Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Wij danken de leden van de UIC Biorespository, Dr. Klara Valyi-Nagy, en Alex Susma, evenals de Urologen, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira en Simone Crivallero, voor versoepeling van de weefsel aanwinst voor de primaire celculturen. Wij danken de UIC-urologie-patiënten voor het doneren van hun weefsel voor onderzoek. Dit werk werd gefinancierd, gedeeltelijk door het departement van defensie prostaat kanker onderzoek programma gezondheid verschillen idee Award PC121923 (Nonn) en het UIC-Center for Clinical en vertaling wetenschapsonderwijs Pre-doctoral voor (klinisch en translationeel wetenschappers PECTS) programma (McCray en Richards) en door de National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant nummers U54CA202995, U54CA202997 en U54CA203000, bekend als de Chicago gezondheid "equity" Collaborative (Nonn en Richards). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health of het ministerie van defensie.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Organotypic cultuur is een spannende nieuwe methode voor Recapitulerend weefsel met het gemak van een in vitro -omgeving. Op dit moment groeien labs organoids van vele types van weefsels voor verschillende eindpunten. De methoden die worden beschreven in dit document nuttig eindpunten samenvatten en markeer nieuwe technieken volledig karakteriseren 3D primaire prostaat celculturen.
Er zijn een verscheidenheid van media recepten voor het cultiveren van menselijke primaire prostaat cel organoids5,6,13. Terwijl alle levensvatbare en vergelijkbare resultaten bereiken, KSFM gebaseerde media13 gebruikt minimale additieven zodat het wordt beschreven hier. Bovendien zijn papers gepubliceerd met behulp van meerdere concentraties voor matrix gel, van 10% tot 75% tot cultuur prostaat organoids5,6,13. Omdat de matrix gel is een duur reagens, en 33% matrix gel is aangetoond dat voldoende is om te cultiveren van lange termijn (2-3 weken), levensvatbare, unclumped organoids13, dit is de aanbevolen concentratie. Matrix gel kan echter variëren in eiwitconcentratie tussen de lotnummers, zodat hiermee rekening moet worden gehouden wanneer plating. Het is ook aanbevolen voor de aankoop van matrix gel in bulk voor gebruik in meerdere experimenten om inconsistentie tussen veel. Andere laboratoria hebben verschillende formaten voor de plating matrix gel, zoals druppeltjes in plaats van een 96-wells-plaat goed5coating gepubliceerd. Beide methoden vormen levensvatbare organoids, maar de indeling hier beschreven voorziet in cellen worden meer dun, vergulde waarvan is aangetoond dat het bevorderen van de bekendheid van de cellen groter organoids13. Echter moet plating dichtheid worden geoptimaliseerd op basis van patiënt-specifieke vorming efficiëntie. Matrix gel is beschikbaar in vele formaten waaronder groeifactor verminderde, fenol rood-vrije, hoge concentratie, enz. Groeifactor-verminderd wordt aanbevolen voor kweekomstandigheden gedefinieerd en fenol rood-vrije wordt aanbevolen bij het werken met cellen die uitdrukking geven aan GFP of in experimenten waarbij z-stack Fotolader. Het is essentieel dat elke matrix gel plating stappen worden uitgevoerd met ijskoude reagentia, zoals matrix gel snel bij kamertemperatuur stolt.
Organoids geteeld onder verschillende experimentele behandelingen kan resulteren in wijzigingen aan vorm, zodat helder-veld imaging veel gebruikt wordt om te studeren waargenomen morfologische fenotypen. Niettemin, opname en kwantificering van gebied of vorm is een uitdaging om twee redenen: 1) selectie bias tijdens Fotolader en 2) het toepassen van een tweedimensionale parameter zoals gebied op een driedimensionale monster. Een strategie van Fotolader is opnemen van een willekeurig veld en meten van een vooraf bepaald aantal organoids op dat gebied, kan maar dit vooroordeel tijdens de selectie kunt maken, en alle organoids in het geselecteerde veld niet in focus. Geheel-well imaging geoptimaliseerd voor de indeling van de 96-Wells microplate elimineert deze bemonstering bias door het verzamelen van de bevolking van de hele organoid van belang. Echter, afhankelijk van de doelstellingen van de Microscoop op hand wellicht meerdere velden worden verzameld en betegeld met het oog op de afbeelding van een geheel-well. Sommige laboratoria hebben meten gebied van een enkele z-plane12beschreven, maar om vast te leggen van alle organoids in focus, wordt u geadviseerd te verzamelen en stapelen van meerdere vlakken in een enkele EOF-afbeelding13. In sommige gevallen een meniscus in de matrix gel kan vignettering in de afbeelding en achtergrond correctie methoden mogelijk moeten worden toegepast met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Exacte volume is idealiter de geschiktste meting voor de grootte van de organoid; Dit is echter moeilijk precies te verkrijgen, zelfs met meerdere plaatjes-z-stack. Andere nuttige morfologische dimensies, zoals cirkelvormigheid en maximale/minimale verhouding, kunnen gemakkelijk worden berekend op basis van alle organoids in een geheel-well EOF afbeelding. Samen, deze methoden overwinnen sampling bias uitdagingen en inschakelen van de meting van 2D parameters van 3D-objecten in een 3D-ruimte.
Formaline fixatie en paraffine inbedding van organoids is een gemeenschappelijke werkwijze te halen haematoxyline en eosine (H & E), immunohistochemische (IHC) en immunefluorescentie (IF) kleuring voor visualisatie en analyse6,11, 20. echter een publicaties die deze techniek beschreven gebrek aan uitgebreide gegevens over het insluiten proces. Bovendien kan vinden van organoids binnen het blok van paraffine worden uitdagende. Enkele labs vlek vooraf organoids met trypan blauwe voorafgaand aan insluiten om te helpen bij locatie tijdens het segmenteren van11. De hier beschreven methode omvat het gebruik van een histologische kleurstof voor oriëntatie van de gelplug van de organoid/histologie tijdens te embedding ter bevordering van de efficiëntie van het segmenteren. H & E dia's vergemakkelijken onderzoek van necrose en textuur van de nucleaire proliferatie, en dus moet het een verplichte eindpunt voor organoid cultuur om ervoor te zorgen dat de cellen gezond in heel het gebied zijn. Een sterkte van organoid cultuur is dat monsters bestaan uit een heterogene mengsel van cellen die beter in vivo patiënten weefsel lijken. In de prostaat, bijvoorbeeld, zijn zowel de luminal als de basale cellen aanwezig in de prostaat organoids5, terwijl cellen gekweekt in 2D ontbreken luminal differentiatie8. Om te beoordelen organoid differentiatie, is het aanbevolen dat onderzoekers basale markeringen zoals CK5 en p63 en luminal markeringen zoals androgeen receptoren en CK88 beoordelen. Elke andere experimentele proteÃ¯nen van belang kunnen ook worden bestudeerd met behulp van deze kleuring technieken.
Hoewel FFPE secties toestaan visualisatie van de cellen die woonachtig zijn in de innerlijke compartiment via histologische methoden (H & E, als, IHC), beelden zijn beperkt tot het Kruis secties, en organoid vorm kan worden veranderd door het insluiten proces. Geheel-mount kleuring kan een organoid worden gekleurd en waargenomen in situ, behoud van morfologische fenotypes en beelden van eiwit localisatie toe te staan. Geheel-montage is een hulpmiddel gebruikt om het geheel-weefsel of geheel-dier monsters, zoals de zebravis of muis embryo, vlekken en is gemakkelijk aan te passen voor organoids. De hier beschreven techniek werd vanaf de procedure gewijzigd door Mahéet al. 11, die gegevens van de initiële groei en de cultuur van gastro-intestinale organoids rechtstreeks op de dia van een kamer voor de kleuring en fixatie van de volledige hoofd-cultuur vereist. De hier geschetste methode omvat de overdracht van een enkele organoid (of organoids) van belang in een kamer dia ten tijde van de kleuring. Hierdoor is de selectie van individuele organoids in een lopende experiment zonder fixatie van de bovenliggende cultuur p.a. geheel-mount. Bij het uitvoeren van geheel-mount kleuring, het is noodzakelijk voor het optimaliseren van de permeabilization en de incubatietijd voor primaire en secundaire antilichamen om penetratie tijdens het specimen (overal van één of meer dagen wordt aanbevolen). Zodra het beeld via confocale microscopie, kunnen 3D renderings worden geproduceerd om te schakelen van visualisatie en lokalisatie van een specifieke proteïne en bereken het aantal positief gekleurde cellen aanwezig in een monster. Stroom cytometry is een nuttig eindpunt te kwantificeren populaties van basale, luminal, of5,14van de cellen van de stam. Om dit te doen, worden cellen hersteld van de matrix-gel en zachtjes los gezien voor de kleuring. Gebruikers moeten passende markeringen voor scheiding op basis van de huidige literatuur zorgvuldig selecteren. Voor menselijke primaire prostaat epitheliale cellen zijn CD26 en CD49f geschikt luminal en basale markers, respectievelijk5,21.
Kortom gegevens dit protocol menselijke primaire prostaat organoid groei, collectie, en experimentele eindpunten. Van de nota, kan de montage techniek beschreven worden toegepast op een verscheidenheid van andere tests die normaal werkzaam zijn voor 2D cellen, zoals fluorescente sonde gebaseerde experimenten kijken proliferatie19, apoptosis en subcellular organel vlekken. Bovendien, kan de collectie en dissociatie hier beschreven methode worden gebruikt ter voorbereiding van eencellige RNA sequencing18. Collectief, hieruit blijkt dat de mogelijkheid voor een verscheidenheid van roman, hifi-eindpunten die onderzoekers kunnen optimaliseren en verkennen in de toekomst.

Organoids zijn een waardevol instrument om organogenese en ziekte te studeren. Zij bieden een goedkoper alternatief voor dierlijke modellen en patiënt afkomstige organoids evolueren als een strategie voor gepersonaliseerde geneeskunde1,2,3. Dit systeem van driedimensionale (3D) cultuur gaat zaaien stam of voorlopercellen cellen (geoogst van weefsel of geïnduceerde pluripotente stamcellen) in een gel van (matrix gel)4van de componenten van de extracellulaire matrix. De cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken, resulterend in organotypic structuren die de cellulaire hiërarchie en de morfologie van het orgaan van de functionele eenheid van belang recapituleren. Organoids zijn geteeld met behulp van cellen die afkomstig zijn uit een verscheidenheid van organen, met inbegrip van de speekselklieren, maag, darm, lever, prostaat, longkanker en hersenen4. Hoewel er talrijke protocollen beschrijven van stappen om de prostaat organoids5,6, is het uitdagend om te vinden van voldoende gedetailleerde methoden over hoe om kwantitatieve eindpunten van organoids. Dit document bevat een overzicht van methoden ontwikkeld voor menselijke primaire prostaat cellen en details van een aantal voorgestelde eindpunten te beoordelen van de fenotypen van organoid. Deze technieken werden geoptimaliseerd voor prostaat organoids en voor andere 3D celculturen kunnen gelden.
Prostaat organoid culturen hebben onlangs naar voren gekomen als een waardevolle in vitro model die mist van de beperkingen van enkelgelaagde culturen met vereeuwigd cellijnen gevestigde. Goedaardige prostaat epitheel en prostaatkanker is uitdagend model in vitro met behulp van vereeuwigd cellijnen. Het aantal goedaardige cellijnen is beperkt, en alle hebben ondergaan transformatie met oncogenen7. Primaire prostaat epitheliale cellen in monolayers niet onderscheiden in luminal cellen en gebrek aan androgeen receptoren8. De meerderheid van de cellijnen van prostaatkanker hebben geen functionele androgeen receptoren, een belangrijke bemiddelaar van het begin staat van de ziekte, en ontbreken belangrijke genetische veranderingen die zijn gevonden in patiënt tumoren9. Prostaat organoid culturen kunnen gemakkelijk worden gekweekt uit goedaardige epitheel en waardevol bij het bestuderen van de eigenschappen van de cel van de stam, voorlopercellen, differentiatie en effecten van experimentele veranderingen in de communicatie4,5. Prostaatkanker organoids kunnen worden gekweekt als onderdeel van een precisienadering geneeskunde Modeling patiënt ziekte en reactie op therapieën10.
Dit protocol is samengesteld uit bestaande protocollen die gebruikmaken van verschillende celtypes, maar het hier is geoptimaliseerd voor gebruik in menselijke primaire prostaat cellen. Het complimenten protocollen tekenruimte Zagers, Clevers en Shen5,6 , die groei, passaging, helder-veld imaging, cryopreservatie en RNA en DNA isolatie van prostaat muis en menselijke organoids beschrijven. Het geheel-koppelingsprotocol is van Mahé et al. gewijzigd 11, die gastro-intestinale epitheliale organoids gebruikt en beschrijft levende imaging en bevroren en paraffine insluiten. Borten et al. 12 beschreven de analyse van borst, dubbelpunt en colorectale kanker organoid morfologie van helder-veld beeldvorming. Bovendien, Richards et al. 13 gebruikt een methode voor de morfologische beoordeling van prostaat organoids. Ten slotte, Hu et al. 14 beschreven een methode voor het daaraan vastzittende prostaat organoids aan een dia kamer overnachten vóór de immunefluorescentie kleuring om afzonderlijke cellen en dispersie van bollen voor stroom cytometry analyse te observeren.
Het doel van dit protocol is om aan te tonen in voldoende detail deze technisch uitdagende methoden als één protocol, met inbegrip van cel zaaien; media en matrix gel onderhoud; verzameling cellen voor stroom cytometry; RNA, DNA en eiwit extractie; beoordeling van de morfologische van helder-veld z-stack analyse; insluiten, verwerking en segmenteren voor histologisch kleuring; en geheel-montage voor immunofluorescentie of fluorescente sonde testen. De biologische relevantie en de interpretatie van deze verschillende eindpunten zal verschillen tussen proefopzet en antilichamen gebruikt voor analyse. Door gebruik van dit protocol, moeten de gebruikers willen opzetten van een experiment met een toolkit van eindpunten voelen.
Menselijke cellen voor primaire epitheliale prostaat (PrE) werden opgericht in het lab door het protocol beschreven door Peehl15,16 en gehandhaafd om een beperkt aantal passages (maximaal vier) als eerder beschreven17, maar ze zijn ook verkrijgbaar via commerciële leveranciers. Hepatocyte serumvrij media gebaseerde6, KSFM gebaseerde13en R-spondin 1-geconditioneerd5 media zijn alle gepubliceerde als organoids met succes hebben geproduceerd. KSFM gebaseerde vereist het minste aantal additieven, dus het wordt hier beschreven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Dit witboek beschrijft een gedetailleerd protocol voor driedimensionale (3D) kweken, behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat organoids. Het proces omvat zaaien van epitheliale cellen dunbevolkte in een 3D matrix gel op een 96-Wells-microplate met media wijzigingen in het cultiveren van expansie in organoids. Morfologie wordt vervolgens beoordeeld door geheel-well vastleggen van beelden van de z-stack. Compressie van z-stacks creëert één in-focus afbeelding waaruit organoids worden gemeten om te kwantificeren van een aantal uitgangen, met inbegrip van cirkelvormigheid, ronding en oppervlak. DNA, RNA en eiwitten kunnen worden verzameld van organoids hersteld van de matrix-gel. Cel bevolking van belang kunnen worden geëvalueerd door organoid dissociatie en stroom cytometry. Formaline-fixatie-paraffine-insluiting (FFPE) gevolgd door segmenteren is gebruikt voor de histologische beoordeling en antilichaam kleuring. Geheel-mount immunefluorescentie kleuring behoudt organoid morfologie en waarneming van eiwit lokalisatie in organoids in situvergemakkelijkt. Commerciële testen, die traditioneel worden gebruikt voor 2D enkelgelaagde cellen kunnen worden gewijzigd voor 3D organoids. De technieken in dit protocol bieden samen worden gebruikt, een robuuste gereedschapskist om te kwantificeren van de groei van de prostaat organoid, morfologische kenmerken en expressie van differentiatie markers.

Na succesvolle cultuur van menselijke primaire prostaat organoids, kunnen morfologie en differentiatie worden beoordeeld met behulp van FFPE, helder-veld beeldanalyse en geheel-mount kleuring technieken.
Het proces van helder-veld Fotolader wordt geïllustreerd in figuur 1A. Organoids zijn gegroeid in een 3D matrix en verspreid over verschillende focal vlakken. Om te observeren organoids in focus over vele vliegtuigen, wordt voorgesteld om het EOF image (figuur 1B, rechts) gebruiken in plaats van een enkel z-vliegtuig (figuur 1B, links). In het lab, organoids gegroeid onder verschillende experimentele omstandigheden kan leiden tot veranderingen in de morfologie. Met behulp van gebied, cirkelvormigheid (gedefinieerd door hoe vergelijkbaar de organoid tot een cirkel is) en max/min straal (maatregel van lengte) gebruikers geven een indicatie van organoid grootte en vorm en bieden een kwantificeerbare uitlezing van morfologie. Om te benadrukken het nut van deze maatregelen, worden representatieve beelden van organoids met soortgelijk gebied maar verschillende morfologie weergegeven in Figuur 1 c, waarin een lange organoid worden minder circulaire en hebben een grotere maximale/minimale verhouding dan een bolvormig organoid.
Het insluiten van organoids voor histologie is een nuttig eindpunt te observeren van het interieur van de monsters en zorgen dat necrose is niet aanwezig in de kern van een organoid. Een workflow voor dit proces en de resultaten van de vertegenwoordiger van de monsters van het Onbevlekt, verdeelde onder een heldere-veld Microscoop vindt u in figuur 2AB, C. Figuur 3A geeft een onjuist afgehandelde organoid (links) vergeleken met goed overhandigde organoids in figuur 3A (rechts) en figuur 3B. Om te bepalen van de differentiatie-en statuswaarden van het monster, is het raadzaam om te kijken naar basale cel markeringen (cytokeratin 5 en p63)8 samen met de luminal cel markeringen (cytokeratin 8)8. Het is dan ook om vlek organoids desgewenst in situ, geheel-mount kleuring is een handig alternatief, en deze representatieve resultaten vindt u in Figuur 3 cD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figuur 1: beoordeling van de morfologie van organoids in 3D cultuur. (A) foto-collectie en compressie workflow voor menselijke primaire prostaat organoids overgenomen door een doorvallend licht omgekeerd Microscoop met een gemotoriseerde X / Y fase en metgezel scansoftware. (B) representatieve beelden van een enkele z-stack (links) vs. een EOF afbeelding (rechts) van een geheel-well steekproef van menselijke primaire prostaat organoids, waaruit blijkt dat meer organoids in focus wanneer meerdere z-stacks zijn gecombineerd tot een enkele geprojecteerde beeld (schaal bar = 1000 µm). (C) representatieve beelden voor gebied, cirkelvormigheid en max/min verhouding van morfologisch ongelijke menselijke primaire prostaat organoids hebben hetzelfde gebied (schaal bar = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figuur 2: Organoid insluiten workflow en vertegenwoordiger resultaten segmenteren. (A) menselijke primaire prostaat organoid werkstroom te embedding. (B) representatieve afbeelding van een dia van het Onbevlekt, verse met menselijke primaire prostaat organoids onder een heldere veld Microscoop beeltenis agar (groene pijl), histologie gel (zwarte pijl), bel (blauwe pijl), organoids (rode pijlen) (schaal bar = 1000 µ m). (C) onbevlekt vers gesneden dia (links) vs. organoids (rode pijlen) verschijnt onbevlekt droge dia (rechts), doorschijnend ostand (schaal bar = 500 µm) en zijn moeilijker te onderscheiden onder een heldere-veld Microscoop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figuur 3: histologische kleuring op verdeelde en geheel gemonteerde organoids. (A) H & E kleuring van een gebroken mens primaire prostaat organoid van verkeerde behandeling (agressieve pipetteren, verkeerde verwerking protocol, links) naast een goed behandeld organoid (rechts) (schaal bar = 100 µm). (B) menselijke prostaat, primaire organoid, die al formaline-vaste, paraffine-ingebedde, gesegmenteerd, en gekleurd met basale cytokeratin 5 of luminal cytokeratin 8 (boven) of basale p63 en luminal cytokeratin 8 (onder) en beeld met confocal microscoop ( schaal bar = 100 µm). (C) een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaat organoid gekleurd met basale cytokeratin 5 of luminal cytokeratin 8 en counterstained met phalloidin en DAPI, beeld met confocal microscoop (schaal bar = 100 µm). (D) een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaat cel organoid gekleurd met fluorescently label EdU en teller gekleurd met Hoescht, beeld met confocal microscoop (schaal bar = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Hier presenteren we een protocol om begeleiden van menselijke primaire prostaat organoid behandeling dan eindpunten om te beoordelen fenotype suggereren. Zaaien, cultuur onderhoud, herstel van matrix gel, worden morfologische kwantificering, insluiten en segmenteren, FFPE segmenteren, geheel-mount kleuring en toepassing van commerciële tests beschreven.

Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostaatorganoïden zijn een spannend in vitro systeem voor het bestuderen van ontwikkeling en ziekte. Ze overwinnen uitdagingen van vereeuwigde cellijnen en bieden een goedkoop alternatief voor diermodellen. Ze kunnen worden gekweekt uit menselijke prostaatcellen, zoals we hebben aangetoond in dit protocol, evenals muis prostaatcellen, als een ziekte-relevant pre-klinisch modelsysteem.Veel laboratoria hebben beschreven nuttige cultuur methoden en eindpunten. Maar we hopen deze details samen te brengen in één protocol en de bijzonder uitdagende stappen voor nieuwe gebruikers aan te tonen. Naarmate de technieken verbeteren, kunnen orgaanoïden van prostaatkanker worden gekweekt uit patiëntmonsters als een precisiemedicijnbenadering van modelziekte en respons op therapieën.De kweekomstandigheden zijn specifiek voor prostaatorganoïden, maar veel van de eindpunten zijn aangepast van andere weefseltypes. Een gebruiker kan delen van dit protocol aanpassen aan het celtype van belang. Start dit experiment door het kweken van epitheliale cellen in matrix gel-gecodeerde 96-well platen zoals beschreven in het manuscript.Om organoïden na 12 dagen van de platen te verzamelen, verwijder dan medium uit de putten zonder de matrixgel te storen. Voeg dan onmiddellijk ongeveer 200 microliter van neutrale protease aan elk goed bij ongeveer een één-op-twee verhouding van matrixgel aan neutrale protease toe. Broed de plaat 20 minuten bij 37 graden Celsius.Dan pipet op en neer om mechanisch scheiden van het mengsel, en opnieuw uitbroeden voor 20 minuten op 37 graden Celsius. Breng na de incubatie het neutrale protease matrix gelcelmengsel van een paar putten over naar een microcentrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugatie op 300 keer g gedurende drie tot vijf minuten.Verwijder de supernatant, en sla de organoïde pellet voor latere analyses. Om mallen te maken voor het inbedden, knip een klein deel van een 1.000-microliter pipettip uit om een cilinder te maken die 50 microliters bevat. Dan uit het bredere deel van dezelfde tip, maak een tweede bredere mal die past rond de eerste mal.Om een koud blok te maken, wikkel een icepack met tape met de lijm kant omhoog. Dan hechten de mallen loodrecht op de tape. Om de organoïden in te bedden in een histologie gel plug voor verwerking, eerst wassen de eerder verkregen organoïde pellet met een milliliter van Hank's Balanced Salt Solution.Na het centrifugeren op 300 keer g gedurende drie tot vijf minuten, verwijder de supernatant. Voeg vervolgens 30 tot 50 microliter vloeibare histologiegel toe aan de organoïde pellet en meng zachtjes door langzaam op en neer te pipetten om de pellet opnieuw te verleggen. Breng dit mengsel in een mal op het koude blok, en laat het monster afkoelen en stollen in een stekker.Gebruik vervolgens een zuiger om de stekker uit de kleine mal en in het midden van de grotere mal te duwen, en vul deze door 2% agar rond de stekker te pipetten. Om de bovenkant van het monster te markeren, pipet histologic kleurstof getinte 2% agar op de top van de stekker. Zodra de agar is afgekoeld, gebruik dan een zuiger om de stekker over te zetten in een histologie cassette.Label de cassette met een potlood en plaats deze in 10% neutraal gebufferd formaline voor nachtelijke fixatie. Breng de cassette de volgende dag over van 10% neutraal gebufferd formaline naar 70% histologische ethanol, en verwerk deze verder en insluit het in paraffine. Begin met het trimmen van de basis van het blok op een dikte van 10 micrometer.Zodra een sectie met het stekkergebied wordt weergegeven, stopt u met trimmen. Vergrendel de microtome rotor en breng het blok terug op het ijs om te koelen. Verplaats het mes naar een nieuw, ongebruikt gedeelte.En breng het blok terug naar de klem. Ontgrendel de machine en begin met trimmen op vijf micrometer per sectie. Gebruik een pincet om de sectie over te dragen aan de 40-graden Celsius waterbad, en laat het verspreiden.Dompel een glijbaan verticaal in het water om de sectie erop over te brengen. Bekijk vervolgens de dia onder een heldere veldmicroscoop om ervoor te zorgen dat er een organoïde in de sectie aanwezig is. Bak 's nachts op 45 tot 50 graden Celsius, en ga dan verder met vlekken zoals beschreven in het manuscript.Begin dit deel van het experiment met ongebruikte putten van de 96-well matrix gel-gecoate plaat met organoïden. Door tegen de zijkant van de put te pipetten, ruimte te laten tussen media en matrixgel, verwijder dan voorzichtig zoveel mogelijk media zonder de organoïde cultuur te verstoren. Gebruik een bijgesneden 1.000 microliter pipettip, voorwettig met PBS om één druppel matrixgel op te stellen die de organoïden van belang bevat.Doe de druppel op het midden van een kamerglijbaan. Met het blote oog, aspirate de overtollige media en matrix gel van de kamer glijbaan met behulp van een fijn-getipt pipet. Om organoïde hechting aan het glas te bevorderen en verlies van monsters tijdens de volgende wasstappen te voorkomen.Plaats de glijbaan 37 tot 45 minuten in een couveuse van 37 graden Celsius. Pipetteren langzaam om loslating van de schotel te voorkomen, voeg 200 microliter van 1X PBS toe om de organoïden vijf minuten te wassen bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder de 1X PBS voorzichtig en voeg 200 microliter van 4% paraformaldehyde toe.Fix voor 30 minuten op kamertemperatuur met zachte schudden. Bij PFA, wassen en doorgaan met de daaropvolgende permeabilisatie en kleuring stappen zoals beschreven door dit protocol. Mount en beeld onmiddellijk.Onbevlekte vers gesneden dia toont duidelijk menselijke primaire prostaatorganoïden, terwijl in onbevlekte droge dia, organoïden lijken doorschijnend en zijn moeilijker te detecteren onder een helder veld microscoop. Hemataxylin en eosine kleuring toont een gebroken menselijke primaire prostaat organoïde van verkeerd gebruik, zoals agressieve pipetting, verkeerde verwerking protocol in vergelijking met een goed behandelde organoïde. Menselijke primaire prostaat organoïde was formaline-vaste, paraffine-embedded, gesectied, en gekleurd met basale cytokeratine 5 en luminale cytokeratine 8, basale p63 en luminale cytokeratine 8, en afgebeeld met confocale microscoop.Een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaat organoïde werd bevlekt met basale cytokeratine 5 of luminale cytokeratine 8, en tegengehouden met phalloidin en DAPI, en afgebeeld met confocale microscoop. Een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaatcel organoïde werd bevlekt met fluorescerend gelabeld Edu en tegenbevlekt met Hoescht, en afgebeeld met confocale microscoop. Het is belangrijk om uw organoïden te visualiseren tijdens de procedure.Na het verzamelen van de secties, zorg ervoor dat de monsters op de dia te visualiseren, en zorg ervoor dat u organoïden observeren tijdens de hele montage. Na het verzamelen van de organoïden uit de matrixgel, u ze geheel monteren en commerciële tests gebruiken, of zich distantiëren met enkele cellen voor stroomcytometrie of eencellige sequencing. 3D-cultuur biedt onderzoekers een nieuwe manier om weefsel te bestuderen in de setting van een labschotel.Het kan worden toegepast op organogenese, of op het begrijpen van de pathologie van de ziekte van een patiënt. Wees bij het werken met patiëntmonsters altijd voorzichtig en behandel de materialen als potentieel voor blootstelling aan door bloed overgedragen ziekteverwekkers.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Een open source technologieplatform om op Hydrogel gebaseerde 3D-cultuurmodellen op een geautomatiseerde en gestandaardiseerde manier te produceren

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...