Name: a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

Zachary Allen teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Whitehall Vakfı (Grant 2017-05-35) tarafından desteklenen ve A.M.M. gökçek ve D.W.Y. Cleon C. Arrington araştırma başlatma hibe programı (teçhizat-93) her ikisi de Georgia State Üniversitesi Neurogenomics 2CI arkadaş grubu tarafından desteklenen.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgia State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. birincil hipokampal nöronların (laminer akış Hood) hazırlama
<ol><li>Karma seks postnatal günden (P) birincil hipokampal nöronların izole 0-1 fareler daha önce açıklandığı gibi36.</li>
	<li>96-şey poli-D-lizin nöronlarda plaka Mikroplaka iyi başına 2 x 104 hücre yoğunluğu, kaplı.</li>
	<li>10 mL 50 ekleyerek nöronlar beslenmesi için ortam hazırlamak B-27, 5 mL 100 x glutamin de, 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) 242 µL ve 10 x 10 mg/mL viomisin nöronal medya (bkz. Tablo reçetesi) 485 ml µL.</li>
	<li>Besleme nöronlar daha önce açıklandığı gibi36 yarısı kaldırarak (100 µL) medya (nöronal hayatta kalma destekleyen bileşenler içeren klimalı ortam adlandırılır) medya her kuyudan önceden var olan ve 37 ° C 100 µL ile değiştirmeye prewarmed 1.3. adımda her 3-4 gün hazırladı. Her 4˚C adım 2.3 için besleme şartına medyadan saklamak.</li>
</ol>2. DHPG (içinde Laminar akış Hood) yanıt olarak kaçakçılığı AMPA reseptör ölçme
<ol><li>Gün içinde Vitro (DIV adlı) 14, 2 mM hücre kültürü kullanarak bir konsantrasyon, bir 500 µL hisse senedi çözüm Tetradotoksin (TTX) sınıf su hazırlamak. Uyarı: TTX bir nörotoksin var. Dikkatli bir şekilde ele ve deri ile temasından sakının.</li>
	<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, 100 µL 96-şey Mikroplaka nöronların her kuyudan çıkarın ve Medya Havuzu.</li>
	<li>2 µL TTX hisse senedi çözüm adım 2.2 TTX 4 µM çözüm oluşturmak için havuza alınan klimalı ortam için 1 mL ekleyin. Yeterince havuza alınan klimalı ortam varsa, adım 1.4 saklı şartına medyasından bazıları kullanıyor.</li>
	<li>Nöronlar 100 µL/iyi TTX 4 µM çözüm ile 2.3 adımından tedavi. Mikroplaka 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 4 h için bir yer.</li>
	<li>Pasteur bir emiş hattına pipet ve Pipet Ucu steril 200 µL Pipet ucunu takın steril cam takmak. Medya her birinden de dikkatli bir şekilde çıkarın. Alt kısmındaki nöronların konumlandırıldığı Mikroplaka dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Oda sıcaklığında nöronal medya 200 µL her şey için ekleyin.</li>
	<li>15 dk. kuluçka %5 CO2 tercih edilen ancak gerekli değildir için oda sıcaklığında Mikroplaka kuluçkaya.</li>
</ol>3. Immunolabelling (içinde Laminar akış Hood)
<ol><li>Anti-GluA1 veya anti-GluA2 antikor nöronal medyada bir 1:150 seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>Adım 2,6 eklendi nöronal medyayı çıkarın. Anti-GluA1 veya anti-GluA2 antikor çözümleri 50 µL karşılık gelen kuyular antikor bağlantısına izin için oda sıcaklığında 20 dakika için ekleyin. Nöronal medya 50 µL ikincil antikor tek denetim wells için ekleyin.</li>
	<li>3.2 basamaktaki antikor çözümleri kaldırın. Mikroplaka ilişkisiz herhangi bir antikor kaldırmak için 3 kez 100 µL/iyi oda sıcaklığında nöronal medya ile yıkayın.</li>
	<li>DHPG 50 mM stok çözeltisi nöronal medya veya hücre kültür sınıf su yapmak. Girdap kısaca tam DHPG çözülmeye çözüm. Bu çözüm taze deney aynı günde hazır olun. Eski veya çözdürülen çözümleri kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>1:500 yapmak a 100 µM eriyik için nöronal medya hisse senedi çözümde sulandırmak.</li>
	<li>Varolan ortam her kuyudan çıkarın. 100 µL/iyi 100 µM DHPG stok çözüm adımı 3.5 ekleyin. Mikroplaka %5 CO2 37 ° C'de 10 dakika için kuluçka kuluçkaya.</li>
	<li>Basamaktaki 3.6 DHPG çözüm kaldırın ve 100 µL/iyi nöronal medya ekleyin. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Mikroplaka %5 CO2 37 ° C'de kuluçka 5 min için bir yer.</li>
	<li>Deney aynı gün içinde PBS %4 paraformaldehyde/4% sükroz çözüm yapmak sükroz ekleyin. Eski veya çözdürülen çözümleri kullanmaktan kaçının. 3.7 basamaktaki medyayı çıkarın. 100 µL/iyi %4 paraformaldehyde/4% sükroz çözüm ekleyin. 3.6-3.8 ek her zaman noktası için yineleyin. İşlem tamamlandığında, 20 dk için 4 ° C'de Mikroplaka kuluçkaya. Uyarı: Paraformaldehyde hisse senetleri bir duman başlıklı başa.</li>
	<li>Sabitleştirici 3.8 adımından kaldırın ve soğuk 1 x DPBS 100 µL/kuyu ekleyin.</li>
	<li>DPBS kaldırın. 150 eklemek µL/iyi (TBS içinde kullanıma hazır formülasyonu Malzemeler tabloiçin bakınız) arabellek engelleme ve alternatif olarak 90 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya, gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol>4. yüzey reseptörlerinin etiketleme
<ol><li>680RD keçi Anti-fare IgG ikincil antikor engelleme arabellekte bir 1:1500 seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>Engelleme arabellek 3.10 adımından kaldırın. 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin ve 60 dk. tutun ikincil antikor eklenir bir kez ışıktan korunan Mikroplaka oda sıcaklığında kuluçkaya. Sonraki incubations sırasında ışıktan Mikroplaka korumaya devam emin olun.</li>
	<li>Belgili tanımlık eriyik--dan adım 4.2 kaldırın. 100 µL/iyi TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) ekleyin ve 4 ek kez bu adım 5 dk. tekrarlamak için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>TBS 4.3 adımından kaldırın. %4 paraformaldehyde/4% sükroz 100 µL/kuyu içinde PBS ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm Adım 4.4 kaldırın. 100 µL/iyi TBS ekleyin ve 5 dk. tekrarlamak bu adım 2 ek kez oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
</ol>5. içselleştirilmiş reseptör nüfus etiketleme
<ol><li>TBS % 0,2 saponin içeren hazır olun. Girdap çözüm kısaca tam saponin toz geçiyoruz. Çözüm otomatik floresans neden olabilecek herhangi bir parçacıkları kaldırmak için 0.2 µm filtre kullanarak filtre.</li>
	<li>150 µL TBS ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya % 0,2 saponin içeren.</li>
	<li>5.2 adımından saponin çözüm kaldırın ve 150 µL/iyi engelleme arabellek ekleyin. 90 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>800CW eşek Anti-fare IgG ikincil antikor engelleme arabellekte bir 1:1500 seyreltme hazırlayın.</li>
	<li>5.3 adımından engelleme arabellek kaldırın ve 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin. 60 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>100 µL/iyi TBS ekleyin ve 5 dk. tekrarlamak bu adım 4 ek kez oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
</ol>6. görüntüleme ve çözümleme
<ol><li>96-şey Mikroplaka görüntüleme sistemi üreticinin yönergelerine uygun bir kızılötesi lazer kullanarak görüntü. Tarama çözünürlüğü 84 µm, orta ve odağı kullanılan 96-şey Mikroplaka taban yüksekliği göre Ofset tarama kalitesini ayarlayın. Tıklayın "Resim Studio" menü düğmesini → klibi dışa aktar → görüntü için dijital medya → ihracat görüntüleri TIFF biçiminde 300 dpi çözünürlükte.</li>
	<li>Görüntü J "Fiji" https://imagej.net/Fiji/Downloads indir</li>
	<li>Görüntü J "Fiji" açık görüntüde. "Görüntü" menüsünden tıklatarak renk kanalları bölme Renk → Split kanalları.</li>
	<li>"Analiz" → "Araçlar" ROI Yöneticisi'ni açın. Onay kutusunu "etiket" daire numaraları ile etiketlemek için yatırım getirisi Yöneticisi'nde.</li>
	<li>Kırmızı kanal (680 nm yüzey reseptör havuzu), faiz bölge (ROI) Daire aracı ve doğru bir şekilde ilk şey uygun bir daire çizim işaretleyerek seçin. CTRL + T tuşlarına basın.</li>
	<li>Daireyi de diğerine sürükleyin ve bütün wells daire içine kadar Ctrl + T. tekrar basın.</li>
	<li>ROI Yöneticisi'nden, "Ölçü"'ı tıklatın. Görüntülenir ve bir e-tabloya kopyalayın değerleri seçin.</li>
	<li>Tıklayın yeşil kanalı (800 nm iç reseptör havuzu) ve görüntü adım 6,6 ROIs seçilen işlemi tersine çevir. ROI Yöneticisi'nden, "Ölçü"'ı tıklatın. Görüntülenir ve bir e-tabloya kopyalayın değerleri seçin.</li>
	<li>İkincil ortalama entegre yoğunluk değerleri sadece kuyu kontrol hesaplayın. Entegre yoğunluk değerleri için ikincil tek entegre denetim yoğunluğu için Ortalama değerlerin yüzey reseptör havuzu deneysel her kuyudan çıkarın. İç reseptör havuzu için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Yüzey reseptör ifade burada Rs yüzey reseptörlerinin entegre yoğunluk temsil eder ve Rt gösterir yüzey reseptörlerinin entegre yoğunluk + entegre yoğunluğu Rs/rt, kullanarak değişiklikleri hesaplamak iç reseptörleri.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

AMPA reseptör kapsayan sinaps oluşumu, sinaps istikrar ve sinaptik plastisite nöronal işlevleri için ayrılmaz bir ionotropic glutamat reseptör alt türü vardır. AMPA reseptör bozulma için birden çok sinir hastalıkları24 bağlantılı ve çekici uyuşturucu hedefleri40olarak kabul edilir. Örneğin, çalışmalar bir Alzheimer hastalığı (Ah) erken işaretler synapse kaybı ve sinaptik AMPA reseptör düzeyleri41,42azalma göstermiştir. Çoğu intriguingly konularda, amiloid-β reaksiyonlar ilavesi yüzey GluA1 içeren AMPA reseptör ifade sinapslarda43bozar. Ayrıca, durum epileptikus aşağı-GluA2 mRNA ve hipokampal nöronların kendi ölüm44önceki protein düzenlemektedir. Amyotrofik lateral skleroz (ALS), TAR DNA'ya bağlanıcı protein (TDP-43) patoloji, bir ALS özgü moleküler anormallik, bağlantılı verimsiz GluA2 Q/R site-RNA45düzenleme.
Yüksek-içerik AMPA reseptör kaçakçılığı tahlil reseptör kaçakçılığı profilleri çok daha az zaman ve malzeme alternatif yöntemlere göre tüketen çeşitli faktörler cevaben nöronal ağından toplu değişiklikleri ölçmek için etkili bir yol sağlar. Tek bir 96-şey Mikroplaka birden fazla teknik çoğaltır ve aynı plaka farklı deneysel koşullar için denetimleri çalıştırmak için çok sayıda wells sağlar. 2 x 104 hücreleri/iyi göre 5 x 105 hücreleri/iyi yoğunluğu düşük kaplama yoğunluğu önemli ölçüde hayvanlar ve malzemeler her deneme (Şekil 1) için gerekli sayısını azaltır. Kızılötesi tarayıcı altı 96-şey Mikroplaka teker teker görüntü. Tahlil hangi tahlil elde etmek zordur ya da kültür (örneğin insan örnekleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler) pahalı olan değerli örnekleri üzerinde çalıştırırsanız, özellikle değerli hale gelir bir 384-şey Mikroplaka46için de değiştirilebilir. Tüm tahlil tamamlanmış ve değerli zaman (Şekil 1) kaydeder aynı gün analiz.
Tahlil başarılı ve verimli tamamlamak için bazı noktaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, DHPG çözüm nöron tedavi aynı gün hazırlamak önemlidir. Yeniden veya DHPG hisse senetleri dondurma değil. %4 paraformaldehyde/4% sükroz PBS çözümünde de deney aynı gün taze yapılmalıdır. İkinci olarak, denetim wells TTX ile sadece tedavi veya araç gözlenen etkileri tedavi için belirli olmasını sağlamak için gereklidir. Non-spesifik bağlama tarafından üretilen arka plan floresan için denetimine yalnızca ikincil antikorlar ile tedavi wells dahil etmek önemlidir. İkinci fiksasyon adım (ikincil antikorların aşağıdaki silinerek geçiş) anahtar ikincil antikor arka plan efektleri azaltılması ve etkili reseptör alt birimleri etiketleme ulaşmak olduğunu unutmayın.
Uzlaşma ve sınırlamalar, herhangi bir yöntemle gibi mevcut. Bu tahlil tek hücreli (veya hücre altı) çözünürlüğü sağlamaz ve gerçek zamanlı izleme gibi diğer yöntemleri32,33,35kaçakçılığı reseptör için izin vermez. Ayrıca, bu yöntem aşırı permeabilization durumunda hücre içi bileşenleri sızıntı için hassas olarak uygun bakım nöronlar, permeabilization adımı sırasında alınması gerekir.

Sorunun büyüklüğü ve nöronal uyarılabilirlik zamansal dinamiği bağlıdır büyük ölçüde kullanılabilirlik ve elektrokimyasal sinyalleri transduce yüzey reseptör nüfus bileşimi. Oysa yeni reseptörler (veya reseptör alt birimleri) sentezi genellikle bir enerjik pahalı ve nispeten uzun süren bir süreçtir, hücresel makine endo - ve varolan reseptörlerinin ekzositozu adanmış bir dizi sağlamak anlamına gelir onların hızlı ekleme için ve kaldırma için ve membran1. Bu nedenle, transkripsiyon ve çevirim reseptörlerinin yanı sıra, ardından reseptör kaçakçılığı nöronal uyarılabilirlik önemli bir modülatör düzenlemedir.
Sinaptik plastisite veya deneyim, nöronlar arasındaki bağlantılar değişen gücünü öğrenme ve bellek2,3temelini düşünülmektedir. Güçlendirilmesi ve uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) ve uzun süreli depresyon (LTD) olarak adlandırdığı sinapslarda zaman içinde zayıflaması sırasıyla, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri kaçakçılığı yoluyla modülasyonlu 4 , 5. AMPA reseptör vardır dört alt birimleri (GluA1-4) oluşan heterotetramers ve beyin6hızlı eksitatör sinaptik iletimi çoğunluğu aracılık. Böylece, nöron uyarılabilirlik büyük ölçüde AMPA reseptör postsinaptik yüzeyi glutamat tarafından etkinleştirilmesi için kullanılabilir miktarı bir işlevdir. LTP ağırlıklı olarak AMPA reseptör ekzositozu bir artış ile ilişkilidir, ancak LTD sık AMPA reseptör endositoz, bir artış ile ilişkilidir. Endosomal teslim exocytotic proteinler, Füzyon plazma zarı ile o zaman bir kalsiyum-bağımlı bir şekilde7,8,9', oluştuğu için AMPA reseptörlerinin postsinaptik yüzey ifadesi gerektirir 10 , 11 , 12 , 13 , 14. bir dizi etkinlik bağımlı AMPA reseptör endositoz düzenleyen mekanizmalar da bulunmaktadır. Bunun bir örneği hemen erken gen yay/Arg3.1 (Arc) olduğunu. Diğer işlevleri15arasında Arc metabotropic glutamat reseptör (mGluR) arabuluculuk bilinmektedir-AMPA reseptör endositoz endositik proteinler AP-2, endophilin-3 ve dynamin-2 içerir bağlama ortakları aracılığıyla teşvik tarafından bağımlı LTD 16 , 17 , 18 , 19, clathrin kaplı,20,21çukurlar. İçselleştirilmiş AMPA reseptör plazma membran için geri dönüşümlü veya bozulma22,23için ayrılmış.
Önemlisi, AMPA reseptör alt birim bileşimi için ticareti kendi dinamikleri24katkıda bulunur. Büyük alaka ardından değişiklikler ve ticareti ile ilgili protein etkileşimleri çoğunluğu gerçekleştiği alanının alt birimleri, hücre içi C-terminal etki alanıdır. GluA1 ve GluA4 alt birimi içeren AMPA reseptör hücre yüzeyine LTP sırasında kısmen kendi PDZ ligandlar, çeşitli PDZ ile etkileşimleri ile ankraj membran teşvik ~ 90 amino asit dizileri varlığı nedeniyle insan ticareti için özellikle apt vardır etki alanını içeren protein25,26. Öte yandan, GluA2 içeren ve GluA1 veya GluA4 eksik AMPA reseptör yapısal insan ticareti ama intracellularly sinirsel aktivite27ile birikir eğilimindedir. GluA2 alt birimleri, endoplazmik retikulum28, saklama teşvik ek olarak kanal gözenek kalsiyum29, geçirimsiz işler düzenleme RNA daha fazla göstermek için alt birim özel anahtar bir arabulucu, nöronal kaçakçılığı geçmesi homeostasis ve plastisite. İlginçtir, Ubikuitin-bağımlı Arc bozulması bozulma GluA1 endositoz artırmak ve sonra ben mGluR agonist mGluR-LTD ile seçici indüksiyon grup GluA2 alt birimi içeren AMPA reseptör yüzey ifade artırmak için gösterilen (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (çok mekanizmaları ve alt birim özel AMPA reseptör kaçakçılığı30rolü ile ilgili olarak öğrenilmesi gereken kalır gösteren DHPG).
Reseptörlerinin yüzey ifade değişimler gözlemleyerek yöntemleri çoğu kez hantal, zaman alıcı veya gereksiz tanıtmak zihnimi karıştıran. Biotin tabanlı deneyleri yaygın ve piyasada bulunan bir yaklaşım vardır. Ancak Elektroforez performans gerekliliği örnek malzeme büyük miktarda gerektirir ve birden fazla tedavi ile taranması aşırı derecede uzun işleyebilir benzeşme arıtma biotinylated yüzey reseptörlerinin böyle bir örnek temsil eder işlem31. Uzantıları nerede birden fazla zaman puan etiketleme ve immunoprecipitations ilk bir sinyal kademeli bozulması ölçmek için yapılmaktadır, bu testin benzer şekilde ihmal yanı sıra yeni — veya geri dönüşümlü — reseptörleri yüzey ve tek hücreye alevlenmesine zaman ve malzeme gereksinimleri.
Diğer yaklaşımlar chimeric yapıları kullanımı veya reseptör kaçakçılığı32gözlemlemek için floresan etiketler ekleme yapmak, bazen canlı kullanarak hücre görüntüleme33,34. Potansiyel olarak güçlü iken, bu tasarımlardan reseptörleri mutasyonlar veya molekül ağırlığı bu proteinler tanıttı dramatik değişiklikler nedeniyle normal kaçakçılığı şekillerinin etkileyebilir. Düşük pH34,35 hedefleyerek etiket hücre altı bölmeleri belirsiz ve farklı hücre içi bölmeleri reseptör ticareti (e.g. organellerin için önemli arasında ayrım yapmak boya kullanımı ve proteasomes) zor. Son olarak, trafiği ve potansiyel olarak yararlı ile belirli yerelleştirme içgörü sağlarken bozulması, endosomal proteinler veya clathrin, gibi ilişkili işaretçileri olan colocalization reseptörlerinin görselleştirmek için confocal mikroskobu kullanımı hücre altı çözünürlük, zaman, emek yoğun ve tek tek her hücre ve confocal şartı analiz gerekliliği nedeniyle pahalı veya Süper çözünürlük mikroskobu.
Burada, biz birincil nöronal kültür ürünleri30ile uyumlu olan bir yüksek-içerik reseptör kaçakçılığı tahlil göstermektedir. Bu yöntem sabit nöronların verilerin sunumunu normalleştirilmiş yüzey veya bu reseptör için genel yoğunluğu içselleştirilmiş reseptör yoğunluğu oranında olarak etkinleştirme, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları ayrı olarak Etiketler. Bu yöntem yüksek içerik doğası birden fazla tedavi ve/veya genotip bir kısa süre içinde eleme için idealdir ve sadece standart hücre kültürü çalışmalarının ve antikor kuluçka uzmanlık gerektirir.
Kısaca, birincil nöronlar içinde standart 96-şey Mikroplaka yetiştirilen sonra deneysel tasarım tarafından dikte edildiği gibi tedavi, birincil antikorlar ile inkübe, yıkanmış ve sabit. Hücreler daha sonra başka bir fiksasyon adım gelir yüzey reseptörlerinin etiketlemek için ikincil bir antikor ile inkübe. O zaman permeabilization oluşur ve ikinci ikincil antikor iç reseptör havuzları etiketlemek için kullanılır. Son olarak, hücreleri entegre her reseptör nüfus yoğunluğunu ölçmek için bir kızılötesi Floresan Mikroplaka tarayıcı kullanarak yansıma. Şekil 1 bizim yüksek-içerik tahlil ile karşılaştırıldığında geleneksel biotinylation tahlil özetler.
İşte en iyi duruma getirilmiş ve birincil hipokampal nöron kültürlerde kaçakçılığı AMPA reseptör için belirli iletişim kuralı teklif ederken, bu yordamı, teorik olarak, olabilir genişletilmiş ve hücre tipleri çeşitli farklı reseptörleri için uyarlanmış.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin Citrate (TTX)</td>
			<td>Tocris Bio-Techne</td>
			<td>Cat#1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#P7280-5X5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>Cat# 419231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50 X), Serum Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Cat#19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (EP/BP/NF)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cat#S2500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td>
			<td>Li-COR</td>
			<td>Cat#927-50003</td>
			<td>Refered to as &#34;Blocking Buffer&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>Cat#SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat#12348017</td>
			<td>Referred to as &#34;neuronal Media&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat#3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td colspan="2">https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content assay for monitoring ampa receptor trafficking

Önemli bir mekanizma tarafından onların yanıt farklı uyaranlara karşı nöronların modüle postsinaptik hücre yüzeyine gelen ve reseptörlerinin kaçakçılığı. Sinaptik iletimde hızlı eksitatör nöronlar için sorumlu olan α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri, nöronal uyarılabilirlik dinamik olarak değiştirmek için postsinaptik yüzeye gelen ve insan ticareti. AMPA reseptör kaçakçılığı için sinaptik plastisite esastır ve nörolojik hastalığı bozdu. Ancak, tüm reseptör havuzları, reseptör kaçakçılığı miktarının için yaygın olarak karşılaşılan bazı yaklaşımlar göz ardı vardır aşırı zaman - ve emek yoğun, ya da potansiyel olarak normal ticareti mekanizmaları bozulur ve bu nedenle elde edilen verilerin yorumlanması karmaşık. Biz çift floresan immunolabeling ve yakın kızılötesi floresan 96-şey Mikroplaka tarayıcı kullanarak kültürlü birincil hipokampal nöronlarda bir yüksek-içerik tahlil yüzey ve iç AMPA reseptör nüfus miktar için mevcut. Bu yaklaşım sağlar internalized toplu hızlı tarama ve örnek malzeme en aza indirerek reseptör yoğunluğunu yüzey. Ancak, bizim yöntem tek hücreli çözünürlük elde etmek veya canlı hücre görüntüleme iletken sınırlamaları vardır. Son olarak, bu iletişim kuralı diğer reseptörleri ve farklı hücre tipleri, uygun ayarlamalar ve optimizasyon sağlanan mükellef olabilir.

Ark/Arg3.1 AMPA reseptör endositoz AP-2, endophilin-3 ve dynamin-216,18 mGluR harekete geçirmek37takip ile etkileşimi aracılığıyla hızlandırır. Arc çakma fare (ArcKR), lysines 268 ve 269 Arc protein ark ubiquitination ile müdahale arginin, mutasyona. Bu proteasome bağımlı ciro ark bozar ve onun half-life nöronlar21,30uzatır. Bu deneyde, AMPA reseptör kaçakçılığı düzenlenmesinde Arc kalıcılığı yüksek içerikli AMPA reseptör kaçakçılığı tahlil kullanarak incelenmiştir. Nöronlar Na+ kanal engelleyici Aksiyon potansiyelleri engeller ve ark düzeyleri38Arc çeviri ve ubiquitination37,39neden olmaktadır DHPG tarafından takip, azaltır TTX ile tedavi edildi. Yüzey ve GluA1 - içselleştirilmiş havuzları (Şekil 2A) ve GluA2 (Şekil 3A) içeren AMPA reseptör alt birimleri DHPG silerek geç sonra 5 ve 15 dk ölçülen. Bu özel deneme 3 bağımsız deneyler üzerinden üç teknik çoğaltır kullanılan. ArcKR nöronlar WT nöronlar için karşılaştırıldığında DHPG nöronlar ile TTX sadece (Şekil 2B) tedavi edildi zaman görülen değildi bir efekt ile tedavi ederken artan GluA1 endositoz gösterdi. GluA2 alt birimleri yüzey ifade potansiyel bir alt birim yerine30gösteren WT nöronlar (Şekil 3B), karşılaştırıldığında kısa sürede noktalarda önemli ölçüde arttı. Bazı kuyular arka plan floresans nonspesifik bağlama tarafından neden olduğu için kontrol etmek için sadece ikincil antikorlar ile tedavi edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Şekil 1: karşılaştırma AMPA reseptör yüksek içerikli kaçakçılığı testin reseptör biotinylation tahlil için. Yüksek içerikli kaçakçılığı tahlil daha az zaman ve standart biotinylation tahlil göre kaynak tüketir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Resim 2: GluA1 AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar içinde yüzey ve iç nüfusu. (A)yüzey (sGluA1) ve içselleştirilmiş (iGluA1) GluA1 içeren AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar DHPG silerek geç sonra 5 ve 15 dk içinde. WT için karşılaştırıldığında, ArcKR nöronlar sGluA1 içeren AMPA reseptör havuzu 5 ve 15 dk daha fazla bir düşüş sonra DHPG silinerek geçiş var. (B) grafik yüzey floresans toplam floresan yoğunluğu için normalleştirilmiş temsil eder. Bir tek yönlü ANOVA, eşleştirilmiş ve unpaired öğrencinin t testleri kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapılmıştır. p ≤ 0,05; n = 3 bağımsız deneyler üzerinden 3 Teknik çoğaltır. Değerleri ortalama ± SEM temsil eder. Bu rakam duvardan, M. J. vd. 201830değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Şekil 3: GluA2 AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar içinde yüzey ve iç nüfusu. (A) aynı deneysel koşulu olarak Şekil 2. WT için karşılaştırıldığında, ArcKR nöronlar bir artış sGluA2 içeren AMPA reseptör havuzda 5 dk sonra DHPG silinerek geçiş var. (B) grafik yüzey floresans toplam floresan yoğunluğu için normalleştirilmiş temsil eder. Tek yönlü ANOVA, eşleştirilmiş ve unpaired öğrencinin t testleri kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapılmıştır. p ≤ 0,05; n = 3 bağımsız deneyler üzerinden 3 Teknik çoğaltır. Değerleri ortalama ± SEM temsil eder. Bu rakam duvardan, M. J. vd. 201830değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking at JoVE.com

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Burada birincil nöronal kültür hazırlığı ile uyumlu yüksek içerikli reseptör ticareti analizi gösteriyoruz. Bu yöntem, yüzeyi sabit nöronların inter mahzen reseptör havuzlarını ayrı ayrı etiketler. Normalleştirilmiş yüzey veya içselleştirilmiş reseptör yoğunluğunun reseptörün genel yoğunluğuna oranı olarak verilerin sunulmasını sağlamak.Yüksek içerik ve reseptör ticareti talimi, çeşitli faktörlere yanıt olarak bir sinir ağı içindeki reseptör ticareti profillerindeki toplu değişiklikleri ölçmek için etkili bir araç sağlar. Alternatif yöntemlere göre çok daha az zaman ve malzeme tüketen. Kesintiler ve preceptors ticareti birden fazla nörolojik bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, ve ilaç tedavisi için cazip bir hedef olarak kabul edilir.Örnekler için çalışmalar Alzheimer hastalığının en erken belirtilerinden biri sinaptik kaybı ve azalmış sinaptik ve preceptor havuzları olduğunu göstermiştir. Bu teknik, zorluk değişen birçok farklı adımlar gerektirir. Özellikle 96 iyi plaka işleme ve kuyular manipüle deneyimi olmayan biri için zor kanıtlayabilir çünkü.Ve denemenin sonuçları yanlış işlemeye karşı son derece hassas olduğundan, gerçekleştirilen çeşitli adımları görüntülemek yararlıdır. Eğitmen Başlamak için, her kuyudan önceden varolan ortamın 100 mikrolitre kaldırarak 96 kuyu plaka nöronlar beslemek. Ve 100 mikrolitre medyayla değiştirmek 37 santigrat dereceye kadar ısıtıldı.Her üç ya da dört günde bir. Bir gün in vitro 14, her kuyudan 100 mikrolitre medya kaldırmak ve medya havuzu için bir multi-pipet kullanın. TTX'in dört mikromolar çözeltisini oluşturmak için havuzlu klimalı ortama bir mililitre TTX Stok çözeltisi iki mikrolitre ekleyin.Her kuyudaki nöronları 100 mikrolitre dört mikromolar TTX çözeltisi ile tedavi edin. Yeterince havuzlu koşul ortamı yoksa, önceden depolanan ortamlardan bazılarını ekleyin. 4 saat boyunca 37 derecede %5'lik co2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yat.Bundan sonra ortam içeren mevcut TTX çıkarın ve önceden ısıtılmış nöronal medya 200 mikrolitre ekleyin ve on beş dakika oda sıcaklığında mikro plaka kuluçka. Önce nöronal ortamı mikro plakadan çıkarın. Mikro plaka nın ilgili kuyularına anti gluA1 veya anti gluA2 antikor çözeltisinin elli mikrolitresini ekleyin.İkincil antikor kontrol kuyuları için nöronal medya elli mikrolitre ekleyin. Antikor bağlanmasıiçin oda sıcaklığında yirmi dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra varolan ortam kuyulardan kaldırın.Herhangi bir bağlı antikorları kaldırmak için mikro plakayı her kuyuda 100 mikrolitre oda sıcaklığında nöronal ortamla üç kez yıkayın. Sonra her kuyuya 100 mikrolitre 100 mikromDHPG stok çözeltisi ekleyin. %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yat.Sonra DHPG çözeltisi kaldırmak ve her kuyuya nöronal medya 100 mikrolitre ekleyin. Bu işlemi ikinci kez yineleyin. Sonra %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yat.Deney günü%4 paraformaldehit ve %4 sakaroz NPBS çözeltisi hazırlayın. Her kuyudan medya çıkarın ve paraformaldehit ve sakaroz çözeltisi 100 mikrolitre ile değiştirin. Her ekleme zaman noktası için bu işlemi tekrarlayın.Mikro plakayı 4 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra fiksatif kaldırın ve her kuyuya 100 mikrolitre DPBS ekleyin. DPBS'yi çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin.Oda sıcaklığında doksan dakika kuluçkaya yat. Engelleme tamponunu çıkarın ve her kuyuya 50 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Tabağı ışıktan korurken oda sıcaklığında altmış dakika kuluçkaya yatın.Antikor çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. TBS ekleyerek kuyulardan ortamı kaldırarak ve oda sıcaklığında dört kez daha kuluçkaya yatarak bu işlemi tekrarlayın.Bundan sonra, mikro plaka tbs çıkarın. Her kuyuya PBS'de %4 paraformaldehit ve %4 sakaroz çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.Paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Önce % 2 saponin içeren TBS bir çözüm hazırlamak ve girdap kısaca saponin tozunu tamamen eritmek için çözüm.2 mikrometrelik filtre kullanarak, otofloresansa neden olabilecek parçacıkları çıkarmak için çözeltiyi filtreleyin. Her kuyuya bu %2 saponin çözeltisinin 150 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında on beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra saponin çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin.Oda sıcaklığında doksan dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra engelleme tampon u çıkarın ve her kuyuya ikincil antikor çözeltisinin elli mikrolitre ekleyin. Altmış dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. TBS ekleyerek ve oda sıcaklığında dört kez daha kuluçka yada bu işlemi tekrarlayın. Bir kızılötesi lazer görüntüleme sistemi görüntü kullanarak 96 iyi mikro plaka üreticilerin talimatlarına göre.Tarayın çözünürlüğünü 84 mikrometreye ayarlayın. Orta ve odak kullanılan 96 iyi mikro plaka taban yüksekliğine göre tofme tazyik. Image Studio menü düğmesine tıklayın, dijital medya için görüntü dışa aktarın ve TIFF formatında 300 dpi çözünürlüğe sahip görüntüleri dışa aktarın.Görüntüyü ImageJ Fiji'de açın. Görüntü menüsüne tıklayarak renk kanallarını bölün ve ardından renkleri, kanalları böl. Sonra analiz, araçlar dan Yatırım Getirisi yöneticisi açın.Daireleri sayılarla sınıflandırmak için YG yöneticisindeki etiketlerin kutusunu işaretleyin. 6 80 veya kırmızı kanalda, daire aracını seçerek ve ilk kuyuya doğru şekilde uyan bir daire çizerek ilgi çekici bölgeyi seçin. Ardından Ctrl artı T tuşuna basın ve daireyi bir sonraki kuyuya sürükleyin.Tüm kuyular daire içine alana kadar bu işlemi tekrarlayın. YG yöneticisinden ölçü'ye tıklayın. Görünen değerleri seçin ve bunları bir elektronik sayfaya kopyalayın.Sonraki yeşil kanala tıklayın ve seçilen ROI'ları görüntüye aktarın. YG yöneticisinden ölçü'ye tıklayın. Görünen değerleri seçin ve bunları bir elektronik sayfaya kopyalayın.Bundan sonra metin protokolünde belirtildiği gibi yüzey reseptör ekspresyonu değişiklikleri hesaplamak. Bu işlemde ampa reseptör ticaretinin düzenlenmesinde arkın kalıcılığı yüksek içerikli ampa reseptör ticareti ve tsay kullanılarak incelenmiştir. Nöronlar etki potansiyellerini inhibe ve ark düzeylerini azaltır sodyum-iyon kanal bloker TTX ile tedavi edilir.Ark çevirisi ve her yerde neden olan DHPG izledi. Apa reseptör alt ünitelerini içeren gluA1 ve gluA2 havuzları dhpg yıkamadan beş ve on beş dakika sonra ölçüldü. ArcKR nöronlar DHPG ile tedavi edildiğinde gluA1 endositoz artmış göstermek, iken tip nöronlar ile karşılaştırıldığında.Nöronlar sadece TTX ile tedavi edildiğinde bu etki görülmez. gluA2 alt ünitesinin yüzey ekspresyonu wile tipi nöronlara göre kısa zaman noktalarında önemli ölçüde artırılır. Potansiyel bir alt birim değişimini gösteriyor.Hücrelerin sıvı olmayan sabit paraformaldehit olduğundan emin olun deney günü taze olarak hazırlanmalıdır. Hücreler yüzey reseptörleri için etiketlendikten sonra yeniden sabitlenmelidir. Konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler nöronal yapı ve reseptör lokalizasyonunda daha fazla ilgili değişiklik karakterize tek hücreli çözünürlük sağlamak mümkün olacak.MgluR aracılı LTD. Gelecek yönleriyanıt olarak ark alters ampa reseptörlerinin zamansal dinamikleri bozan diğer uyaranlara yanıt olarak ampa reseptörleri ticareti ölçmek olacaktır. Bu titrebelki diğer hücre tipleri, tedaviler ve reseptörlere uyarlanabilir, prosedür dikkatle ayarlanır ve uygun şekilde doğrulanmış olması koşuluyla.Hücre yoğunluklarının, tedavi sürelerinin, fiksasyon adımlarının, permeabilizasyon adımlarının ve reaktif seçimlerinin ilgi sisteminizi optimize etmesini sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Denemenin başarılı ve verimli bir şekilde tamamlanması için DHPG solüsyonunun ve deney günü %4'lük paraformaldehit, %4 sakaroz çözeltisinin hazırlanması önemlidir. Gözlenen etkilerin tedaviye özgü olduğundan emin olmak için vakeel veya TTX ile iyi tedavi edilen kontrol gereklidir.Spesifik olmayan bağlayıcılık la üretilen arka plan floresansını kontrol etmek için sadece ikincil antikorlarla tedavi edilen kuyuları da dahil etmek önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Eye Movement Monitoring of Memory

Bellek Eye Movement Kontrolü

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...