Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
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我们感谢 uic 生物研究所成员 klara valyi-nagy 博士和 alex susma, 以及泌尿科医生 michael abern、daniel moreira 和 simone crivallero 博士为初级细胞培养的组织获取提供了便利。我们感谢 uic 泌尿外科患者将他们的组织捐献给研究。这项工作的部分资金来自国防部前列腺研究计划健康差异理念奖 pc121923 (农) 和 uic 临床和翻译科学前博士教育的临床和转化科学家 (pects) 计划 (mccay 和理查兹) 和由国家卫生研究院的国家癌症研究所, 赠款号码 u54ca202995, U54CA202995, 和 U54CA202995, 被称为芝加哥和平平等合作 (nonn 和理查兹)。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院或国防部的官方观点。

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. 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作者没有什么可透露的。

有组织型培养是一种令人兴奋的新方法, 具有体外环境的便利性。目前, 实验室从多种类型的组织中为不同的端点生长有机生物。本文介绍的方法总结了有用的端点, 并突出了全面描述三维原代前列腺细胞培养的新技术。
有多种培养基配方用于培养人类原发性前列腺细胞有机体 5,6,13。虽然所有的人都取得了可行和可比的结果 , 但基于 ksfm 的介质13使用的是最小的添加剂, 所以这里描述了它。此外, 还发表了使用多种浓度的基质凝胶, 从10% 到 75%, 以培养前列腺有机体5,6,13。因为基质凝胶是一种昂贵的试剂, 33% 的基质凝胶已被证明足以培养长期 (2-3周), 可行, 未聚集的有机生物 13,这是推荐的浓度。然而, 基质凝胶在蛋白质浓度上可以在手数之间发生变化, 因此在电镀时应该考虑到这一点。还建议大量购买基质凝胶, 用于多个实验, 以减少批次之间的不一致。其他实验室已经公布了不同的格式电镀基质凝胶, 如液滴, 而不是涂层96孔板井5。这两种方法都形成了可行的有机生物, 但这里描述的格式允许细胞更稀疏地镀膜, 这已经被证明可以促进细胞膨胀为更大的有机体13。然而, 电镀密度应根据患者的具体形成效率进行优化。基质凝胶有多种形式, 包括生长因子还原、无红苯酚、高浓度等. 在定义的培养条件下, 建议减少生长因子, 在使用表达 gfp 的细胞或涉及堆栈图像捕获的实验时, 建议使用无红的苯酚。由于基质凝胶在室温下快速凝固, 使用冷试剂进行任何基质凝胶电镀步骤都是至关重要的。
在不同的实验处理下生长的有机体可能会导致形状的变化, 因此明亮场成像被广泛用于研究观察到的形态表型。然而, 记录和量化区域或形状是一个挑战, 原因有二: 1) 图像捕获过程中的选择偏差; 2) 将区域等二维参数应用到三维样本中。图像捕获的一种策略是记录一个随机字段并测量该字段中预定数量的有机体, 但这可能会在选择过程中产生偏差, 并且选定字段中的所有有机体可能都不在焦点上。针对96孔微板格式进行优化的全井成像通过收集感兴趣的整个有机体群体来消除这种采样偏差。然而, 根据手头的显微镜目标, 可能需要收集和平铺多个字段, 以获得完整的图像。一些实验室描述了从单个 z 平面12 测量区域,但为了捕获聚焦中的所有有机生物, 建议收集多个平面并将其堆叠到一个 edf 图像13中。在某些情况下, 矩阵凝胶中的半月板可能会导致图像出现晕影, 可能需要使用图像分析软件应用背景校正方法。理想情况下, 精确体积是最适合于有机体尺寸的测量方法;但是, 即使使用多个 z 堆栈图像, 也很难精确地获得。其他有用的形态维度, 如循环和最大值最小比, 可以很容易地计算从所有的有机体在整个井 edf 图像。这些方法共同克服了采样偏差的挑战, 并能够在3d 空间中测量3d 对象的2d 参数。
福尔马林固定和石蜡包埋是一种常用的方法, 以获得血红素和 eosin (h & e), 免疫组织化学 (ihc), 和免疫荧光 (if) 染色的可视化和分析 6,11,20. 然而, 描述这种技术的出版物缺乏关于嵌入过程的全面细节。此外, 在石蜡块中定位有机体可能具有挑战性。一些实验室在布设之前用色氨酸蓝色预染色, 以便在第11节期间在位置上得到帮助。这里描述的方法结合了使用组织学染料定向的有机组织组织凝胶插头在嵌入过程中, 以提高切片的效率。h & e 幻灯片有助于检查坏死, 核纹理和增殖, 因此它应该是一个强制性的终点有机体培养, 以确保细胞是健康的整个领域。有机体培养的一个优点是样本由异质细胞的混合物组成,这些细胞在体内的患者组织中更相似。例如, 在前列腺中, 基部和腔内细胞都存在于前列腺有机体5中, 而在2d 中生长的细胞缺乏腔分化8。为了评估有机体的分化, 建议研究人员评估基础标志物, 如 ck5 和 p63 和腔内标志物, 如雄激素受体和 ck8.任何其他感兴趣的实验蛋白也可以使用这些染色技术进行研究。
虽然 ffpe 部分允许通过组织学方法 (h & e、if、ihc) 显示存在于内隔间的细胞, 但图像仅限于横截面, 而嵌入过程可能会改变有机形状。全贴染色使有机体能够在原地染色和观察, 保持形态表型, 并允许蛋白质定位的图像。全安装是一种用于染色全组织或整个动物标本的工具, 如斑马鱼或小鼠胚胎, 很容易适应有机生物。这里描述的技术是由 maé等人等人的程序修改的.1 1日, 详细介绍了胃肠道有机体直接在室内滑块上的初始生长和培养, 并需要对整个家长培养进行固定。这里概述的方法包括在染色时将一个感兴趣的有机体 (或有机体) 转移到室内滑块上。这使得在不固定父系文化的情况下, 可以在正在进行的实验中选择用于整体安装分析的单个有机体。在进行全装染色时, 有必要优化原生和二级抗体的渗透和培养时间, 以确保在整个标本中渗透 (建议在一天或多天内的任何地方)。一旦通过共聚焦显微镜成像, 就可以制作3d 渲染, 以实现特定蛋白质的可视化和定位, 并计算样本中存在的阳性染色细胞的数量。流式细胞术是一个有用的终点, 以量化基础, 腔内, 或干细胞 5,14的人群.要做到这一点, 细胞从基质凝胶中恢复, 并轻轻分离染色。用户应根据当前文献仔细选择适当的分离标记。对于人原代前列腺上皮细胞, cd26 和 cd49f 分别适用于腔和基部标志物 5,21。
总之, 该协议详细介绍了人类初级前列腺有机体的生长、收集和实验终点。值得注意的是, 所描述的安装技术可应用于通常用于2d 细胞的各种其他检测, 如基于荧光原蛋白的实验, 研究增殖19、凋亡和亚细胞细胞器染色.此外, 这里描述的收集和离解方法可用于制备单细胞 rna 测序18。总的来说, 这证明了研究人员将来可以优化和探索的各种新颖、高保真端点的可能性。

有机体是研究器官发生和疾病的宝贵工具。它们为动物模型提供了一种成本更低的替代品, 患者衍生的有机生物正在发展成为个性化医学1、2、3 的策略。这种三维 (3d) 培养系统包括将干细胞或祖细胞 (从组织或诱导多能干细胞中提取) 播种到细胞外基质成分的凝胶 (基质凝胶)4中。细胞增殖和分化, 形成组织型结构, 重述感兴趣器官功能单元的细胞层次和形态。有机物质是利用来自各种器官的细胞生长的, 包括唾液腺、胃、肠、肝脏、前列腺、肺和大脑4.虽然有许多协议描述步骤建立前列腺有机化合物5,6, 它是具有挑战性的找到足够详细的方法, 如何实现定量终点从有机体。本文总结了为人类原发性前列腺细胞开发的方法, 并详细介绍了一系列评估有机体表型的建议终点。这些技术针对前列腺有机体进行了优化, 可能适用于其他三维细胞培养。
前列腺类有机体培养体最近已成为一种有价值的体外模型, 缺乏使用已建立的永生细胞系的单层培养的局限性。良性前列腺上皮和前列腺癌是一个挑战, 以模型在体外使用永生细胞系。良性细胞系的数量是有限的, 都经历了癌基因7的转化。单层的原发前列腺上皮细胞不分化为腔细胞, 缺乏雄激素受体8。大多数前列腺癌细胞系没有功能性雄激素受体, 这是早期疾病状态的重要中介, 缺乏在患者肿瘤9中发现的关键基因变化。前列腺类有机体培养物可从良性上皮中轻松生长, 对研究干细胞特性、祖细胞、分化和微环境实验变化的影响有价值4,5。前列腺癌有机体可以作为一种精确的医学方法的一部分来种植, 以模拟病人的疾病和对治疗10的反应.
该协议是根据使用各种细胞类型的现有协议汇编的, 但在这里已经优化, 可用于人类原代前列腺细胞。它是对 sawyers、clevers 和 shen 5,6 概述的描述前列腺小鼠和人体有机体生长、传代、明亮场成像、冷冻保存、rna 和 dna 分离的协议的补充。整个装载协议由 mae等人修改.11, 谁使用胃肠上皮类固醇, 并描述活体成像和冷冻和石蜡嵌入。borten等人12描述了从明亮场成像的乳房, 结肠和结直肠癌有机体形态的分析。此外, richards等人。13. 采用前列腺有机体形态形态学评价的方法。最后, 胡等人.14描述了一种方法, 坚持前列腺有机体粘附到房间滑块过夜之前, 免疫荧光染色观察单个细胞和分散球体流式细胞仪分析。
该协议的目标是将这些技术上具有挑战性的方法作为一种协议, 包括细胞播种, 充分详细地演示这些方法;培养基和基质凝胶维护;流式细胞仪的细胞集合;rna、dna 和蛋白质提取;从明亮场 z 堆栈分析中进行形态学评估组织学染色的包埋、处理和切片;和整个安装用于免疫荧光或荧光探针检测。这些不同端点的生物学相关性和解释将因实验设计和用于分析的抗体而异。通过利用此协议, 用户应该准备好使用终结点工具包进行实验。
人类原发性前列腺上皮细胞 (pre) 是根据 peehl 15,16 描述的协议在实验室中建立的, 并按照前面描述的 17, 维持到数量有限的通道 (最多 4个), 但它们也是可从商业供应商处获得。肝细胞无血清培养基为基础 6, ksfm 为基础的13和 r-bosi1-条件5培养基都被作为成功生产了有机化合物而出版。基于 ksfm 的添加剂所需的添加剂数量最少, 因此这里对此进行了描述。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

本文详细介绍了人类原发性前列腺组织的三维培养、处理和评价。这个过程包括在96孔微板上的三维基质凝胶中疏生地播种上皮细胞, 并通过介质变化来培育向有机体的扩张。然后通过对 z 堆栈图像的整井捕获来评估形态。z 堆栈的压缩创建一个单一的焦点图像, 从中测量有机体, 以量化各种输出, 包括圆度、圆度和面积。脱氧核糖核酸、rna 和蛋白质可以从基质凝胶中回收的有机生物中收集。感兴趣的细胞群可以通过有机体离解和流式细胞仪进行评估。福尔马林固定石蜡包埋 (ffpe), 然后切片用于组织学评估和抗体染色。全安装免疫荧光染色保存有机体形态, 并促进观察蛋白质定位在有机生物原位。传统上用于2d 单层细胞的商业检测可以修改为三维有机体。结合使用, 该协议中的技术提供了一个可靠的工具箱来量化前列腺有机体的生长, 形态特征, 和分化标记的表达。

在成功培养人类原发性前列腺组织后, 可采用明亮场图像分析、ffpe 和整体染色技术进行形态学和分化评估。
明亮场图像捕获的过程如图 1a 所示。有机体生长在三维矩阵中, 分散在不同的震源平面上。为了观察多个平面上的焦点中的有机体, 建议使用 edf 图像 (图 1b, 右) 而不是单个 z 平面 (图 1b, 左)。在实验室中, 在不同实验条件下生长的有机生物可能会导致形态的变化。使用面积、圆形 (由有机体与圆的相似程度定义) 和最大半径 (长度测量) 可指示用户的有机体大小和形状, 并提供可量化的形态读数。为了强调这些措施的有用性, 图1c显示了具有相似面积但形态不同的有机生物的代表性图像, 其中长的有机体会比球形的体积更小, 最大的最小比也更大有机的。
用于组织学的嵌入有机体是观察样品内部并确保在有机体核心内不存在坏死的有用终点。图 2a、b、c 提供了这一过程的工作流程以及在明亮场显微镜下对未染色、切片样品的代表性结果。图 3 a 显示了与图3 a (右) 和图 3 b中适当处理的有机体相比处理不当的有机体 (左)。为了确定样品的分化状态, 建议查看基底细胞标记 (细胞角蛋白5和 p63)8以及腔细胞标记 (细胞角蛋白 8)8。如果希望在现场对有机硅进行染色, 整体染色是一种方便的选择, 这些具有代表性的结果如图 3c, d 。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> 图 1: 3d 培养中有机生物的形态评估。(a)用电动 x/y 扫描级和配套软件, 通过透射光倒置显微镜获得的人类原发性前列腺有机体的图像采集和压缩工作流程。(b)单个 z 堆栈 (左)与人类原发性前列腺组织的全井样本的 edf 图像 (右), 表明当多个 z 堆栈合并到一个投影图像 (刻度条 = 1000μm) 时, 更多的有机体处于焦点。(c)具有相同面积 (刻度条 = 200μm) 的形态不同的人类原发性有机体的面积、循环和最大比的代表性图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> 图 2: 有机嵌入工作流和具有代表性的切片结果。(a)人原发性前列腺有机体嵌入工作流程。(b)在明亮的野外显微镜下放置含有人类原发性巨细胞的未染色的新鲜幻灯片的代表性图像, 该幻灯片描绘琼脂 (绿色箭头)、组织学凝胶 (黑色箭头)、气泡 (蓝色箭头)、有机体 (红色箭头) (刻度栏 = 1000μm). (c)未染色的新切割滑梯 (左) vs。未染色干燥滑块 (右), 有机体 (红色箭头) 在干燥时呈半透明 (刻度条 = 500μm), 在明亮的显微镜下更难分辨。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> 图 3: 切片和整个安装的有机体的组织学染色。(a) h & e 染色的一个破碎的人类初级前列腺有机体从处理不当 (腐蚀性移液, 错误的处理协议, 左) 旁边处理良好的有机体 (右) 旁边 (刻度棒 = 100μm)。(b)人原发性前列腺素, 已被福尔马林固定, 石蜡嵌入, 切片, 并染色基部细胞角蛋白5或腔细胞角蛋白 8 (顶部) 或基底 p63 和腔细胞角蛋白 8 (底部), 并用共聚焦显微镜成像 (刻度杆 = 100μm)。(c)全身安装的人原发性前列腺器官染色基部细胞角蛋白5或腔细胞角蛋白 8, 并与药物蛋白和 dapi 进行反染色, 用共聚焦显微镜成像 (刻度棒 = 100μm)。(d)用荧光标记的 edu 染色的全装人类原发前列腺细胞有机体, 用共聚焦显微镜 (刻度条 = 500μm) 成像,<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看这一数字的更大版本.</a>

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

在这里, 我们提出了一个协议, 以指导人类的原发性前列腺有机体处理, 然后建议终点, 以评估表型。介绍了种子、培养维护、基质凝胶回收、形态定量、嵌入切片、ffpe 切片、全装染色及商业检测的应用。

人原发性前列腺组织培养的处理与评价

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

前列腺器官是研究发育和疾病的令人兴奋的体外系统。他们克服了不朽细胞系的挑战，为动物模型提供了廉价的替代方案。它们可以从人类前列腺细胞中生长，正如我们在该协议中所示，以及小鼠前列腺细胞，作为一个与疾病相关的临床前模型系统。许多实验室都描述了有用的培养方法和端点。但是，我们希望将这些细节汇集到一个协议中，并展示新用户特别具有挑战性的步骤。随着技术的进步，前列腺癌器官可以从患者样本中生长，作为模拟疾病和治疗反应的精确医学方法。培养条件是特定于前列腺器官，但许多端点已经适应其他组织类型。用户可以根据感兴趣的单元格类型调整此协议的某些部分。开始这个实验，在矩阵凝胶编码的96孔板中生长上皮细胞，如手稿中所述。要在12天后从板中收集有机体，请从孔中去除介质，而不干扰基质凝胶。然后立即向每井添加约200微升中性蛋白酶，其基质凝胶与中性蛋白酶的比例约为1比2。在37摄氏度下孵育板20分钟。然后移液器上下机械分离混合物，并在37摄氏度下再次孵育20分钟。孵育后，将中性蛋白酶基质凝胶细胞混合物从几口孔转移到微离心管中。以300倍g离心使细胞分裂3至5分钟。取出上一液，并保存有机颗粒，以便随后进行分析。要创建嵌入模具，请切出 1000 微升移液器尖端的一小部分，以制造一个可容纳 50 微升的圆柱体。然后从同一尖端的较宽部分，制作适合第一个模具的第二个较宽的模具。要创建冷块，请用胶带将冰袋与粘合剂面向上包装。然后将模具垂直附着在胶带上。要将有机体嵌入组织学凝胶塞中进行加工，请先用汉克平衡盐溶液的一毫升清洗先前获得的有机体颗粒。在300次g下离心3至5分钟后，取出上经剂。然后将30至50微升液体组织凝胶加入有机体颗粒，然后通过上下缓慢移液轻轻混合以重新暂停颗粒。将混合物转移到冷块上的模具中，让试样冷却并凝固成插头。接下来，使用柱塞将插头从小模具中推出并推入较大模具的中心，并在插头周围通过移液清除 2% 的 agar 来填充。为了标记样品的顶部，移液器组织染料在插头顶部 2%agar。一旦阿加冷却，使用柱塞将插头转移到组织学盒中。用铅笔给盒式磁带贴上标签，并放入10%中性缓冲的甲醛中，进行隔夜固定。第二天，将盒式磁带从10%中性缓冲形式转化为70%组织级乙醇，然后进一步加工并嵌入石蜡中。首先修剪块的基座厚度为 10 微米。出现包含插头区域的部分后，停止修剪。锁定微原子转子，将块重新转移到冰上冷却。将刀片移动到新的未使用的部分。将块重新转移到夹具。解锁机器，开始修剪每节五微米。使用钳子将部分转移到 40 摄氏度的水浴，并允许其扩散。将滑梯垂直浸入水中，将滑梯转移到其上。然后在明亮的场显微镜下观察幻灯片，以确保该部分存在器官。在45至50摄氏度下烘烤过夜，然后按照手稿中所述进行染色。开始这一部分的实验与未使用的井的96孔基质凝胶涂层板与有机体。通过对井的一侧进行移液，在介质和基质凝胶之间留下空间，在不破坏有机体培养的情况下小心去除尽可能多的介质。使用修剪的1000微升移液器尖端，用PBS预湿，以绘制一滴含有感兴趣的有机体状的基质凝胶。将跌落点分配到腔室滑轨的中间。用肉眼，用细尖的移液器从室内滑梯中吸出多余的介质和基质凝胶。促进有机体粘附在玻璃上，防止在随后的洗涤过程中样品丢失。将幻灯片放在 37 摄氏度的培养箱中 30 至 45 分钟。缓慢移液，以防止脱离菜，加入200微升1XPBS洗风琴在室温下5分钟，轻轻摇动。小心地取出 1X PBS，并加入 200 微升 4% 的甲醛。在室温下用轻轻的摇动修复30分钟。在 PFA，按照本协议所述，清洗并继续进行后续渗透和染色步骤。立即安装和映像。未沾污的新鲜剪裁幻灯片清楚地显示了人类原发性前列腺器官，而在未沾污的干滑道中，器官看起来是半透明的，在明亮的现场显微镜下更难检测。与处理良好的器官相比，血氧素和 eosin 染色显示，人类原发性前列腺器官处理不当，如腐蚀性移液、处理方案错误。人类原发性前列腺器官是形式固定，石蜡嵌入，分段，并染色与基底细胞素5和发光细胞素8，基底p63和发光细胞素8，并成像与共体显微镜。全安装人类原发性前列腺器官被染色的基底细胞素5或发光细胞酮8，并反染色与 phaloidin 和DAPI，并用共和显微镜成像。全安装人类原发性前列腺细胞器官被荧光标记的Ede染色，用霍施特反染色，并用共生显微镜成像。在整个过程中，将你的器官可视化是重要的。收集各部分后，请确保在幻灯片上显示样品，并确保在整体安装过程中观察到器官。从基质凝胶中收集器官后，您可以将其完整安装并使用商业测定，或分离到单细胞进行流式细胞测量或单细胞测序。3D培养为研究人员提供了一种在实验室培养皿环境中研究组织的新方法。它可以应用于器官生成，或用于了解患者的疾病的病理学。处理患者样本时，请始终小心谨慎，并处理这些材料，作为血液传播的病原体暴露的潜在情况。

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