan46, som blir särskilt värdefulla om analysen körs på dyrbara prover som är svårt att få eller är dyra att kultur (t.ex. mänskliga prover och inducerade pluripotenta stamceller). Hela analysen kan fyllas i och analyseras samma dag, vilket sparar värdefull tid (figur 1).
För framgångsrika och effektiva komplettering av analysens måste några punkter beaktas. Först, är det viktigt att förbereda DHPG lösningen på den samma dagen av neuron behandling. Inte återanvända eller frysa DHPG bestånd. 4% paraformaldehyde/4% sackaros i PBS lösning bör också göras färsk samma dag av experimentet. Det andra kontrollbrunnar behandlas med TTX endast eller fordon är skyldiga att säkerställa att de effekter som observerats är specifika för behandling. Det är också viktigt att inkludera brunnar som behandlats med endast de sekundära antikropparna mot kontroll för bakgrunden fluorescens produceras av icke-specifik bindning. Observera att fixering steg (följande bortspolning av sekundära antikroppar) är nyckeln till att minska sekundär antikropp bakgrundseffekter och uppnå effektiv märkning av receptorn subenheter.
Kompromisser och begränsningar, finns som med någon metod. Denna analys ger inte encelliga (eller subcellulär) upplösning och tillåter inte för realtidsspårning av receptorn människohandel som andra metoder32,33,35. Dessutom måste korrekt vara försiktig under vilket steg av nervceller, eftersom denna metod kommer att vara känsliga för läckage av intracellulära komponenter när det gäller alltför permeabilisering.

Omfattningen och tidsmässiga dynamiken i neuronal excitabilitet är till stor del beroende av tillgången till och sammansättning av surface receptor populationer som transduce elektrokemiska signaler. Syntes av nya receptorer (eller receptor subenheter) är generellt ett energiskt kostsam och relativt utdragna process, en mängd cellulära maskineriet tillägnad endo- och exocytos av befintliga receptorer ger ett sätt för deras snabbt införande och borttagning till och från membran1. Därför, förutom transkriptionell och translationell regleringen av receptorer, posttranslationell receptor människohandel är en viktig modulator av neuronal excitabilitet.
Synaptisk plasticitet, eller ändra styrkan av anslutningar mellan nervceller med erfarenhet, är tänkt att utgöra grunden för inlärning och minne2,3. Förstärkning och försvagning av synapser över tid, kallas långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD), respektive kan moduleras genom handel med α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) receptorer 4 , 5. AMPA-receptorer är heterotetramers består av fyra subenheter (GluA1-4), och medla majoriteten av snabbt excitatoriska synaptisk transmission i hjärnan6. Neuron retbarhet alltså till stor del en funktion av mängden AMPA-receptorer på postsynaptiska yta tillgänglig för att aktiveras av glutamat. LTD är ofta förknippad med en ökning av AMPA receptor endocytos, LTP är huvudsakligen associerade med en ökning av AMPA receptor exocytos. Postsynaptiska ytan uttryck av AMPA-receptorer kräver endosomal leverans till exocytotic proteiner, där fusion med plasmamembranet sedan inträffar i en kalcium-beroende sätt7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. det finns också en mängd mekanismer som reglerar aktiviteten-beroende AMPA receptor endocytos. Ett exempel på detta är via den omedelbara tidiga genen Arc/Arg3.1 (Arc). Bland andra funktioner15, Arc är känt att medla metabotropa glutamat receptor (mGluR)-beroende LTD genom att främja AMPA receptor endocytos genom dess bindande partner, som inkluderar endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 och dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, vid clathrin-belagda gropar20,21. Internaliserad AMPA-receptorer kan antingen återvinnas tillbaka till plasmamembranet eller öronmärkt för nedbrytning22,23.
Ännu viktigare, bidrar subenhet sammansättningen av AMPA-receptorer till deras människohandel dynamics24. Av större betydelse är den intracellulära C-terminal domänen av subunitsna, där majoriteten av posttranslationell modifieringar och människohandel-relaterade proteininteraktioner inträffar. GluA1 och GluA4 subunit-innehållande AMPA-receptorer är särskilt benägna att vara människohandel till cellytan under LTP, delvis på grund av deras PDZ ligander, ~ 90 amino syra ordnar som främjar membran förankring via interaktioner med olika PDZ domän-innehållande proteiner25,26. Däremot, tenderar AMPA-receptorer som innehåller GluA2 och saknar GluA1 eller GluA4 att vara människohandel konstitutivt men ackumuleras intracellulärt med synaptisk aktivitet27. GluA2 subenheter genomgå RNA redigering som, förutom att främja bevarande i endoplasmatiska retikulet28återger kanal pore ogenomtränglig för kalcium29, ytterligare ifrågasätta subunit-specifika människohandel som en central förmedlare av neuronala homeostas och plasticitet. Intressant, har störningar av ubiquitin-beroende Arc nedbrytning visat sig öka GluA1 endocytos och öka ytan uttrycket av GluA2 subunit-innehållande AMPA-receptorer efter induktion av mGluR-LTD med den selektiv grupp I mGluR-agonist (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), som anger att mycket återstår läras om mekanismer och roll subunit-specifika AMPA receptor människohandel30.
Metoder för att följa förändringar i ytan uttryck av receptorer är ofta besvärliga, tidskrävande eller införa onödiga förvirrar. Biotin-baserade analyser finns en genomgripande och kommersiellt tillgänglig metod. Affinitet rening av biotinylerade yta receptorer representerar ett sådant exempel, men behovet av utför elektrofores kräver en stor mängd provmaterial och kan återge screening av flera behandlingar ett oöverkomligt långa bearbeta31. Förlängningar av denna analys, där flera tidpunkter av etiketterings- och immunoprecipitations utförs för att kvantifiera den gradvisa nedbrytningen av en första signal, på samma sätt försumma tillägg av nya — eller återvunnet — receptorer på cellens yta och bara förvärra tid och materialbehov.
Andra tillvägagångssätt gör användning av chimära konstruktioner eller tillägg av fluorescerande Taggar att iaktta receptor människohandel32, ibland med levande cell imaging33,34. Medan potentiellt kraftfulla, kan dessa mönster påverka de normala människohandel mönster av receptorer beror på mutationer eller dramatiska förändringar infördes i dessa proteiner med molekylvikt. Användning av färgämnen att etiketten subcellulär fack genom att rikta lågt pH34,35 är ospecifika och göra åtskillnad mellan olika intracellulära fack viktigt för receptorn människohandel (e.g. lysosomer och proteasomen) svårt. Slutligen, användning av konfokalmikroskopi att visualisera colocalization av receptorer med markörer associerade med människohandel och nedbrytning, såsom endosomal proteiner eller clathrin, samtidigt som potentiellt användbar insikt i specifika lokalisering med subcellulär upplösning, är tid, arbetskrävande och kostsam på grund av nödvändigheten av att individuellt analysera varje cell och kravet på confocal eller super-resolution mikroskopi.
Här visar vi en hög-innehåll receptor människohandel analysmetod som är kompatibel med neuronala primärkulturen preparat30. Denna metod etiketter separat yta och intracellulära receptorn pooler av fasta nervceller, möjliggör en presentation av uppgifter i förhållande till normaliserade yta eller internaliserade täthet till totala tätheten för denna receptor. Hög-innehåll arten av denna metod är idealisk för screening flera behandlingar och/eller genotyper i en kort tid, och kräver endast standard cellen odling och antikropp inkubation expertis.
Kort, primära nervceller odlas i standard 96 brunnar mikroplattor och sedan behandlas som dikteras av experimentell design, inkuberas med primära antikroppar, tvättas och fast. Cellerna inkuberas därefter med en sekundär antikropp att märka yta receptorer, följt av en annan fixering steg. Vilket sedan inträffar och en andra sekundär antikropp används för att märka inre receptor pooler. Slutligen är celler avbildas med hjälp av en infraröd fluorescerande mikroplattan scanner för att kvantifiera integrerad tätheten av varje receptor befolkningen. Figur 1 sammanfattar våra high-innehåll assay jämfört med en traditionell biotinylation analys.
Medan protokollet erbjuds här är optimerad och specifika för AMPA receptor människohandel primära Hippocampus neuron kulturer, proceduren kunde, i teorin, utökas och anpassas för olika receptorer i en mängd olika celltyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Postsynaptiska människohandel receptorer till och från cellytan är en viktig mekanism som nervceller modulera deras lyhördhet för olika stimuli. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA)-receptorer, vilka är ansvariga för snabbt excitatoriska synaptisk transmission i nervceller, smugglas till och från den postsynaptiska ytan att dynamiskt ändra neuronal excitabilitet. AMPA receptor människohandel är viktigt för synaptisk plasticitet och kan störas vid neurologisk sjukdom. Dock vanligare metoder för kvantifiering av receptorn människohandel ignorera hela receptor pooler, är alltför tid - och arbetsintensiva, eller störa normala människohandel mekanismer och därför komplicerar tolkningen av resulterande data. Vi presenterar en hög-innehåll analysmetod för kvantifiering av både ytan och inre AMPA receptor populationer i odlade primära Hippocampus nervceller med dubbla fluorescerande immunolabeling och nära infrarött fluorescerande 96 brunnar mikroplattan skanner. Detta tillvägagångssätt underlättar snabb screening av bulk internaliserat och ytan receptor tätheter samtidigt minimera provmaterial. Vår metod har dock limitationsin erhålla encelliga upplösning eller genomföra levande cell imaging. Detta protokoll kan slutligen vara mottagliga för andra receptorer och olika celltyper, förutsatt att rätt justeringar och optimering.

Båge/Arg3.1 accelererar AMPA receptor endocytos genom interaktion med AP-2, endophilin-3 och dynamin-216,18 efter mGluR aktiveringen37. I Arc inpressning mouse (ArcKR), är lysines, 268, 269 i Arc proteinet muterat till arginin, som interfererar med Arc ubikvitinering. Detta försämrar proteasom-beroende omsättning på Arc och förlänger dess halveringstid i nervceller21,30. I detta experiment undersöktes varaktigheten av Arc reglera AMPA receptor människohandel med hög-innehåll AMPA receptor människohandel analys. Nervceller behandlades med den Na+ kanal blockeraren TTX, vilket hämmar handlingspänningar och minskar Arc nivåer38, följt av DHPG, som framkallar Arc översättning och ubikvitinering37,39. Både yta och internaliserad pooler av GluA1 - (figur 2A) och GluA2-innehållande (figur 3A) AMPA receptor subenheter mättes på 5 och 15 min efter DHPG blekt. Detta särskilt experiment används tre tekniska replikat från 3 oberoende experiment. ArcKR nervceller visade ökad GluA1 endocytos när de behandlades med DHPG jämfört med WT nervceller, en effekt som inte sågs när nervceller behandlades med TTX endast (figur 2B). Yta uttryck för GluA2 subenheter var signifikant förhöjda vid kort tidpunkter jämfört med WT nervceller (figur 3B), vilket indikerar en potentiell subenhet ersättning30. Vissa brunnar behandlades med sekundära antikroppar endast till kontrollen för bakgrunden fluorescens orsakas av ospecifik bindning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figur 1: jämförelse av AMPA receptor hög-innehåll människohandel analysen till receptorn biotinylation analysen. Hög-innehåll människohandel analysen förbrukar mindre tid och resurser jämfört med standard biotinylation analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figur 2: ytan och inre populationer av GluA1 AMPA receptor subenheter i WT och ArcKR Hippocampus nervceller. (A) yta (sGluA1) och internaliserade (iGluA1) GluA1-innehållande AMPA receptor subenheter i WT och ArcKR Hippocampus nervceller på 5 och 15 min efter DHPG blekt. ArcKR nervceller jämfört med WT, och har en ytterligare minskning av de sGluA1-innehållande AMPA receptor pool 5 och 15 min efter DHPG blekt. (B) diagrammet representerar ytan fluorescens normaliserade till totala fluorescensintensiteten. Statistiska jämförelser genomfördes med en envägs ANOVA, Parade och oparade Student's t-test. p ≤ 0,05; n = 3 tekniska replikat från 3 oberoende experiment. Värdena representerar medelvärde ± SEM. Denna siffra har ändrats från väggen, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figur 3: ytan och inre populationer av GluA2 AMPA receptor subenheter i WT och ArcKR Hippocampus nervceller. (A) samma experimentella skick som figur 2. Jämfört med WT, har ArcKR nervceller en ökning i sGluA2-innehållande AMPA receptor poolen 5 min efter DHPG blekt. (B) diagrammet representerar ytan fluorescens normaliserade till totala fluorescensintensiteten. Statistiska jämförelser genomfördes med envägs ANOVA, Parade och oparade Student's t-test. p ≤ 0,05; n = 3 tekniska replikat från 3 oberoende experiment. Värdena representerar medelvärde ± SEM. Denna siffra har ändrats från väggen, M. J. et al. 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Neuronal excitabilitet kan moduleras genom en dynamisk process av endo- och exocytos av excitatoriska jonotropa glutamatreceptorer. Beskrivs här är tillgänglig, hög-innehåll test för kvantifiering av ytan och inre receptor populationer.

En hög-innehåll analys för övervakning AMPA Receptor människohandel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Här visar vi en hög innehåll receptor trafficking assay som är kompatibel med primära neuronal kultur beredning. Denna metod etiketter separat ytan en inter cellar receptor pooler av fasta nervceller. Möjliggöra presentation av data som ett förhållande mellan normaliserad yta eller internaliserad receptortäthet och den totala tätheten av den receptorn.Den höga innehåll och receptor människohandel assay ger ett verkställt sätt för att mäta bulk förändringar i receptorer människohandel profiler inom ett neuralt nätverk som svar på olika faktorer. Konsumerar mycket mindre tid och material än alternativa metoder. Störningar och i preceptors trafficking har kopplats till flera neurologiska sjukdomar, och anses vara ett attraktivt mål för läkemedelsbehandling.För exempel studier har visat en av de tidigaste tecknen på Alzheimers sjukdom är synaptisk förlust och minskad synaptiska och preceptor pooler. Denna teknik kräver många olika steg av varierande svårighetsgrad. Särskilt eftersom hantering av 96 väl plattan och manipulera brunnarna kan visa sig vara svårt för någon utan erfarenhet.Och eftersom resultaten av experimentet är mycket känsliga för felaktig hantering, är det användbart att visa de olika stegen som utförs. Instruktör Till att börja med mata nervceller i 96 väl plattan genom att ta bort 100 mikroliter av de redan existerande medierna från varje brunn. Och ersätta den med 100 mikroliter av media förvuppvade till 37 grader Celsius.Var tredje till fjärde dag. En dag in vitro 14, använd en multi-pipet att ta bort 100 mikroliter media från varje brunn och pool medierna. Lägg till två mikroliter av TTX Stock-lösning till en milliliter av det poolade konditionerade mediet för att skapa en fyra mikromolarlösning av TTX.Behandla nervcellerna i varje brunn med 100 mikroliter av fyra mikromolar TTX-lösning. Om det inte finns tillräckligt med poolade villkor media lägga till några av de tidigare lagrade media. Inkubera i en 5%CO2 inkubator vid 37 grader Celsius i fyra timmar.Efter detta ta bort den befintliga TTX som innehåller media och tillsätt 200 mikroliter av förvuxna neuronala medier, och inkubera mikroplattan vid rumstemperatur i femton minuter. Ta först bort neuronala media från mikroplattan. Tillsätt femtio mikroliter av anti gluA1 eller anti gluA2 antikroppslösningen till motsvarande brunnar av mikroplattan.Lägg femtio mikroliter av neuronal media till den sekundära antikroppen bara kontrollera brunnar. Inkubera i rumstemperatur i tjugo minuter för att möjliggöra antikroppsbindning. Efter detta ta bort de befintliga medierna från brunnar.Tvätta mikroplattan tre gånger med 100 mikroliter av rumstemperatur neuronala medier per brunn för att ta bort eventuella obundna antikroppar. Tillsätt sedan 100 mikroliterrar 100 mikromolar av DHPG stamlösning till varje brunn. Inkubera i en 5%koldioxid inkubator vid 37 grader Celsius i tio minuter.Nästa bort DHPG lösningen och lägga till 100 mikroliter av neuronal media till varje brunn. Upprepa denna process en andra gång. Sedan inkubera i 5%-koldioxidinkubatorn vid 37 grader Celsius i fem minuter.På dagen för experimentet förbereda en lösning av 4%paraformaldehyd och 4%sackaros NPBS. Ta bort media från varje brunn och ersätta den med 100 mikroliter av paraformaldehyden och sackaroslösningen. Upprepa denna process för varje tilläggspunkt.Inkubera mikroplattan vid 4 grader Celsius i tjugo minuter. Ta sedan bort fixative och lägga till 100 mikroliter av DPBS till varje brunn. Ta bort DPBS och lägg till 150 mikroliter av blockerande buffert till varje brunn.Inkubera i rumstemperatur i nittio minuter. Ta bort den blockerande bufferten och tillsätt 50 mikroliter av den sekundära antikroppslösningen till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i sextio minuter samtidigt som plattan förvaras skyddad från ljus.Ta bort antikroppslösningen och tillsätt 100 mikroliter TBS till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Upprepa denna process, ta bort media från brunnarna lägga TBS, och inkubera i rumstemperatur fyra ytterligare gånger.Efter detta, ta bort TBS från mikroplattan. Tillsätt 100 mikroliter av en lösning av 4%paraformaldehyd och 4%sackaros i PBS till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i femton minuter.Ta bort paraformaldehydlösningen och tillsätt 100 mikroliter TBS i varje brunn, och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Upprepa detta steg två ytterligare gånger. Först förbereda en lösning av TBS som innehåller 2%saponin och vortex lösningen kort för att helt lösa upp saponin pulver.Med hjälp av ett 2 mikrometerfilter filtrerar du lösningen så att eventuella partiklar som kan orsaka autofluorescens avlägsnas. Tillsätt 150 mikroliter av denna 2%saponinlösning till varje brunn, och inkubera i rumstemperatur i femton minuter. Ta sedan bort saponinlösningen, och tillsätt 150 mikroliter av blockerande buffert till varje brunn.Inkubera i rumstemperatur i nittio minuter. Efter detta ta bort den blockerande bufferten och lägga femtio mikroliter av den sekundära antikroppslösningen till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i sextio minuter.Tillsätt sedan 100 mikroliter TBS till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Upprepa denna process lägga TBS och inkubering i rumstemperatur fyra ytterligare gånger. Med hjälp av en infraröd laser avbildningssystem bild den 96 väl mikroplattan enligt tillverkarna instruktioner.Ställ in skanningsupplösningen på 84 mikrometer. Skanningskvaliteten till medium och fokusförskjutningen enligt bashöjden på den 96 brunnsmikroplåt som används. Klicka på bildstudio-menyknappen, exportera bild för digitala media och exportera bilderna med en upplösning på 300 dpi i TIFF-format.Öppna bilden i ImageJ Fiji. Dela färgkanalerna genom att klicka på bildmenyn och sedan färg, dela kanaler. Öppna sedan ROI-chefen från analysera, verktyg.Markera rutan för etiketter i ROI-chefen, för att klassificera cirklarna med siffror. I den 6 80, eller röda kanalen, väljer du den region av intresse genom att välja cirkelverktyget och rita en cirkel som exakt passar den första brunnen. Tryck sedan på Ctrl plus T, dra cirkeln till nästa brunn.Upprepa denna process tills alla brunnar är inringade. Från roi-hanteraren klickmått. Markera de värden som visas och kopiera dem till ett uppslagsblad.Klicka nästa på den gröna kanalen och transponera de valda ROIs till bilden. Från roi-hanteraren klickmått. Markera de värden som visas och kopiera dem till ett uppslagsblad.Efter detta beräkna ändringarna ytan receptor uttryck som beskrivs i textprotokollet. I detta förfarande persistensen av båge i reglering ampa receptor människohandel undersöks med hjälp av hög halt ampa receptor trafficking och assay. Nervceller behandlas med natrium-jon kanalblockeraren TTX som hämmar åtgärder potentialer och minskar bågnivåer.Följt av DHPG som inducerar bågöversättning och ubiquitination. Både yta och internalisera pooler av gluA1 och gluA2 innehållande apa receptor underenheter mättes vid fem och femton minuter efter DHPG washout. ArcKR nervceller visar ökad gluA1 endositosis när de behandlas med DHPG, jämfört med medan typ nervceller.Denna effekt ses inte när nervceller behandlas med endast TTX. Ytuttryck av gluA2-subenheten ökas signifikant vid korta tidpunkter jämfört med wile typ nervceller. Indikerar en potentiell subenhetsersättning.Försäkra att cellerna är illikvida fasta paraformaldehyd bör förberedas färska på dagen för experimentet. Celler måste vara re fast efter märkning för ytan receptorerna. Andra metoder såsom confocal mikroskopi kommer att kunna ge encellig upplösning för att ytterligare karakterisera relaterade förändrats i neuronal struktur och receptor lokalisering.Störa den tidsmässiga dynamiken i bågen förändrar ampa receptorer människohandel som svar på MgluR medierad LTD. Framtida riktningar kommer att vara att mäta ampa receptorer människohandel som svar på andra stimuli. Denna analys kanske kan anpassas till andra celltyper, behandlingar och receptorer, förutsatt att förfarandet noggrant justeras och valideras på lämpligt sätt.Man måste vara noga med att säkerställa att celltäthet, behandlingstider, fixationssteg, permeabiliseringssteg och reagensval optimeras ditt intressesystem. För ett framgångsrikt och effektivt slutförande av analysen är det viktigt att förbereda DHPG-lösningen och 4%paraformaldehyd, 4%sackaroslösning på dagen för experimentet. Kontroll behandlas väl med vakeel eller TTX krävs för att säkerställa att de observerade effekterna är specifika för behandlingen.Det är också viktigt att inkludera brunnar som behandlas med endast sekundära antikroppar för kontroll för bakgrund fluorescens produceras av icke-specifik bindning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Eye Movement Övervakning av Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Med hjälp av en α-bungarotoxinbindning Site Tag att studera GABA A-receptorn Membran Lokalisering och människohandel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

En hög halt Imaging analys för Identifiering av botulinneurotoxin hämmare

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-cell mätning av luktämnet Receptor aktiveringen med en realtid cAMP-analys

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

En enkel Cell-baserad immunofluorescens analysen att upptäcka autoantikroppar mot N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorn i blod

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder för upptäckten av nya föreningar modulera en Gamma - aminosmörsyra Receptor typ en Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Realtid i Vitro övervakning av luktreceptor aktivering av en Luktämnet i gasfasen

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...