Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy, og Alex Susma, samt Urologer, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, til lettelse af væv anskaffelsessum for de primære cellekulturer. Vi takker UIC Urologisk patienter for at donere deres væv til forskning. Dette arbejde blev finansieret, delvis af den afdeling af Defense prostata kræft forskning Program sundhed forskelle idé Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for kliniske og oversættelse naturfagsundervisning Pre-doctoral for klinisk og translationel forskere ( PARTNERE) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant numre U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kendt som den Chicago sundhed Equity Collaborative (Nonn og Richards). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health eller Department of Defense.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Organotypic kultur er en spændende ny metode til recapitulating væv med bekvemmeligheden af en in vitro- miljø. I øjeblikket vokse labs organoids fra mange typer af væv til forskellige slutpunkter. Metoderne beskrevet i denne hvidbog opsummere nyttige slutpunkter og fremhæve nye teknikker for at fuldt ud at beskrive 3D primære prostata cellekulturer.
Der er en bred vifte af medier opskrifter til at dyrke menneskelige primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle nå levedygtige og sammenlignelige resultater, bruger KSFM-baserede medier13 minimal tilsætningsstoffer så det er beskrevet her. Derudover er blevet offentliggjort papirer, ved hjælp af flere koncentrationer for matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrix gel er en bekostelig reagens, og 33% matrix gel har vist sig at være tilstrækkeligt til at dyrke langsigtede (2-3 uger), levedygtig, unclumped organoids13, dette er den anbefalede koncentration. Men matrix gel kan variere i proteinkoncentration mellem lotnumre, så dette bør tages i betragtning, når plating. Det anbefales også at købe matrix gel i bulk til brug på tværs af flere eksperimenter for at reducere uoverensstemmelse mellem masser. Andre labs har udgivet forskellige formater til plating matrix gel, som dråber i stedet for belægning en 96-brønd plade godt5. Begge metoder danne levedygtige organoids, men formatet beskrevet her mulighed for celler til at være forgyldt mere sparsomt, som har vist sig at fremme udvidelse af celler ind i større organoids13. Dog bør plating tæthed optimeres baseret off patient-specifikke dannelse effektivitet. Matrix gel er tilgængelig i mange formater herunder vækstfaktor-reduceret, phenol rød-fri, høj koncentration, osv. Vækstfaktor-reduceret anbefales for defineret dyrkningsbetingelser, og phenol rød-fri anbefales, når du arbejder med celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis eller i eksperimenter, der involverer z-stakken billedoptagelse. Det er afgørende, at enhver matrix gel plating trin udføres med iskold reagenser, som matrix gel størkner hurtigt ved stuetemperatur.
Organoids dyrkes under forskellige eksperimentelle behandlinger kan medføre ændringer i form, så lysfelt imaging er meget udbredt at studere observerede morfologiske fænotyper. Optagelse og kvantificere område eller form er dog en udfordring af to årsager: 1) udvalg bias under billedoptagelse og 2) anvender en to-dimensionel parameter såsom område til en tre-dimensionel stikprøve. Én strategi billedoptagelse er at optage et tilfældigt felt og måle et forudbestemt antal organoids på dette område, men dette kan skabe bias i udvalg, og alle organoids i det valgte felt muligvis ikke være i fokus. Hele-godt imaging optimeret til formatet 96-brønd mikrotiterplade eliminerer denne prøveudtagning bias ved at samle hele organoid befolkning af interesse. Dog afhængig af mikroskop mål på hånd, flere felter muligvis være indsamlet og flise for at opnå en helhed-godt billede. Nogle laboratorier har beskrevet målefeltet fra en enkelt z-fly12, men for at fange alle organoids i fokus, anbefales det at indsamle og stable flere fly i en enkelt EUF-billede13. I nogle tilfælde, en menisk i matrix gel kan forårsage vignettering i billedet, og baggrunden korrektion metoder kan være nødvendigt at være anvendt ved hjælp af billede analyse software. Nøjagtige volumen er ideelt den mest passende måling for organoid størrelse; Det er imidlertid vanskeligt at netop få, selv med flere z-stak billeder. Andre nyttige morfologiske dimensioner, såsom cirkularitet og maksimum/minimum forholdet, kan let beregnes fra alle organoids i en helhed-godt EUF billede. Sammen, disse metoder overvinde prøveudtagning bias udfordringer og aktiverer måling af 2D parametre fra 3D-objekter i et 3D-rum.
Formalin fiksering og paraffin indlejring af organoids er en fælles metode til at opnå hæmatoxylin og eosin (H & E), immunhistokemisk (IHC) og immunfluorescent (IF) farvning for visualisering og analyse6,11, 20. imidlertid publikationer, der har beskrevet denne teknik mangler omfattende detaljer om indlejring processen. Derudover kan at lokalisere organoids inden for paraffin blok være udfordrende. Nogle laboratorier pre pletten organoids med trypan blå forud for indlejring støtte i placering ved skæring11. Metoden beskrevet her omfatter anvendelse af en histologisk farvestof til orientering af organoid/histologi gelplug under indlejring for at fremme effektiviteten af skæring. H & E dias lette undersøgelsen af nekrose, nukleare tekstur og spredning, og det bør således være en obligatorisk slutpunktet for organoid kultur til at sikre, at cellerne er sund i hele området. En styrke af organoid kultur er, at prøverne består af en heterogen blanding af celler, der bedre ligner i vivo patient væv. I prostata, eksempelvis er både basal og luminale celler til stede i prostata organoids5, mens celler dyrkes i 2D manglende luminale differentiering8. For at vurdere organoid differentiering, anbefales det, at forskere vurderer basal markører som CK5 og p63 og luminale markører som androgenreceptorer og CK88. Eventuelle andre eksperimentelle proteiner af interesse kan også studeres ved hjælp af disse farvning teknikker.
Selvom FFPE sektioner giver mulighed for visualisering af celler bosat i de indvendige rum via histologiske metoder (H & E, hvis, IHC), billeder er begrænset til cross sektioner, og organoid form kan ændres ved indlejring processen. Hele-mount farvning gør det muligt for en organoid at være plettet og observeret i situ, bevare morfologiske fænotyper og tillader billeder af protein lokalisering. Hele-montering er et værktøj, der er udnyttet til at pletten hele-væv eller hele-dyr prøver, såsom zebrafisk eller mus fosteret, og er let tilpasses til organoids. Den teknik beskrevet her blev ændret fra proceduren ved Mahéet al. 11, som indeholder oplysninger om den indledende vækst og kultur af gastrointestinal organoids direkte på et kammer dias til farvning, og som kræver fiksering af hele overordnet kultur. Metoden her skitserede indebærer overførsel af en enkelt organoid (eller organoids) af interesse på en kammer dias på tidspunktet for farvning. Dette giver mulighed for valg af individuelle organoids for hele-mount analyse i en igangværende eksperiment uden fiksation af den overordnede kultur. Når du udfører hele-mount farvning, det er nødvendigt at optimere permeabilization og inkubationstiden for primær og sekundær antistoffer til at sikre udbredelse i hele modellen (hvor som helst fra en eller flere dage anbefales). Når afbildet via Konfokal mikroskopi, kan 3D puds produceres for at aktivere visualisering og lokalisering af et specifikt protein og beregne antallet af positivt farvede celler findes i en prøve. Flowcytometri er en nyttig slutpunkt til at kvantificere populationer af basal, luminale, eller stilk celler5,14. For at gøre dette, er celler inddrives fra matrix gel og forsigtigt dissocieres til farvning. Brugere bør omhyggeligt vælge passende markører for adskillelse baseret på den aktuelle litteratur. For menneskers primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnede luminale og basal markører, henholdsvis5,21.
I Resumé detaljer denne protokol menneskelige primære prostata organoid vækst, samling og eksperimenterende slutpunkter. Af note, kan montering teknik beskrevet anvendes til en lang række andre assays, der normalt er beskæftiget i 2D celler, såsom fluorescerende sonde-baserede eksperimenter ser på spredning19, apoptose og subcellulært organelle pletter. Derudover kunne samling og dissociation metoden beskrevet her udnyttes som forberedelse til én celle RNA sekventering18. Kollektivt, viser det muligheden for en bred vifte af roman, high-fidelity slutpunkter, at forskere kan optimere og udforske i fremtiden.

Organoids er et værdifuldt redskab til at studere organogenesis og sygdom. De giver et billigere alternativ til dyre modeller, og patienten-afledte organoids udvikler sig som en strategi for personlig medicin1,2,3. Dette tre-dimensionelle (3D) kultur system indebærer såning stilk eller stamfader celler (høstet fra væv eller induceret pluripotente stamceller) i en gel af ekstracellulære matrix komponenter (matrix gel)4. Cellerne formere sig og differentiere, hvilket resulterer i organotypic strukturer, at sammenfatte de cellulære hierarki og morfologi af orgel af interesses funktionel enhed. Organoids er dyrket ved hjælp af celler med oprindelse fra en række forskellige organer, herunder spytkirtel, maven, tarmen, leveren, prostata, lunge og hjerne4. Selvom der er talrige protokoller der beskriver trin for at oprette prostata organoids5,6, er det udfordrende at finder tilstrækkeligt detaljerede metoder til at opnå kvantitative slutpunkter fra organoids. Dette papir opsummerer metoder udviklet for menneskers primære prostata celler og detaljer en række foreslåede slutpunkter til at vurdere organoid fænotyper. Disse teknikker var optimeret til prostata organoids og kan anvendes til andre 3D cellekulturer.
Prostata organoid kulturer har for nylig vist sig som en værdifuld in vitro- model, der mangler begrænsningerne af éncellelag kulturer ved hjælp af etableret udødeliggjort cellelinjer. Benign prostata epitel og prostatakræft er udfordrende at model i vitro bruger udødeliggjort cellelinjer. Antallet af godartede cellelinjer er begrænset, og alle har gennemgået forvandling med onkogener7. Primære prostata epitelceller i encellelag ikke differentiere i luminale celler og mangler androgen receptorer8. Fleste af prostata cancer cellelinjer har ikke funktionelle androgenreceptorer, en betydelig mægler tidlig sygdom, og mangel på vigtige genetiske ændringer, der er blevet fundet i patient tumorer9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes nemt fra godartede epitel og er værdifulde i at studere egenskaber for stamceller, stamceller, differentiering og virkningerne af eksperimentelle ændringer i mikromiljø4,5. Prostata cancer organoids kan dyrkes som en del af et præcisionsindflyvning medicin til modellering patientens sygdom og svar på terapier10.
Denne protokol er blevet kompileret fra eksisterende protokoller, der bruger forskellige celletyper, men det her er optimeret til brug i menneskelige primære prostata celler. Det komplimenter protokoller skitseret af Sawyers, Clevers og Shen5,6 , der beskriver vækst, passaging, lysfelt imaging, kryopræservering, og RNA og DNA isolation af prostata mus og menneskelige organoids. Hele-mount-protokollen er ændret fra Mahé et al. 11, der brugte gastrointestinale epitelial organoids og beskriver live imaging og frosne og paraffin indlejring. Borten et al. 12 beskrevne analyse af bryst, kolon og kolorektal cancer organoid morfologi fra lysfelt billeddannelse. Derudover Richards mfl. 13 anvendes en metode til morfologiske vurdering af prostata organoids. Endelig, Hu et al. 14 beskrevet en metode af vedhængende prostata organoids til et kammer dias natten før immunfluorescent farvning for at observere enkelt celler og spredning af kugler til flow flowcytometri analyse.
Målet med denne protokol er at påvise tilstrækkelig detaljeret disse teknisk udfordrende metoder som én protokol, herunder celle såning; medier og matrix gel vedligeholdelse; samling af celler til flowcytometri; RNA, DNA og protein udvinding; morfologiske vurdering fra lysfelt z-stakken analyse; indlejring, forarbejdning og skæring for histologiske farvning; og hele-montering til immunofluorescens eller fluorescerende sonde assays. Biologisk relevans og fortolkning af disse forskellige slutpunkter varierer blandt eksperimentelle design og antistoffer bruges til analyseformål. Gennem udnyttelse af denne protokol, bør brugere føler sig parat til at oprette et eksperiment med en værktøjskasse af slutpunkter.
Menneskelige primære prostata (PrE) epitelceller blev etableret i laboratoriet af protokollen beskrevet af Peehl15,16 og vedligeholdes således, at et begrænset antal passager (op til fire) som tidligere beskrevet17, men de er også tilgængelig fra kommercielle leverandører. Hepatocyt serumfrit mediebaseret6, KSFM-baserede13og R-spondin 1-aircondition5 medier offentliggøres alle som har med succes produceret organoids. KSFM-baserede kræver færrest mulige tilsætningsstoffer, så det er beskrevet her.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Dette papir beskriver en detaljeret protokol for tre-dimensionelle (3D) dyrkning, håndtering og vurdering af menneskers primære prostata organoids. Processen indebærer, såning af epitelceller tyndt i en 3D matrix gel på en 96-brønd mikrotiterplade med medieÃ¦ndringer at dyrke ekspansion i organoids. Morfologi vurderes derefter af hele-godt indfange af z-stak billeder. Komprimering af z-stakke skaber et enkelt i-fokus billede hvorfra organoids er målt til at kvantificere en række udgange, herunder cirkularitet, rundhed og område. DNA, RNA og protein kan indsamles fra organoids inddrives fra matrix gel. Cellepopulationer af interesse kan vurderes ved organoid dissociation og flow flowcytometri. Formalin-fiksering-paraffin-embedding (FFPE) efterfulgt af skæring bruges til histologisk vurdering og antistoffarvning. Hele-mount immunfluorescent farvning bevarer organoid morfologi og letter observation af protein lokalisering i organoids i stedet. Kommercielle assays, der traditionelt bruges til 2D éncellelag celler kan ændres for 3D organoids. Bruges sammen, giver teknikkerne i denne protokol en robust værktøjskasse for at kvantificere prostata organoid vækst, morfologiske kendetegn og udtryk for differentiering markører.

Efter vellykket kultur af human primære prostata organoids, kan morfologi og differentiering vurderes ved hjælp af lysfelt billedanalyse og FFPE og hele-mount farvning teknikker.
Lysfelt billedoptagelse proces er illustreret i figur 1A. Organoids er vokset i en 3D matrix og spredt på tværs af forskellige fokale planer. For at overholde organoids i fokus på tværs af mange fly, er det foreslået for at bruge en EUF billede (figur 1B, højre) i stedet for et enkelt z-fly (figur 1B, venstre). I laboratoriet, kan organoids dyrkes under forskellige forsøgsbetingelser medføre ændringer i morfologi. Ved hjælp af området, cirkularitet (defineret af hvor ens organoid er en cirkel) og max/min radius (måling af længde) give brugere en indikation af organoid størrelse og form og give en kvantificerbar udlæsning af morfologi. For at understrege nytten af disse foranstaltninger, er repræsentative billeder af organoids med lignende område, men forskellig morfologi vist i figur 1 c, hvor en lang organoid vil være mindre cirkulær og har en større maksimum/minimum ratio end en sfærisk organoid.
Indlejring organoids for histologi er en nyttig slutpunkt til at iagttage indre af prøver og sikre at nekrose ikke findes inden for kernen i en organoid. En arbejdsgang til denne proces og repræsentative resultater af unstained, sektioneret prøverne under et mikroskop for lysfelt leveres i figur 2AB, C. Figur 3A viser en mishandled organoid (venstre) sammenlignet med korrekt rakte organoids i figur 3A (højre) og figur 3B. For at bestemme differentiering-tilstand af prøven, anbefales det at kigge på basalcelle markører (cytokeratin 5 og p63)8 sammen med luminale celle markører (cytokeratin 8)8. Hvis det ønskes at pletten organoids i situ, hele-mount farvning er et bekvemt alternativ, og disse repræsentative resultater er angivet i figur 3 cD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figur 1: morfologi vurdering af organoids i 3D kultur. (A) billede indsamling og komprimering arbejdsgang for menneskers primære prostata organoids erhvervet ved en gennemlysning inverteret mikroskop med en motoriseret X / Y scanning fase og følgesvend software. (B) repræsentative billeder af en enkelt z-stak (venstre) vs. en EUF billede (højre) af en helhed-godt prøve af menneskelige primære prostata organoids, viser, at flere organoids er i fokus, når flere z-stakke er kombineret i en enkelt projicerede billede (skalalinjen = 1000 µm). (C) repræsentative billeder til området, cirkularitet og max/min forholdet mellem morfologisk ulige menneskelige primære prostata organoids, som har samme område (skalalinjen = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figur 2: Organoid indlejring arbejdsproces og repræsentant skæring resultater. (A) menneskelige primære prostata organoid indlejring arbejdsproces. (B) repræsentativt billede af en unstained, frisk dias, der indeholder menneskelige primære prostata organoids under en lysfelt mikroskop skildrer agar (grøn pil), histologi gel (sort pil), bubble (blå pil), organoids (røde pile) (skalalinjen = 1000 µ m). (C) Unstained frisk skåret dias (venstre) vs. unstained tør dias (til højre), organoids (røde pile) vises gennemsigtigt, når tør (skalalinjen = 500 µm) og er sværere at skelne under et mikroskop for lyse-felt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figur 3: histologisk farvning på sektioneret og hele monterede organoids. (A) H & E farvning af en brudte menneskers primære prostata organoid fra mishandling (aggressiv pipettering, forkert behandling protokol, venstre) ved siden af et godt håndteret organoid (højre) (skalalinjen = 100 µm). (B) menneskelige primære prostata organoid, der har været formalin-fast, paraffin-embedded, snit, og farves med basal cytokeratin 5 eller luminale cytokeratin 8 (øverst) eller basal p63 og luminale cytokeratin 8 (nederst) og afbildet med Konfokal mikroskop ( skalalinjen = 100 µm). (C) en hele monterede menneskelige primære prostata organoid farves med basal cytokeratin 5 eller luminale cytokeratin 8 og counterstained med phalloidin og DAPI, afbildet med Konfokal mikroskop (skalalinjen = 100 µm). (D) en hele monterede menneskelige primære prostata celle organoid farves med fluorescently mærket EdU og counter farves med Hoescht, afbildet med Konfokal mikroskop (skalalinjen = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Vi præsenterer her, en protokol for at lede menneskers primære prostata organoid håndtering så foreslår slutpunkter for at vurdere fænotype. Såning, kultur vedligeholdelse, recovery fra matrix gel, er morfologiske kvantificering, integrering og skæring, FFPE skæring, hele-mount farvning og anvendelse af kommercielle assays beskrevet.

Håndtering og vurdering af menneskers primære prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostata organoider er en spændende in vitro system til at studere udvikling og sygdom. De overvinder udfordringer af udødeliggjorte cellelinjer og tilbyder et billigt alternativ til dyremodeller. De kan dyrkes fra humane prostataceller, som vi har vist i denne protokol, samt mus prostataceller, som en sygdom-relevante præ-kliniske model system.Mange laboratorier har beskrevet nyttige kultur metoder og slutpunkter. Men vi håber at bringe disse detaljer sammen i én protokol og demonstrere de særligt udfordrende skridt for nye brugere. Efterhånden som teknikkerne forbedres, kan prostatakræft organoider dyrkes fra patientprøver som en præcision medicin tilgang til model sygdom og reaktion på behandlinger.Kulturforholdene er specifikke for prostataorganoider, men mange af endepunkterne er blevet tilpasset fra andre vævstyper. En bruger kan tilpasse dele af denne protokol til sin celletype af interesse. Start dette eksperiment ved at dyrke epitelceller i matrixgel-kodede 96-brøndsplader som beskrevet i manuskriptet.For at indsamle organoids fra pladerne efter 12 dage, skal du fjerne medium fra brøndene uden at forstyrre matrix gel. Derefter straks tilføje ca 200 mikroliter af neutral protease til hver brønd på omkring en-til-to forholdet mellem matrix gel til neutral protease. Inkuber pladen i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Derefter pipette op og ned til mekanisk adskille blandingen, og inkubere igen i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Efter inkubationen overføres den neutrale proteasematrixgelcelleblanding fra nogle få brønde til et mikrocentrifugerør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 gange g i tre til fem minutter.Fjern supernatanten, og gem organoid pellet til efterfølgende analyser. For at skabe forme til indlejring, skåret ud en lille del af en 1, 000-mikroliter pipette spids til at gøre en cylinder, der holder 50 mikroliter. Så fra den bredere del af den samme spids, lave en anden bredere skimmel, der passer rundt om den første form.For at oprette en kold blok, wrap en icepack med tape med den klæbende side op. Derefter tilsluttes forme vinkelret på båndet. At integrere organoider i en histologi gel stik til forarbejdning, først vaske den tidligere opnåede organoid pellet med en milliliter af Hank's Balanced Salt Solution.Efter centrifugering ved 300 gange g i tre til fem minutter fjernes supernatanten. Derefter tilsættes 30 til 50 mikroliter flydende histologi gel til organoid pellet, og bland forsigtigt ved langsomt pipettering op og ned for at resuspendere pellet. Overfør denne blanding i en støbeform på den kolde blok, og lad prøven køle af og størkne i et stik.Dernæst skal du bruge et stempel til at skubbe stikket ud af den lille mug og ind i midten af de større mug, og fylde det ved pipettering klar 2% agar omkring stikket. For at markere toppen af prøven, pipette histologisk farvestof-tonet 2% agar på toppen af stikket. Når agaren er afkølet, skal du bruge et stempel til at overføre stikket til en histologikassette.Mærk kassetten med en blyant og læg den i 10% neutral buffer formalin til natfiksering. Den følgende dag, overføre kassetten fra 10% neutral buffered formalin til 70% histologisk kvalitet ethanol, og behandle det yderligere og indlejre i paraffin. Begynd med at trimme bunden af blokken ved en 10-mikrometer tykkelse.Når en sektion, der indeholder stikområdet, vises, skal du stoppe med at trimme. Lås mikrotomrotoren, og overfør blokken tilbage på isen for at køle. Flyt klingen til en ny, ubrugt del.Og overfør blokken tilbage til klemmen. Lås maskinen op og begynd at trimme ved fem mikrometer pr. sektion. Brug en pincet til at overføre afsnittet til 40-graders Celsius vandbad, og lad det sprede sig ud.Dyp et dias lodret i vandet for at overføre sektionen til den. Derefter observere dias under et lyst felt mikroskop for at sikre, at en organoid er til stede i afsnittet. Bag natten over ved 45 til 50 grader Celsius, og derefter gå videre med farvning som beskrevet i manuskriptet.Start denne del af eksperimentet med ubrugte brønde af den 96-brønd matrix gelbelagte plade med organoider. Ved pipetting mod siden af brønden, forlader rummet mellem medier og matrix gel, omhyggeligt fjerne så mange medier som muligt uden at forstyrre organoid kultur. Brug en trimmet 1, 000-mikroliter pipette spids, pre-våd med PBS at udarbejde en dråbe matrix gel, der indeholder organoids af interesse.Dispenser dråben på midten af et kammer dias. Med det blotte øje, aspirere de overskydende medier og matrix gel fra kammeret dias ved hjælp af en fin-tippet pipette. At fremme organoid overholdelse af glasset og forhindre tab af prøver under efterfølgende vasketrin.Placer dias i en 37-graders-Celsius inkubator i 30 til 45 minutter. Pipettering langsomt for at forhindre løsrivelse fra fadet, tilsæt 200 mikroliter af 1X PBS at vaske organoids i fem minutter ved stuetemperatur med blid omrystning. Fjern forsigtigt 1X PBS og tilsæt 200 mikroliter af 4% paraformaldehyd.Fastgør i 30 minutter ved stuetemperatur ved forsigtig omrystning. Hos PFA vaskes og fortsættes efterfølgende permeabiliserings- og farvningstrin som beskrevet i denne protokol. Monter og billede med det samme.Unstained frisk-cut dias viser klart menneskelige primære prostata organoids, mens der i unstained tør slide, organoider synes gennemskinnelige og er sværere at opdage under et lyst felt mikroskop. Hematoxylin og eosin farvning viser en brudt menneskelige primære prostata organoid fra mishandling, såsom aggressiv pipettering, forkert behandling protokol i forhold til et godt håndteret organoid. Human primær prostata organoid var formalin-fast, paraffin-indlejret, opdelt, og farves med basal cytokeratin 5 og luminal cytokeratin 8, basal p63 og luminal cytokeratin 8, og afbilledet med konfokal mikroskop.En helmonteret human primær prostata organoid blev plettet med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8, og modstænt med falloidin og DAPI, og afbildet med konfokal mikroskop. En helmonteret primær prostatacelle organoid blev plettet med fluorescerende mærket Edu og kontrastained med Hoescht, og afbilledet med konfokal mikroskop. Det er vigtigt at visualisere dine organoider under hele proceduren.Når du har indsamlet sektionerne, skal du sørge for at visualisere prøverne på diaset, og sørg for at observere organoider under hele monteringen. Efter indsamling af organoider fra matrix gel, kan du hel-mount dem og bruge kommercielle analyser, eller dissociate til enkelte celler for flow cytometri eller enkelt-celle sekventering. 3D-kultur giver forskerne en ny måde at studere væv i indstillingen af en laboratorieret.Det kan anvendes til organogenese, eller til at forstå patologi af en patients sygdom. Når du arbejder med patientprøver, altid udvise forsigtighed og håndtere materialer som potentiale for blodbårne patogen eksponering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensanalyse af gentagen eksponering af organotypisk 3D bronchiale og Nasal vævskultur Modeller til Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Et hormon-responsiv 3D Kultur Model af menneskelige mælkekirtler epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiseret robot flydende håndtering forsamling af modulære DNA enheder

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Mikrofluidapparat Flow Afdeling Model for trombocytinfusion og Hæmostase Måler blodpladeaflejring og fibrindannelse i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En open source-teknologiplatform til fremstilling af hydrogelbaserede 3D-kulturmodeller på en automatiseret og standardiseret måde

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kultur metode til at opretholde hvilende humane hæmatopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...