Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Nous remercions les membres de l’UIC Biorespository, Dr. Klara Nadine-Nagy et Alex Susma, ainsi que les urologues, les Drs Michael Abern, Daniel Moreira et Simone Crivallero, pour la facilitation de l’acquisition de tissu pour les cultures de cellules primaires. Nous remercions les patients d’urologie de l’UIC pour le don de leur tissu à la recherche. Ce travail a été financé, en partie, par le ministère de la défense Prostate Cancer recherche programme santé disparités idée prix PC121923 (Nonn) et le centre de l’UIC pour clinique et traduction Science Pre-doctoral Education pour les cliniques et translationnelles scientifiques ( PECTS) programme (McCray et Richards) et par du National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant numéros U54CA202995, U54CA202997 et U54CA203000, connu comme le Chicago Health Equity Collaborative (Nonn et Richards). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health ou le ministère de la défense.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La culture Organotypique est une méthode nouvelle excitante pour récapitulant les tissus avec la commodité d’un milieu in vitro . Actuellement, les laboratoires poussent organoïdes de nombreux types de tissus pour divers paramètres. Les méthodes décrites dans le présent document résument les points de terminaison utiles et mettre en évidence de nouvelles techniques pour caractériser complètement les cultures de cellules de la prostate primaire 3D.
Il existe une variété de recettes de médias pour cultiver des cellules de la prostate humain primaire organoïdes5,6,13. Alors que tous obtenir des résultats viables et comparables, médias KSFM13 utilise additifs minimales donc il est décrit ici. En outre, les articles ont été publiés à l’aide de plusieurs concentrations pour le gel de matrice, de 10 à 75 % à la culture la prostate organoïdes5,6,13. Parce que la matrice gel est un réactif coûteux, et 33 % gel de matrice s’est avéré être suffisant pour cultiver à long terme (2-3 semaines), viable, unclumped organoïdes13, il s’agit de la concentration recommandée. Cependant, gel de matrice peut varier dans la concentration de protéines entre les numéros de lot, donc cela devrait tenir compte lors de l’ensemencement. Il est également recommandé d’acheter le gel de matrice en vrac pour utilisation à travers de multiples expériences visant à réduire l’incohérence entre les lots. D’autres laboratoires ont publié différents formats pour placage gel de matrice, tels que les gouttelettes au lieu d’une plaque à 96 puits puits5de revêtement. Ces deux méthodes font organoïdes viable, mais le format décrit ici permet d’être plaqué de plus faible densité, des cellules qui a été établi pour promouvoir l’expansion des cellules dans le plus grand organoïdes13. Cependant, la densité de placage doit être optimisé basé sur l’efficacité de la formation spécifique au patient. Matrice gel est disponible en plusieurs formats, y compris le facteur de croissance réduite, sans rouge de phénol et haute concentration, etc.. Réduit de facteur de croissance est recommandé pour définir les conditions de culture et exempt de rouge de phénol est recommandé lorsque vous travaillez avec des cellules exprimant la GFP ou dans les expériences impliquant la capture d’image z-pile. Il est essentiel que des mesures de placage matrice gel être réalisée avec des réactifs glacées, comme le gel de la matrice se solidifie rapidement à température ambiante.
Organoïdes cultivées sous différents traitements expérimentaux peut entraîner des changements à la forme, donc imagerie champ lumineux est largement utilisé pour l’étude des phénotypes morphologiques observées. Néanmoins, d’enregistrement et de quantifier les zone ou la forme sont un défi pour deux raisons : biais de sélection 1) au cours de la capture d’image et 2) appliquer un paramètre deux dimensions tels que la zone à un échantillon en trois dimensions. Une stratégie de capture d’image consiste à enregistrer un champ aléatoire et mesurer un nombre prédéterminé d’organoïdes dans ce domaine, mais cela peut créer des biais lors de la sélection, et tous les organoids dans le champ sélectionné peut ne pas être mise au point. Imagerie ensemble-bien optimisé pour le format microplaque 96 puits élimine ce biais d’échantillonnage en recueillant la population entière organoïde d’intérêt. Toutefois, selon les objectifs de microscope sur la main, plusieurs champs peuvent doivent être recueillis et carrelage afin d’obtenir une image d’ensemble-puits. Certains laboratoires ont décrit la zone de mesurage d’un seul plan z12, mais pour capturer tous les organoids en bref, il est recommandé de collecter et d’empiler des plans multiples dans un seul EDF-image13. Dans certains cas, un ménisque dans le gel de la matrice peut causer le vignettage dans l’image, et méthodes de correction de fond peuvent doivent être appliquées à l’aide de logiciels d’analyse image. Volume exact est idéalement la mesure plus appropriée pour organoïde grandeur ; Cependant, c’est difficile d’obtenir avec précision, même avec plusieurs images de z-pile. Autres dimensions morphologiques utiles, telles que la circularité et la proportion maximale/minimale, peuvent se calculer facilement de tous les organoïdes dans une image d’EDF bien ensemble. Ensemble, ces méthodes surmonter d’échantillonnage défis biais et permettent de mesurer des paramètres 2D à partir des objets 3D dans un espace 3D.
Fixation de formol et enrobage de paraffine d’organoïdes est une méthode commune pour obtenir l’hématoxyline et éosine (H & E), immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF) pour la visualisation et l’analyse6,11, 20. Toutefois, les publications qui ont décrit cette technique pas détaillés sur le processus d’incorporation. En outre, il peut être difficile de localiser des organoïdes dans le bloc de paraffine. Certains laboratoires pré détachant organoïdes avec trypan bleu avant l’incorporation à l’aide en situation au cours de la section11. La méthode décrite ici incorpore l’utilisation d’un colorant histologique pour l’orientation de la gelplug organoïde/histologie au cours de l’incorporation à promouvoir l’efficacité de sectionnement. H & E de diapositives facilitent l’examen de la nécrose, texture nucléaire et la prolifération, et il devrait donc être un point de terminaison obligatoire pour organoïde culture pour s’assurer que les cellules sont en bonne santés tout au long de la sphère. Une force de la culture organoïde est que les échantillons sont constitués d’un mélange hétérogène de cellules qui ressemblent à des tissus du patient en vivo mieux. Dans la prostate, par exemple, les cellules basales et luminaux sont présents dans la prostate organoïdes5, alors que les cellules cultivées en 2D manque de différenciation Luminale8. Afin d’évaluer la différenciation organoïde, il est recommandé que les chercheurs évaluent basales marqueurs tels que CK5 et p63 et luminaux tels que les récepteurs aux androgènes et CK88. Aucune autre protéine expérimentale d’intérêt peut également être étudiés à l’aide de ces techniques de coloration.
Bien que FFIP sections permettent la visualisation des cellules résidant dans les compartiment interne via histologique méthodes (H & E, IF, IHC), images se limitent aux sections droites et organoïde forme peut-être être modifié par le processus d’incorporation. Entier-Montez la souillure permet un organoïde être colorés et observés in situ, préservant les phénotypes morphologiques et permettant des images de la localisation de la protéine. Ensemble-montage est un outil utilisé pour souiller des spécimens ensemble des tissus ou des animaux entiers, tels que l’embryon de poisson zèbre ou la souris et est facile à adapter pour organoïdes. La technique décrite ici a été modifiée par la procédure de Mahéet al. 11, qui détaille la croissance initiale et la culture d’organoïdes gastro-intestinal directement sur une lame de chambre pour la coloration et nécessite la fixation de la culture de l’ensemble parent. La méthode décrite ici implique le transfert d’organoïde unique (ou organoids) d’intérêt sur une lame de la chambre au moment de la coloration. Cela permet la sélection des organoïdes individuelles pour l’analyse des entiers dans une expérimentation en cours sans fixation de la culture parente. Lorsque vous effectuez entier-Montez la souillure, il est nécessaire d’optimiser le temps d’incubation pour des anticorps primaires et secondaires assurer une pénétration dans l’ensemble de l’échantillon et la perméabilisation (n’importe où depuis un jour ou plus est recommandé). Une fois l’image par microscopie confocale, rendus 3D peuvent être produits pour permettre la visualisation et la localisation d’une protéine spécifique et calculer le nombre de cellules colorées positivement présents dans un échantillon. Cytométrie en flux est un paramètre utile pour quantifier les populations de basale, luminal, ou cellules souches5,14. Pour ce faire, les cellules sont récupérés depuis le gel de la matrice et doucement dissociées pour la coloration. Utilisateurs doivent sélectionner avec soin les marqueurs appropriées pour séparation basée sur la littérature actuelle. Pour primaire la prostate cellules épithéliales humaines, CD26 et CD49f sont adaptés luminales et basales des marqueurs, respectivement de5,21.
En résumé, ce protocole en détail la croissance humaine organoïde la prostate primaire, collection et paramètres expérimentaux. À noter, la technique de montage décrite peut être appliquée à une variété d’autres dosages qui sont normalement utilisés pour les cellules 2D, telles que fluorescents basée sur l’analyse des expériences en regardant19de la prolifération, apoptose et organites subcellulaires taches. En outre, la méthode de collecte et de dissociation décrite ici pourrait être utilisée en vue de la cellule unique RNA séquençage18. Collectivement, cela démontre la possibilité pour une variété de roman, les points de terminaison haute fidélité que les chercheurs peuvent optimiser et explorer à l’avenir.

Organoïdes constituent un outil précieux pour étudier l’organogénèse et la maladie. Ils fournissent une alternative moins chère à des modèles animaux, et dérivé de patient organoïdes évoluent comme une stratégie pour la médecine personnalisée1,2,3. Ce système en trois dimensions (3D) culture consiste à ensemencer les cellules souches ou progénitrices (récoltées dans les tissus ou induite par les cellules souches pluripotentes) dans un gel des composants de la matrice extracellulaire (gel de matrice)4. Les cellules prolifèrent et se différencient, résultant en des structures organotypique qui récapitulent la hiérarchie cellulaire et la morphologie de l’organe de l’unité fonctionnelle de l’intérêt. Organoïdes ont été cultivés à l’aide de cellules provenant d’une variété d’organes, y compris les glandes salivaires, estomac, intestin, foie, prostate, poumon et cerveau4. Bien qu’il existe de nombreux protocoles décrivant les étapes pour mettre en place la prostate organoïdes5,6, il est difficile de trouver des méthodes suffisamment détaillées sur la façon d’obtenir des points de terminaison quantitatives d’organoïdes. Cet article résume les méthodes mises au point pour les cellules de la prostate humains primaires et détaille une série de points de terminaison suggérés d’évaluer les phénotypes organoïde. Ces techniques ont été optimisées pour la prostate organoïdes et peuvent s’appliquer à d’autres cultures cellulaires 3D.
La prostate organoïde cultures ont récemment émergé comme un modèle précieux in vitro qui n’a pas les limitations de l’utilisation des cultures monocouches établi de lignées cellulaires immortalisées. L’épithélium de la prostate et le cancer de la prostate est un défi au modèle in vitro à l’aide de lignées cellulaires immortalisées. Le nombre de lignées cellulaires bénignes est limité, et tous ont subi la transformation avec oncogènes7. Cellules épithéliales de la prostate primaires en monocouches de ne pas se différencier en cellules luminales et n’ont pas de récepteurs aux androgènes8. La majorité des lignées cellulaires de cancer de la prostate n’ont pas de récepteurs aux androgènes fonctionnelle, un médiateur important d’état précoce de la maladie et manque de changements génétiques clés qui ont été retrouvés dans les tumeurs de patients9. La prostate organoïde cultures peuvent être cultivées facilement de l’épithélium bénigne et sont utiles dans l’étude des propriétés de cellules souches, cellules progénitrices, différenciation et les effets des changements expérimentaux dans le microenvironnement4,5. Organoïdes cancer de la prostate peut être cultivé dans le cadre d’une approche de la médecine de précision à la modélisation des maladie patiente et réponse aux thérapies10.
Ce protocole a été compilé à partir des protocoles existants qui utilisent divers types de cellules, mais elle a été ici optimisée pour une utilisation dans les cellules de la prostate primaires humaines. Il complimente protocoles décrits par Soltani, Clevers et Shen5,6 qui décrivent la croissance, passage, imagerie champ lumineux, cryoconservation et isolement ARN et l’ADN de souris la prostate et de l’organoïdes humaine. Le protocole entier-montez est modifié de Mahé et al. 11, qui ont utilisé organoïdes épithéliales gastro-intestinaux et décrit vivre d’imagerie et congelés et enrobage de paraffine. Borten et al. 12 décrit l’analyse du cancer du sein, du côlon et la morphologie organoïde cancer colorectal de lumineux-zone d’imagerie. En outre, Richards et al. 13 une méthode utilisée pour l’évaluation morphologique de la prostate organoïdes. Enfin, Hu et al. 14 décrit une méthode de prostate adhérente organoïdes à une diapositive de chambre pour la nuit avant l’immunofluorescence pour observer les cellules individuelles et dispersion des sphères pour analyse en cytométrie en flux.
Le but du présent protocole est de démontrer de manière suffisamment détaillée ces méthodes techniquement difficiles comme un protocole, y compris l’ensemencement de cellule ; médias et matrice gel entretien ; collection de cellules pour la cytométrie en flux ; ARN, ADN et extraction de la protéine ; évaluation morphologique de l’analyse de lumineux-zone z-pile ; incorporation, traitement et profilés pour coloration histologique ; et tout le montage pour immunofluorescence essais sonde fluorescente. La pertinence biologique et l’interprétation de ces divers paramètres variera entre expérimental et les anticorps utilisés pour l’analyse. Par l’utilisation du présent protocole, les utilisateurs doivent se sentir prêts à mettre en place une expérience avec une boîte à outils des points de terminaison.
Primaire la prostate (GER) des cellules épithéliales humaines furent établies en laboratoire par le protocole décrit par Peehl15,16 et maintenus à un nombre limité de passages (jusqu'à quatre) comme décrit précédemment17, mais ils sont aussi disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Hépatocytes sans sérum axée sur les médias6et axée sur les KSFM13R-spondin 1-conditionné5 médias sont tous publiés comme avoir réalisé avec succès organoïdes. Axée sur la KSFM exige le plus petit nombre d’additifs, donc elle est décrite ici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Cet article décrit un protocole détaillé pour en trois dimensions (3D) culture, manutention et évaluation des humains primaires organoïdes la prostate. Le processus implique l’ensemencement des cellules épithéliales faiblement dans un gel de la matrice 3D sur une microplaque 96 puits avec milieu change de cultiver l’expansion dans organoïdes. Morphologie est ensuite évaluée par puits toute capture d’images de z-pile. Compression de z-cheminées crée une seule image de mise au point d'où organoïdes sont mesurés afin de quantifier les diverses sorties, y compris la circularité, rondeur et la surface. ADN, d’ARN et protéine peuvent être collectées d’organoïdes extraite le gel de la matrice. Les populations de cellules d’intérêt peuvent être évaluées par une dissociation organoïde et cytométrie en flux. Formol-fixation-paraffine-embedding (FFIP) suivie de la section est utilisée pour l’évaluation histologique et anticorps. Entier-Montez la souillure immunofluorescente préserve la morphologie organoïde et facilite l’observation de la localisation de la protéine dans organoïdes in situ. Des essais commerciaux qui sont traditionnellement utilisées pour les cellules de la monocouche 2D peuvent être modifiés pour organoïdes 3D. Utilisés ensemble, les techniques dans ce protocole fournissent une boîte à outils robuste afin de quantifier la prostate organoïde croissance, les caractéristiques morphologiques et l’expression des marqueurs de différenciation.

Sur culture réussie des humains primaires organoïdes la prostate, la morphologie et la différenciation peuvent être évaluées à l’aide d’analyse d’images lumineuses-champ et FFIP et entier-montent des techniques de coloration.
Le processus de capture d’image de lumineux-zone est illustré dans la Figure 1 a. Organoïdes sont cultivés dans une matrice 3D et dispersés sur différents plans focaux. Pour observer l’organoïdes mise au point à travers de nombreux avions, il est suggéré d’utiliser une image d’EDF (Figure 1 b, droite) au lieu d’un seul plan z (Figure 1 b, à gauche). Dans le laboratoire, organoïdes cultivé dans des conditions expérimentales différentes peut entraîner des changements dans la morphologie. À l’aide de la zone, de circularité (défini par l’organoïde comment semblable est à un cercle) et de rayon max/min (mesure de longueur) donner aux utilisateurs une indication de la forme et taille organoïde et fournir une lecture quantifiable de morphologie. Pour souligner l’utilité de ces mesures, images représentatives d’organoïdes avec une zone similaire mais différente morphologie sont indiquées dans la Figure 1, dans lequel une longue organoïde sera moins circulaires et ont un rapport plus élevé de maximale/minimale qu’un sphérique organoïde.
L’incorporation d’organoïdes pour histologie est un point de terminaison utile d’observer l’intérieur des échantillons et de veiller à ce que la nécrose n’est pas présente dans le noyau d’un organoïde. Un "workflow" pour ce processus et les résultats représentatifs des échantillons incolores, sectionnées sous un microscope lumineux-zone sont fournis dans la Figure 2 aB, C. Figure 3 a montre un organoïde manipulés sans précaution (à gauche) par rapport à correctement remis organoïdes dans la Figure 3 a (à droite) et la Figure 3 b. Pour déterminer l’état de différenciation de l’échantillon, il est recommandé de regarder de marqueurs (cytokératine 5 et p63) carcinome Baso-cellulaire8 ainsi que de cellules luminales marqueurs (cytokératine 8)8. Si on désire colorer organoïdes in situ, entier-Montez la coloration est une alternative pratique, et ces résultats représentatifs sont fournis dans la Figure 3D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figure 1 : évaluation de la morphologie des organoïdes dans la culture 3D. (A) flux de collecte et la compression d’images pour humains primaires organoïdes la prostate acquis par une lumière transmise microscope avec un motorisé inversé X / Y, stade et compagnon logiciel de numérisation. (B) les images représentatives d’une seule pile-z (gauche) vs. une image de l’EDF (à droite) d’un échantillon de tout puits d’humain organoïdes primaire de la prostate, montrant que plus organoïdes sont en discussion lorsque z-piles multiples sont combinées en une seule image projetée (barre d’échelle = 1000 µm). (C) des images représentatives rapport surface, circularité et max/min : morphologiquement dissemblables humains primaires organoïdes la prostate qui ont la même zone (barre d’échelle = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figure 2 : Organoïde intégration de flux de travail et représentant de la section résultats. (A) humaine organoïde la prostate primaire intégrant des flux de travail. (B) une image représentative d’une diapositive non colorée, fraîche contenant des humains primaires organoïdes la prostate sous un microscope lumineux zone représentant agar (flèche verte), gel de l’histologie (flèche noire), bulle (flèche bleue), organoids (flèches rouges) (section Echelle = 1000 µ m). (C) non souillées enregistré diapositive fraîchement coupées (à gauche) vs. diapositive sec sans coloration (à droite), organoids (flèches rouges) apparaissent translucides une fois sec (section Echelle = 500 µm) et sont plus difficiles à discerner au microscope lumineux-zone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figure 3 : coloration histologique sur organoïdes sectionnés et montés ensemble. (A) une coloration H & E d’un cassé organoïde la prostate humaine de primaire de mauvaise manipulation (pipetage agressif, protocole de mauvais traitement, gauche) à côté d’un organoïde bien gérée (à droite) (section Echelle = 100 µm). (B) humaine organoïde la prostate primaire qui ont été fixés au formol, paraffine, sectionnées et tachée de basale cytokératine 5 ou Luminale cytokératine 8 (en haut) ou basale p63 et luminal cytokératine 8 (en bas) et imagés avec (microscope confocal Echelle = 100 µm). (C) un organoïde la prostate primaire humain montés ensemble tachée de basale cytokératine 5 ou Luminale cytokératine 8 et eosine phalloïdine et DAPI, photographié au microscope confocal (barre d’échelle = 100 µm). (D) un organoïde montés ensemble humain cellules prostatiques primaires coloré avec fluorescent étiqueté EdU et compteur tachée de Hoescht, photographié au microscope confocal (barre d’échelle = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Les organoïdes de la prostate sont un système in vitro passionnant pour étudier le développement et la maladie. Ils surmontent les défis des lignées cellulaires immortalisées et offrent une alternative peu coûteuse aux modèles animaux. Ils peuvent être cultivés à partir de cellules de la prostate humaine, comme nous l’avons montré dans ce protocole, ainsi que les cellules de la prostate de souris, comme un système de modèle préclinique pertinent pour la maladie.De nombreux laboratoires ont décrit des méthodes de culture et des critères d’évaluation utiles. Mais nous espérons réunir ces détails dans un protocole et démontrer les étapes particulièrement difficiles pour les nouveaux utilisateurs. Au fur et à mesure que les techniques s’améliorent, les organoïdes du cancer de la prostate peuvent être cultivés à partir d’échantillons de patients comme approche de la médecine de précision pour modéliser la maladie et la réponse aux thérapies.Les conditions de culture sont spécifiques aux organoïdes de la prostate, mais beaucoup de critères d’évaluation ont été adaptés à partir d’autres types de tissus. Un utilisateur peut adapter des parties de ce protocole à son type d’intérêt cellulaire. Commencez cette expérience en cultivant des cellules épithéliales dans des plaques matricielles codées en gel de 96 puits telles que décrites dans le manuscrit.Pour recueillir les organoïdes dans les assiettes après 12 jours, retirer le milieu des puits sans perturber le gel matricielle. Ajoutez immédiatement environ 200 microlitres de protéase neutre à chaque puits à environ un rapport d’un à deux gel matriciel à la protéase neutre. Incuber la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Puis pipette de haut en bas pour dissocier mécaniquement le mélange, et incuber à nouveau pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, transférer le mélange gel-cellule de matrice de protéase neutre de quelques puits à un tube de microcentrifugeuse. Pelleter les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant trois à cinq minutes.Retirez le supernatant et enregistrez la pastille organoïde pour des analyses ultérieures. Pour créer des moules pour l’intégration, découpez une petite section d’une pointe de pipette de 1000 microlitres pour faire un cylindre qui contient 50 microlitres. Puis de la partie la plus large de la même pointe, faire un deuxième moule plus large qui s’adapte autour du premier moule.Pour créer un bloc froid, enveloppez un sac de glace avec du ruban adhésif vers le haut. Ensuite, adhérer les moules perpendiculairement à la bande. Pour intégrer les organoïdes dans une fiche de gel d’histologie pour le traitement, lavez d’abord la pastille organoïde précédemment obtenue avec un millilitre de solution de sel équilibré de Hank.Après avoir centrifugé à 300 fois g pendant trois à cinq minutes, retirer le surnatant. Ajouter ensuite 30 à 50 microlitres de gel d’histologie liquide à la pastille organoïde, et mélanger doucement en pipetting lentement de haut en bas pour résuspendre la pastille. Transférer ce mélange dans un moule sur le bloc froid, et permettre à l’échantillon de refroidir et de solidifier dans un bouchon.Ensuite, utilisez un piston pour pousser la fiche hors du petit moule et dans le centre du moule plus grand, et le remplir en pipetting clair 2% agar autour de la fiche. Pour marquer le dessus de l’échantillon, pipette histologique teintée de colorant 2% agar sur le dessus de la fiche. Une fois l’agar refroidi, utilisez un piston pour transférer la fiche dans une cassette d’histologie.Étiquetez la cassette avec un crayon et placez-la dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pour la fixation pendant la nuit. Le lendemain, transférez la cassette de la formaline tamponnée neutre à 70 % d’éthanol de qualité histologique, et la traiter davantage et l’intégrer dans la paraffine. Commencez par couper la base du bloc à une épaisseur de 10 micromètres.Une fois qu’une section contenant la zone de prise apparaît, arrêtez de tailler. Verrouillez le rotor de microtome et transférez le bloc sur la glace pour le refroidir. Déplacez la lame vers une nouvelle portion inutilisée.Et transférez le bloc à la pince. Déverrouillez la machine et commencez à tailler à cinq micromètres par section. Utilisez une pince à épiler pour transférer la section au bain d’eau de 40 degrés Celsius et laissez-la s’étendre.Trempez une glissière verticalement dans l’eau pour transférer la section sur elle. Observez ensuite la diapositive sous un microscope à champ lumineux pour vous assurer qu’un organoïde est présent dans la section. Cuire au four toute la nuit à 45 à 50 degrés Celsius, puis procéder à la coloration comme décrit dans le manuscrit.Commencez cette partie de l’expérience avec des puits inutilisés de la plaque enrobée de gel matricielle de 96 puits avec organoïdes. En pipetant contre le côté du puits, en laissant de l’espace entre les médias et le gel matriciel, retirez soigneusement autant de supports que possible sans perturber la culture organoïde. Utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres, pré-humide avec PBS pour dessiner une goutte de gel matricielle qui contient les organoïdes d’intérêt.Distribuez la goutte au milieu d’une glissière de chambre. À l’œil nu, aspirer l’excès de liquide multimédia et matriciel de la glissière de chambre à l’aide d’une pipette à pointe fine. Promouvoir l’adhérence organoïde au verre et prévenir la perte d’échantillons lors des étapes de lavage subséquentes.Placez la glissade dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Pipetage lentement pour empêcher le détachement du plat, ajouter 200 microlitres de 1X PBS pour laver les organoïdes pendant cinq minutes à température ambiante avec des secousses douces. Retirez soigneusement le 1X PBS et ajoutez 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde.Fixer pendant 30 minutes à température ambiante avec des secousses douces. À la PFA, lavez et procédez aux étapes subséquentes de perméabilisation et de coloration décrites par ce protocole. Montage et image immédiatement.La diapositive fraîchement coupée non tachée montre clairement les organoïdes primaires humains de prostate, alors que dans la glissière sèche non tachée, les organoïdes semblent translucides et sont plus difficiles à détecter sous un microscope lumineux de champ. La coloration d’hématoxyline et d’éosine montre un organoïde primaire cassé de prostate humain de la mauvaise manipulation, tel que le pipetting agressif, le protocole erroné de traitement comparé à un organoïde bien manipulé. L’organoïde primaire humain de prostate était formalin-fixe, paraffin-incorporé, sectionné, et souillé avec la cytokératine basale 5 et la cytokératine luminale 8, p63 basal et cytokeratin luminal 8, et imaged avec le microscope confocal.Un organoïde primaire entier de prostate humain a été souillé avec la cytokeratine basale 5 ou la cytokératine luminale 8, et contre-taché avec la phalloidin et le DAPI, et photographié avec le microscope confocal. Un organoïde primaire de cellules de prostate humain entier-monté a été souillé avec l’Edu fluorescent-étiqueté et contre-taché avec Hoescht, et imité avec le microscope confocal. Il est important de visualiser vos organoïdes tout au long de la procédure.Après avoir recueilli les sections, assurez-vous de visualiser les échantillons sur la diapositive, et assurez-vous d’observer les organoïdes pendant le montage entier. Après avoir recueilli les organoïdes du gel matriciel, vous pouvez les monter et utiliser des analyses commerciales, ou se dissocier à des cellules simples pour la cytométrie du flux ou le séquençage à cellules simples. La culture 3D offre aux chercheurs une nouvelle façon d’étudier les tissus dans le cadre d’un plat de laboratoire.Il peut être appliqué à l’organogenèse, ou à la compréhension de la pathologie de la maladie d’un patient. Lorsque vous travaillez avec des échantillons de patients, faites toujours preuve de prudence et manipulez les matériaux comme étant potentiellement exposés à des agents pathogènes transmissibles par le sang.

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A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...