Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

ونشكر أعضاء "اتحاد المحاكم الإسلامية بيوريسبوسيتوري"، الدكتورة كلارا فالي-ناجي، وأليكس Susma، فضلا عن أطباء، الدكتور مايكل أبيرن، ودانيال موريرا، وسيمون كريفاليرو، لتيسير اقتناء الأنسجة للثقافات الخلية الأولية. ونحن نشكر مرضى "المسالك البولية اتحاد المحاكم الإسلامية" للتبرع الأنسجة للبحوث. تم تمويل هذا العمل، في جزء منه، إدارة للدفاع البروستات سرطان البحث برنامج الصحة الفوارق فكرة جائزة PC121923 (نون) ومركز اتحاد المحاكم الإسلامية السريرية وترجمة العلوم بريدوكتورال التعليم (السريرية والعلماء متعدية برنامج PECTS) (McCray وريتشاردز) ومن معاهد الصحة الوطنية في المعهد الوطني للسرطان، ومنحة أرقام U54CA202995، U54CA202997، و U54CA203000، المعروف "شيكاغو الصحة الإنصاف التعاونية" (نون وريتشاردز). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الدفاع.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الثقافة أورجانوتيبيك طريقة جديدة مثيرة لأتصدى الأنسجة مع الراحة لبيئة في المختبر . في الوقت الراهن، تنمو مختبرات أورجانويدس من أنواع عديدة من الأنسجة لمختلف نقاط النهاية. الطرق الموضحة في هذه الورقة تلخيص نقاط النهاية مفيدة، وتسليط الضوء على تقنيات جديدة لوصف الثقافات الخلية البروستاتا الأولية 3D تماما.
وهناك مجموعة متنوعة من وصفات وسائل الإعلام لزراعة الخلايا البشرية البروستاتا الأولية أورجانويدس5،،من613. بينما الجميع تحقيق نتائج مجدية وقابلة للمقارنة، وسائل الإعلام على أساس كسفم13 يستخدم المواد المضافة إلى الحد الأدنى حتى يتم وصفها هنا. بالإضافة إلى ذلك، تم نشر ورقات استخدام تركيزات متعددة لجل مصفوفة، من 10% إلى 75% للثقافة أورجانويدس البروستاتا5،،من613. لأن جل مصفوفة كاشف مكلفة، وجل مصفوفة 33% قد ثبت أن تكون كافية لزراعة طويلة الأمد (2-3 أسابيع)،13من أورجانويدس قابلة للحياة، أونكلومبيد، وهذا هو تركيز الموصى بها. ومع ذلك، يمكن أن تختلف جل المصفوفة في تركيز البروتين بين الأرقام الكثير، حتى هذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند الطلاء. من المستحسن أيضا لشراء هلام مصفوفة بكميات كبيرة للاستخدام عبر عدة تجارب للحد من التضارب بين الكثير. وقد نشر مختبرات أخرى تنسيقات مختلفة لطلاء جل مصفوفة، مثل قطرات بدلاً من طلاء لوحة 96-جيدا جيدا5. تشكل كلا الأسلوبين أورجانويدس قابلة للحياة، ولكن بالشكل الموصوف هنا يسمح للخلايا لتكون مطلي أكثر قليلة، التي أظهرت لتشجيع توسيع نطاق الخلايا إلى أكبر أورجانويدس13. ومع ذلك، تصفيح الكثافة ينبغي أن يكون الأمثل القائم قبالة كفاءة تكوين خاصة بالمريض. هلام المصفوفة متاح في العديد من الأشكال بما في ذلك تخفيض عامل النمو، خالية من الفينول الحمراء، وعالية التركيز، إلخ. تخفيض عامل النمو ينصح بتعريف شروط الثقافة، وخالية من الفينول الأحمر المستحسن عند العمل مع الخلايا التي تعبر عن التجارة والنقل أو في التجارب التي تنطوي على التقاط صورة z-المكدس. من الأهمية بمكان إجراء أية خطوات الطلاء جل مصفوفة مع الكواشف المثلج، كمصفوفة جل يتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة.
قد يؤدي التغييرات أورجانويدس نمت تحت علاجات تجريبية مختلفة للشكل، حتى تصوير مشرق حقل يستخدم على نطاق واسع لدراسة الملاحظة المورفولوجية تعمل. ومع ذلك، تسجيل وقياس المساحة أو الشكل تحد لسببين: 1) اختيار التحيز أثناء التقاط الصور و 2) تطبيق معلمة ثنائية الأبعاد مثل المجال لنموذج ثلاثي الأبعاد. استراتيجية واحدة لالتقاط الصور هو سجل حقل عشوائي وقياس عدد محدد سلفا من أورجانويدس في هذا المجال، ولكن يمكن أن يخلق ذلك التحيز أثناء التحديد، وقد لا تكون جميع أورجانويدس في الحقل المحدد في التركيز. تصوير كل جيدا الأمثل لتنسيق الميكروسكوبية 96-جيدا يلغي هذا التحيز أخذ العينات عن طريق جمع السكان أورجانويد كامل للفائدة. ومع ذلك، اعتماداً على أهداف المجهر من ناحية، قد تحتاج حقول متعددة جمعها وتجانب بغية الحصول على صورة الجامعة، حسنا. وقد وصف بعض مختبرات قياس المجال من z-طائرة واحدة12، ولكن لالتقاط جميع أورجانويدس في التركيز، من المستحسن لجمع وكومة طائرات متعددة في شركة كهرباء فرنسا-صورة واحدة13. وفي بعض الحالات، قد يتسبب غضروف في جل مصفوفة التظليل في الصورة، وأساليب تصحيح الخلفية قد تحتاج إلى تطبيق باستخدام برنامج تحليل الصور. حجم الدقيق مثالي القياس الأكثر ملائمة لحجم أورجانويد؛ ومع ذلك، هذا صعوبة الحصول على وجه التحديد، حتى مع صور z-المكدس متعددة. يمكن بسهولة حساب الأبعاد المورفولوجية الأخرى المفيدة، مثل التدوير ونسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى، من جميع أورجانويدس في صورة هيئة كهرباء فرنسا كل بئر. معا، هذه الأساليب التغلب على أخذ العينات التحيز للتحديات وتمكين قياس البارامترات 2D من كائنات ثلاثية الأبعاد في الفضاء ثلاثي الأبعاد.
التثبيت الفورمالين وتضمين برافين أورجانويدس طريقة شائعة للحصول على الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، المناعي (المدينة)، وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت للتصور والتحليل6،11، 20-بيد أن المنشورات التي وصفت هذا الأسلوب تفتقر إلى تفاصيل شاملة عن عملية الدمج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد موقع أورجانويدس داخل كتلة البارافين الصعبة. قبل وصمة بعض مختبرات أورجانويدس مع تريبان الأزرق قبل التضمين للمساعدة في الموقع أثناء تقطيع11. يتضمن الأسلوب الموصوفة هنا استخدام صبغة النسيجي لتوجه جيلبلوج أورجانويد/علم الأنسجة خلال التضمين لتعزيز كفاءة تمزيقها. شرائح ح & ه تيسير دراسة نخر ومادة نووية، وانتشار، وهكذا ينبغي أن يكون نقطة إلزامية للثقافة أورجانويد التأكد من وجود خلايا صحية في جميع أنحاء المجال. قوة الثقافة أورجانويد هو أن عينات تتكون من خليط غير متجانس من الخلايا التي تشبه أفضل في فيفو أنسجة المريض. في البروستاتا، على سبيل المثال، الخلايا القاعدية ولومينال على حد سواء موجودة في البروستاتا أورجانويدس5، بينما الخلايا التي نمت في 2D عدم التفريق لومينال8. تقييم التمايز أورجانويد، من المستحسن أن الباحثين تقييم علامات القاعدية مثل CK5 و p63 وعلامات لومينال مثل مستقبلات الاندروجين و CK88. يمكن أيضا دراسة أي البروتينات تجريبية أخرى للاهتمام باستخدام هذه التقنيات المصبوغة.
على الرغم من تمكن المقاطع FFPE التصور الخلايا المقيمين في المقصورة الداخلية عن طريق النسجية أساليب (H & E، إذا، المدينة)، الصور تنحصر في المقاطع العرضية، وقد غيرت شكل أورجانويد قبل عملية الدمج. تلوين كل-جبل تمكن أورجانويد الملون ولوحظ في عين المكان، الحفاظ على الخصائص المورفولوجية تعمل وتسمح بصور للتعريب البروتين. تركيب كل أداة تستخدم لوصمة عار عينات الأنسجة الجامعة أو الجامع والحيوان، مثل الجنين الزرد أو الماوس، وتكييفها بسهولة أورجانويدس. تعديل الأسلوب الموصوفة هنا من الإجراء التي تتملكet al. 11تفاصيل النمو الأولية وثقافة أورجانويدس الجهاز الهضمي مباشرة على شريحة دائرة لتلطيخ، ويتطلب تثبيت ثقافة الأصل كاملة. الأسلوب المبين هنا ينطوي على نقل أورجانويد واحد (أو أورجانويدس) من الفائدة إلى شريحة دائرة في الوقت لتلطيخ. وهذا يتيح اختيار أورجانويدس الفردية لتحليل كل جبل في تجربة جارية دون تثبيت ثقافة الوالدين. عند القيام بتلوين كل جبل، من الضروري تحسين بيرميبيليزيشن وفترة حضانة للأجسام الأولية والثانوية لضمان تغلغل في جميع أنحاء العينة (في أي مكان من واحد أو أكثر من أيام هو مستحسن). وبمجرد تصويرها عبر الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن أن تنتج اﻷداءات ثلاثية الأبعاد لتمكين التعريب بروتين محدد والتصور وحساب عدد الخلايا الملون إيجابيا في عينة. التدفق الخلوي نقطة مفيدة تحديد حجم السكان القاعدية، لومينال، أو الخلايا الجذعية5،14. للقيام بذلك، استعاد جل مصفوفة الخلايا وفصلها برفق لتلطيخ. ينبغي للمستخدمين بعناية تحديد علامات مناسبة لفصل استناداً إلى الكتابات الحالية. للخلايا الظهارية البروستاتا البشرية الأولية، CD26 و CD49f بعلامات مناسبة لومينال والقاعدية، على التوالي5،21.
وباختصار، تفاصيل هذا البروتوكول النمو البشري أورجانويد البروستاتا الأولية وجمع نقاط النهاية التجريبية. من المذكرة، يمكن تطبيق تقنية متزايدة ووصف لمجموعة متنوعة من الاختبارات الأخرى التي تستخدم عادة لخلايا ثنائية الأبعاد، مثل الفلورسنت التجارب المستندة إلى التحقيق يبحث في انتشار19والمبرمج والبقع عضية سوبسيلولار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أسلوب جمع وتفكك الموصوفة هنا استعدادا ل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة18. جماعياً، وهذا يدل على إمكانية قيام مجموعة متنوعة من الرواية، النهاية عالية الدقة التي يمكن تحسين الباحثين واستكشاف في المستقبل.

أورجانويدس أداة قيمة لدراسة أورجانوجينيسيس والمرض. أنها توفر بديلاً أقل تكلفة للنماذج الحيوانية، وتتطور أورجانويدس المستمدة من المريض كاستراتيجية للطب شخصية1،،من23. ينطوي هذا النظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة زرع الخلايا الجذعية أو السلف (تحصد من الأنسجة أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent) في جل مكونات المصفوفة خارج الخلية (مصفوفة جل)4. تتكاثر الخلايا والتفريق، أسفر عن هياكل أورجانوتيبيك أن الخص في التسلسل الهرمي للهاتف الخلوي ومورفولوجيا الجهاز لوحدة وظيفية للفائدة. وقد نمت أورجانويدس استخدام الخلايا التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الأجهزة، بما في ذلك الغدة اللعابية، المعدة، الأمعاء، الكبد والبروستاتا، والرئة، والمخ4. على الرغم من أن هناك بروتوكولات عديدة تصف الخطوات إنشاء5،أورجانويدس البروستاتا6، أنها تمثل تحديا لإيجاد طرق مفصلة بما فيه الكفاية حول كيفية تحقيق النهاية الكمية من أورجانويدس. هذه الورقة يلخص الأساليب المتقدمة لخلايا البروستاتا الأساسي الإنسان وتفاصيل سلسلة من نقاط النهاية المقترحة لتقييم تعمل أورجانويد. هذه التقنيات كانت الأمثل للبروستاتا أورجانويدس ويمكن أن تنطبق على سائر الثقافات الخلية 3D.
الثقافات أورجانويد البروستاتا ظهرت مؤخرا كما أنشأت نموذجا قيماً في المختبر الذي يفتقر إلى القيود المفروضة على ثقافات أحادي الطبقة باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. ظهارة البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا التحدي لنموذج في المختبر باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. العدد خطوط الخلايا حميدة محدودة، والجميع قد شهدت تحولاً مع المسرطنة7. لا تفرق في الخلايا لومينال الخلايا الظهارية البروستاتا الأولية في مونولاييرس ونقص الاندروجين مستقبلات8. لا تملك غالبية خطوط خلايا سرطان البروستاتا مستقبلات الاندروجين الوظيفية، ووسيط هام المبكر مرض الدولة، والافتقار إلى التغيرات الوراثية الرئيسية التي وجدت في أورام المرضى9. الثقافات أورجانويد البروستاتا يمكن زراعتها بسهولة من ظهارة حميدة، وهي ذات قيمة في دراسة خصائص الخلايا الجذعية وخلايا السلف، والتمايز، وآثار التغييرات التجريبية في4،المكروية5. أورجانويدس سرطان البروستاتا يمكن زراعتها كجزء من نهج الطب الدقة لنمذجة مرض المريض واستجابة للعلاجات10.
هذا البروتوكول قد جمعت من البروتوكولات القائمة التي تستخدم مختلف أنواع الخلايا، ولكن قد تم تحسين هنا للاستخدام في خلايا البروستاتا البشرية الأولية. أنها تكمل البروتوكولات التي حددها ساورز، كليفيرس، وشين5،6 التي تصف النمو، باساجينج، تصوير مشرق الميدان، نعد، وعزل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي أورجانويدس البشرية والماوس البروستاتا. يتم تعديل البروتوكول كل جبل من ماهي et al. 11، الذي يستخدم أورجانويدس الظهارية المعوية، ويصف العيش التصوير والمجمدة والبارافين التضمين. بورتن et al. 12 وصف التحليل للثدي والقولون وسرطان القولون والمستقيم أورجانويد مورفولوجيا من تصوير مشرق الميدان. بالإضافة إلى ذلك، ريتشاردز وآخرون. 13 يستخدم أسلوب لتقييم مورفولوجك أورجانويدس البروستاتا. وأخيراً، هو جين تاو et al. 14 وصف أسلوب المنضمة البروستاتا أورجانويدس لشريحة دائرة بين ليلة وضحاها قبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت لمراقبة الخلايا المفردة وتشتت من المجالات من أجل تحليل التدفق الخلوي.
والهدف من هذا البروتوكول إثبات بتفصيل كاف هذه الأساليب تحديا تقنيا كبروتوكول واحد، بما في ذلك الخلية البذر؛ وسائل الإعلام ومصفوفة جل الصيانة؛ مجموعة من الخلايا للتدفق الخلوي؛ الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، واستخراج البروتين؛ تقييم السمات من تحليل مشرق حقل z-المكدس؛ التضمين، تجهيز وتقطيع لتلطيخ نسيجية؛ وتركيب كل لفحوصات مسبار الفلورة أو الفلورسنت. سوف تختلف أهميتها البيولوجية وتفسير هذه النهاية مختلفة بين التصميم التجريبي والأجسام المضادة المستخدمة للتحليل. من خلال الاستفادة من هذا البروتوكول، ينبغي أن يشعر المستخدمين استعداد لإعداد تجربة مع مجموعة من أدوات لنقاط النهاية.
وأنشئت البشرية الأولية البروستاتا (ما قبل) الخلايا الظهارية في المختبر ببروتوكول وصف بيهل15،16 ، والإبقاء على عدد محدود من المقاطع (ما يصل إلى أربعة) كما هو موضح سابقا17، ولكنها أيضا المتاحة من الموردين التجاريين. يتم نشر جميع تتمثل خالية من المصل المستندة إلى وسائل الإعلام6، على أساس كسفم13، و R-سبوندين 1-مكيفة5 وسائط الإعلام بإنتاجها بنجاح أورجانويدس. على أساس كسفم يتطلب أقل عدد من المواد المضافة، حيث يتم وصفها هنا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصل لثلاثي الأبعاد (3D) استزراع والمناولة، وتقييم البشرية الأساسي أورجانويدس البروستاتا. وتنطوي العملية على زرع الخلايا الظهارية قليلة في جل مصفوفة ثلاثية الأبعاد على ميكروسكوبية 96-جيدا مع التغييرات الوسائط لزراعة التوسع في أورجانويدس. ثم يتم تقييم مورفولوجيا بالجامعة، حسنا التقاط الصور z-المكدس. ضغط z-مكدسات يخلق صورة واحدة في التركيز من خلالها يتم قياس أورجانويدس التحديد الكمي لمجموعة متنوعة من النواتج، بما في ذلك تدوير والدائرية، والمنطقة. ويمكن جمع الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين من أورجانويدس استردادها من جل المصفوفة. يمكن تقييم بالانفصال أورجانويد السكان خلية للفائدة والتدفق الخلوي. الفورمالين-التثبيت-البارافين-التضمين (FFPE) متبوعاً بتقطيع يستخدم لتقييم غذائها وتلطيخ جسم. تلطيخ الجامع-جبل إيمونوفلوريسسينت يحافظ على مورفولوجيا أورجانويد ويسهل المراقبة للتعريب البروتين في أورجانويدس في الموقع. يمكن تعديل فحوصات التجارية التي تستخدم عادة لخلايا أحادي الطبقة 2D أورجانويدس ثلاثي الأبعاد. تستخدم معا، توفر التقنيات في هذا البروتوكول مجموعة أدوات قوية لقياس نمو البروستاتا أورجانويد وخصائص السمات، والتعبير عن علامات التمايز.

عند نجاح ثقافة البشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية، مورفولوجيا المفاضلة يمكن تقييم واستخدام تحليل صورة مشرقة الحقل وفب وتقنيات المصبوغة كلياً-جبل.
عملية التقاط صورة مشرقة الميدانية يتضح في الشكل 1A. نمت في مصفوفة 3D أورجانويدس وموزعين في جميع أنحاء الطائرات التنسيق المختلفة. لمراقبة أورجانويدس في التركيز عبر العديد من الطائرات، يقترح استخدام صورة شركة كهرباء فرنسا (الشكل 1B، حق) بدلاً من z-طائرة واحدة (الشكل 1B، اليسار). في المختبر، أورجانويدس نمت تحت ظروف تجريبية مختلفة قد تسفر التغييرات في التشكل. استخدام المجال والتدوير (المعرفة بكيفية مماثلة أورجانويد دائرة) ودائرة نصف قطرها ماكس/دقيقة (مقياس للطول) تعطي المستخدمين مؤشرا لحجم أورجانويد والشكل وتوفر قراءات القابلة للقياس الكمي مورفولوجيا. للتأكيد على فائدة هذه التدابير، تظهر الصور التمثيلية من أورجانويدس بمنطقة مشابهة ولكن مختلفة مورفولوجيا في الشكل 1، التي أورجانويد طويلة سوف تكون أقل تعميما ونسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى أكبر من كروية أورجانويد.
يكون نقطة مفيدة مراقبة المناطق داخلية العينات والتأكد من أن النخر غير موجود داخل نواة أورجانويد التضمين أورجانويدس لعلم الأنسجة. وتقدم سير عمل لهذه العملية ونتائج العينات أونستينيد، مقطعة تحت مجهر مشرق الميدان الممثل في الشكل 2 أ، ب، ج. ويبين الشكل 3 ألف أورجانويد أساءوا (يسار) بالمقارنة بشكل صحيح لتسليم أورجانويدس في الشكل 3 ألف (يمين) و الشكل 3B. لتحديد التمايز-الحالة العينة، من المستحسن أن ننظر في الخلايا القاعدية علامات (سيتوكيراتين 5 و p63)8 جنبا إلى جنب مع الخلية لومينال علامات (سيتوكيراتين 8)8. إذا كان ذلك هو المطلوب لوصمة عار أورجانويدس في الموقع، كل جبل تلطيخ بديل مناسب، وترد هذه النتائج الممثلة في الشكل 3، دال
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> رقم 1: تقييم مورفولوجيا أورجانويدس في ثقافة 3D. (A) سير العمل بجمع وضغط الصورة للبشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية التي حصل عليها ضوء منقولة مقلوب المجهر مع يجهز X/Y المرحلة ورفيق برنامج المسح الضوئي. (ب) صور الممثل z-مكدس واحد (يسار) مقابل. صورة شركة كهرباء فرنسا (يمين) من عينة كل بئر من البشرية أورجانويدس البروستاتا الأولية، تبين أن أورجانويدس أكثر في التركيز عندما يتم دمج مكدسات z متعددة في صورة واحدة المتوقعة (شريط المقياس = 1000 ميكرون). (C) الصور التمثيلية لنسبة غير المتشابهة شكلياً أورجانويدس البروستاتا الأولية البشرية التي لها نفس المنطقة منطقة والتدوير وماكس/دقيقة (شريط مقياس = 200 ميكرومتر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> رقم 2: أورجانويد تضمين سير العمل والممثل تمزيقها النتائج. (أ) أورجانويد البروستاتا الأولية البشرية تضمين سير العمل. (ب) صورة تمثيلية شريحة جديدة أونستينيد، والتي تحتوي على أورجانويدس البروستاتا الأولية البشرية تحت مجهر حقل مشرق يصور أجار (السهم الأخضر)، وجل علم الأنسجة (السهم الأسود)، فقاعة (السهم الأزرق)، أورجانويدس (الأسهم الحمراء) (شريط المقياس = 1000 μ m)-(C) أونستاينيد طازجة قص الشريحة (يسار) مقابل. أونستينيد الشرائح الجافة (على اليمين)، أورجانويدس (الأسهم الحمراء) تظهر شفافة عند الجافة (شريط مقياس = 500 ميكرومتر) ويصعب تمييز تحت مجهر مشرق الميدانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> الشكل 3: تلطيخ نسيجية في مقطعة ومثبتة على كل أورجانويدس. (أ) ح & ه تلطيخ لكسر البشرية الأولية أورجانويد البروستاتا من امتهان (بيبيتينج العدوانية، بروتوكول المعالجة الخاطئة، اليسار) بجوار حسن التعامل مع أورجانويد (يمين) (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية التي كانت ثابتة الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ البارافين، مقطوع، والملون مع سيتوكيراتين القاعدية 5 أو سيتوكيراتين لومينال 8 (أعلى) أو p63 القاعدية وسيتوكيراتين لومينال 8 (أسفل) وتصويرها مع (مجهر [كنفوكل] شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (C) ملطخة سيتوكيراتين القاعدية 5 أو سيتوكيراتين لومينال 8 مثبتة على كل بشرية الأولية البروستاتا أورجانويد وكونتيرستاينيد مع فالويدين و DAPI، تصويرها بالمجهر [كنفوكل] (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (د) أورجانويد مثبتة على كل بشرية الأولية البروستاتا خلية ملطخة فلوريسسينتلي المسمى إيدو وملطخة مضادة هويخست، تصويرها بالمجهر [كنفوكل] (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

نقدم هنا، بروتوكولا لدليل المناولة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية ثم تشير إلى نقاط النهاية لتقييم النمط الظاهري. البذر، ثقافة الصيانة والانتعاش من جل مصفوفة، يرد وصف الكمي مورفولوجك والتضمين وتمزيقها وتمزيقها فب، الجامعة-جبل تلطيخ وتطبيق الاختبارات التجارية.

معالجة وتقييم الثقافة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

البروستاتا organoids هي مثيرة في المختبر نظام لدراسة التنمية والمرض. أنها التغلب على التحديات من خطوط الخلايا الخالدة وتقديم بديل غير مكلفة لنماذج الحيوانات. يمكن زراعتها من خلايا البروستاتا البشرية ، كما أظهرنا في هذا البروتوكول ، وكذلك خلايا البروستاتا الماوس ، كنظام نموذج ما قبل السريرية ذات الصلة بالمرض.وقد وصفت العديد من المختبرات أساليب الثقافة المفيدة ونقاط النهاية. ولكننا نأمل في جمع تلك التفاصيل معا في بروتوكول واحد وإظهار الخطوات الصعبة بشكل خاص للمستخدمين الجدد. كما تحسين التقنيات، يمكن زراعة organoids سرطان البروستاتا من عينات المرضى كنهج الطب الدقيق لنموذج المرض والاستجابة للعلاجات.ظروف الثقافة هي محددة لعضيات البروستاتا، ولكن تم تكييف العديد من نقاط النهاية من أنواع الأنسجة الأخرى. يمكن للمستخدم تكييف أجزاء من هذا البروتوكول لنوع الخلية الخاصة بهم من الفائدة. ابدأ هذه التجربة بزراعة الخلايا الظهارية في مصفوفة هلامية مرمزة 96-آبار كما هو موضح في المخطوطة.لجمع الأعضاء من اللوحات بعد 12 يوما، وإزالة المتوسطة من الآبار دون إزعاج هلام مصفوفة. ثم نضيف على الفور حوالي 200 ميكرولترات من البروتياز المحايد لكل بئر في حوالي نسبة واحد إلى اثنين من هلام المصفوفة إلى البروتياز المحايد. احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.ثم الماصة صعودا وهبوطا إلى تفكيك ميكانيكيا الخليط، واحتضان مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، نقل خليط الخلية الهلامية مصفوفة مصفوفة محايدة من بضعة آبار إلى أنبوب microcentrifuge. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 مرات ز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.إزالة فائقة، وحفظ بيليه organoid لتحليلات لاحقة. لإنشاء قوالب لتضمينها، قطع قسم صغير من 1، 000 مايكرولتر ماصة تلميح لجعل اسطوانة التي تحتوي على 50 ميكروليترس. ثم من الجزء الأوسع من نفس الطرف، وجعل القالب أوسع الثانية التي تناسبها حول القالب الأول.لإنشاء كتلة الباردة، التفاف على الجليد مع الشريط مع الجانب لاصقة حتى. ثم تلتزم القوالب عموديا على الشريط. لتضمين organoids في سد هلام الأنسجة للمعالجة، أولا غسل بيليه organoid التي تم الحصول عليها سابقا مع ملليلتر واحد من هانك حل الملح المتوازن.بعد الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق، وإزالة supernatant. ثم إضافة 30 إلى 50 ميكرولترات من هلام الأنسجة السائلة إلى بيليه organoid، ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا لإعادة بناء بيليه. نقل هذا الخليط إلى قالب على كتلة الباردة، والسماح للعينة لتبرد وتتوطد في المكونات.بعد ذلك ، استخدم المكبس لدفع المكونات من القالب الصغير وإلى وسط القالب الأكبر ، وملء ذلك عن طريق الأنابيب واضحة 2 ٪ agar حول المكونات. لوضع علامة على الجزء العلوي من العينة، ماصة صبغ صبغة 2٪ agar على رأس المكونات. مرة واحدة وقد تبريد أجار، واستخدام المكبس لنقل المكونات في كاسيت الأنسجة.تسمية كاسيت مع قلم رصاص ووضعها في 10٪ غير محايد buffered formalin لتثبيت بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل كاسيت من 10٪ محايد buffered formalin إلى 70٪ الإيثانول الصف النسيجي, ومعالجتها أكثر وتضمين في البارافين. تبدأ من خلال تقليم قاعدة كتلة في سمك 10 ميكرومتر.بمجرد ظهور مقطع يحتوي على منطقة المكونات، توقف عن التشذيب. قفل الدوار microtome، ونقل كتلة مرة أخرى على الجليد للاسترخاء. نقل النصل إلى جزء جديد غير مستخدم.ونقل كتلة العودة إلى المشبك. فتح الجهاز والبدء في التشذيب في خمسة ميكرومتر لكل قسم. استخدام ملاقط لنقل القسم إلى حمام الماء 40 درجة مئوية، والسماح لها بالانتشار.تراجع شريحة عموديا في الماء لنقل القسم على ذلك. ثم لاحظ الشريحة تحت مجهر حقل مشرق لضمان وجود organoid في القسم. خبز بين عشية وضحاها في 45 إلى 50 درجة مئوية، ومن ثم المضي قدما مع تلطيخ كما هو موضح في المخطوطة.ابدأ هذا الجزء من التجربة بآبار غير مستخدمة من لوحة المصفوفة المغلفة بالهلام ذات الـ 96 بئرًا مع العضويات. بواسطة pipetting ضد جانب البئر، وترك الفضاء بين وسائل الإعلام ومصفوفة هلام، بعناية إزالة وسائل الإعلام أكبر قدر ممكن من دون تعطيل الثقافة organoid. استخدام قلصت 1، 000 ميكرولتر ماصة تلميح، قبل الرطب مع برنامج تلفزيوني لرسم قطرة واحدة من هلام مصفوفة التي تحتوي على organoids من الفائدة.الاستغناء عن قطرة على منتصف شريحة غرفة. بالعين المجردة، تُشعّر الوسائط الزائدة و جل المصفوفة من شريحة الغرفة باستخدام ماصة دقيقة. لتعزيز الالتزام العضوي بالزجاج ومنع فقدان العينات أثناء خطوات الغسيل اللاحقة.ضع الشريحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. الأنابيب ببطء لمنع الانفصال عن الطبق، إضافة 200 ميكرولترات من 1X PBS لغسل organoids لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. إزالة بعناية PBS 1X وإضافة 200 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde.قم بإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. في PFA، قم بغسل خطوات permeabilization اللاحقة وتلطيخها كما هو موضح في هذا البروتوكول. جبل وصورة على الفور.يظهر الشريحة الطازجة غير المطعّمة بوضوح أجهزة البروستاتا الأولية البشرية ، في حين أن في الشريحة الجافة غير المطهية ، تظهر الأجهزة العضوية شفافة ويصعب اكتشافها تحت مجهر ميداني مشرق. Hematoxylin وeosin تلطيخ يظهر كسر الجهاز البروستاتا الأولية البشرية من سوء المناولة، مثل الأنابيب العدوانية، بروتوكول معالجة خاطئ بالمقارنة مع organoid التعامل معها بشكل جيد. كان الجهاز الأساسي للبروتوستة البشرية ثابتًا ، وبارافين مدمجًا ، ومقطّوعًا ، وملطخًا بالستوكيراتين القاعدي 5 واللمّوقى cytokeratin 8 ، وbasal p63 وcytokeratin اللمّيّات ، وصورها بالمجهر confocal.كان ملوثة كله محمولة على الجهاز العضوي البروستاتا الأولية الإنسان مع السيتوكيراتين القاعدية 5 أو السيتوكيراتين اللمبّر 8، ومضادة مع phalloidin وDAPI، وصور مع المجهر confocal. تم تلطيخ خلية البروستاتا الأولية البشرية كاملة مع Edu المسمى بالفلورسنت وموازن مع Hoescht ، وصور مع المجهر confocal. من المهم تصور الأعضاء طوال العملية.بعد جمع المقاطع، تأكد من تصور العينات على الشريحة، وتأكد من مراقبة organoids أثناء تركيب كامل. بعد جمع الأعضاء من هلام المصفوفة، يمكنك تركيبها بالكامل واستخدام المقايسات التجارية، أو فصل إلى خلايا واحدة لتسلسل التدفق الخلوي أو خلية واحدة. توفر الثقافة ثلاثية الأبعاد للباحثين طريقة جديدة لدراسة الأنسجة في إعداد طبق المختبر.يمكن تطبيقه على تكوين الأعضاء ، أو لفهم أمراض مرض المريض. عند العمل مع عينات المريض، دائماً توخي الحذر والتعامل مع المواد كإمكانية للتعرض مسببات الأمراض المنقولة بالدم.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

تقييم تأثير التعرض المتكرر من عضوي النمط 3D الشعبي والأنف زراعة الأنسجة نماذج لكامل دخان السجائر

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

نموذج الثقافة 3D-الهرمون تستجيب للالغدة الثديية الظهارة الإنسان

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

تقييم الكهربائيات القلبية قبل الاحتكين بواسطة الجهد المزدوج ورسم الخرائط البصرية الكالسيوم لشرائح القلب العضوية البشرية

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...