Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
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Wir danken der UIC Biorespository Mitglieder, Dr. Klara Valyi-Nagy und Alex Susma, sowie den Urologen DRS. Michael Abern, Daniel Moreira und Simone Crivallero, zur Erleichterung der Gewebe-Erwerb für den primären Zellkulturen. Wir danken der UIC-Urologie-Patienten für die Spende von ihr Gewebe zu erforschen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Abteilung der Verteidigung Prostata Krebs Forschung Programm Gesundheit Disparitäten Idee Award PC121923 (Nonn) und das UIC-Zentrum für klinische und Pre-doctoral Wissenschaftsbildung Übersetzung für klinische und translationale Wissenschaftler (finanziert ENTIERT) Programm (McCray und Richards) und durch die National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant-Nummern U54CA202995, U54CA202997 und U54CA203000, bekannt als die Chicago Gesundheits-Equity Collaborative (Nonn und Richards). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder das Department of Defense.

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	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Organotypischen Kultur ist eine spannende neue Methode zur Rekapitulation Gewebe mit dem Komfort einer in-vitro- Umgebung. Derzeit wachsen Labs Organellen aus vielen Arten von Geweben für verschiedene Endpunkte. In diesem Artikel beschriebenen Methoden nützlich Endpunkte zusammenfassen und neue Techniken zur Charakterisierung von vollständig 3D primäre Prostata Zellkulturen zu markieren.
Es gibt eine Vielzahl von Medien-Rezepten für den Anbau von menschlichen primäre Vorsteherdrüse-Zelle Organellen5,6,13. Während alle lebensfähigen und vergleichbare Ergebnisse erzielen, nutzt KSFM-basierte Medien13 minimale Zusatzstoffe so es beschrieben ist hier. Darüber hinaus wurden Papiere mit mehreren Konzentrationen für Matrix-Gel von 10 % bis 75 % auf Kultur Prostata Organellen5,6,13veröffentlicht. Da Matrix Gel eine teure Reagenzien ist und 33 % Matrix Gel gezeigt hat, dass ausreichen, um langfristige (2-3 Wochen), kultivieren lebensfähig, unclumped Organellen13, dies ist die empfohlene Konzentration. Matrix-Gel kann jedoch variieren in Proteinkonzentration zwischen Chargennummern versehen, so dass dies bei Beschichtung berücksichtigt werden sollten. Es wird auch empfohlen, Matrix-Gel in großen Mengen für den Einsatz über mehrere Experimente Inkonsistenz zwischen viel zu kaufen. Anderen Labors haben verschiedene Formate für Matrix-Gel, wie Tropfen statt einer 96-Well-Platte gut5Beschichtung Beschichtung veröffentlicht. Beide Methoden bilden tragfähige Organellen, aber das hier beschriebene Format ermöglicht Zellen mehr dünn überzogen werden, gezeigt worden, um die Expansion der Zellen in größeren Organellen13zu fördern. Jedoch sollten Dichte Beschichtung optimiert werden aus Patienten-spezifischen Bildung Effizienz basiert. Matrix-Gel gibt es in vielen Formaten einschließlich Wachstumsfaktor reduziert, Phenol Red-frei, hohe Konzentration, etc.. Wachstumsfaktor-reduzierte empfiehlt sich für Kulturbedingungen definierten und Phenol Rotfrei empfiehlt sich beim Arbeiten mit Zellen, die GFP ausdrücken oder bei Experimenten, bei denen Z-Stapel-Bilderfassung. Es ist wichtig, dass jede Matrix Gel Überzug Schritte mit eiskalten Reagenzien durchgeführt werden, wie Matrix-Gel bei Raumtemperatur schnell erstarrt.
Organellen, die unter verschiedenen experimentellen Behandlungen gewachsen können führen Änderungen in Form, also Hellfeld Bildgebung am meisten benutzt ist, beobachteten morphologische Phänotypen zu studieren. Erfassung und Quantifizierung der Fläche oder Form ist jedoch eine Herausforderung aus zwei Gründen: 1) Vorwählervorspannung während der Bildaufnahme und (2) ein dreidimensionales Muster einen zweidimensionalen Parameter z. B. Bereich zuweisen. Eine Strategie der Bilderfassung ist ein zufälliges Feld erfassen und Messen eine vorbestimmte Anzahl von Organellen in diesem Bereich, aber kann dadurch Verzerrungen bei der Auswahl und alle Organellen in das ausgewählte Feld möglicherweise nicht im Fokus. Ganz gut Bildgebung für die Mikrotestplatte 96-Well-Format optimiert beseitigt diese Probenahme Vorspannung durch das Sammeln der gesamten organoide Bevölkerung von Interesse. Jedoch können je nach Mikroskop auf der Seite, mehrere Felder müssen gesammelt und gefliest um ein Bild ganz gut zu erhalten. Einige Labors haben Messbereich von einer einzigen Z-Plane12beschrieben, aber es empfiehlt sich alle Organellen im Fokus zu erfassen, zu sammeln und Stapeln von mehreren Ebenen in einem einzigen EDF-Bild13. In einigen Fällen ein Meniskus in der Matrix-Gel verursachen Vignettierung in das Bild und Hintergrund Korrekturmethoden müssen möglicherweise mithilfe von Bildanalyse-Software angewendet werden. Exakte Volumen ist im Idealfall das am besten geeignete Maß für organoide Größe; Dies ist jedoch schwierig, genau zu erhalten, sogar mit mehreren Z-Stapel-Bildern. Andere nützlichen morphologische Dimensionen wie Zirkularität und maximal/minimal-Verhältnis, können leicht aus der Organellen in einem ganz gut EDF Bild berechnet werden. Zusammen, diese Methoden sampling Bias Herausforderungen überwinden und ermöglichen die Messung von 2D 3D Objekte im 3D-Raum.
Formalin Fixierung und Paraffin Einbetten von Organellen ist eine gängige Methode, Hämatoxylin und Eosin (H & E), immunhistochemische (IHC) und immunofluorescent (IF) Färbung für Visualisierung und Analyse6,11, zu erhalten 20. Publikationen, die diese Technik beschrieben sind allerdings umfassende Informationen zum Einbetten von Prozess. Darüber hinaus kann die Ortung Organellen innerhalb der Paraffinblock schwierig sein. In einigen Übungseinheiten vor Fleck Organellen mit Trypan blau vor dem Einbetten um in Lage zu helfen, während11-Schnitt. Die hier beschriebene Methode beinhaltet die Verwendung einer histologischen Färbung zur Orientierung der organoide/Histologie Gelplug während der Einbettung zur Förderung der Effizienz der schneiden. H & E Folien erleichtern Prüfung der Nekrose, atomare Struktur und Verbreitung, und so sollte es eine verbindliche Endpunkt für organoide Kultur um sicherzustellen, dass die Zellen im gesamten Bereich gesund sind. Eine Stärke des organoide Kultur ist, dass Proben eine heterogene Mischung aus Zellen bestehen, die besser in Vivo Patienten Gewebe ähneln. In der Prostata sind z. B. basale und luminalen Zellen in Prostata Organellen5, während Zellen in 2D fehlen luminalen Differenzierung8gewachsen. Um organoide Differenzierung zu beurteilen, empfiehlt es sich, dass Forscher basalen Marker wie CK5 und p63 und luminalen Marker wie Androgen-Rezeptoren und CK88bewerten. Interessierender experimentelle Proteine können auch mit diesen befleckenden Techniken untersucht werden.
Obwohl FFPE Abschnitte Visualisierung von Zellen mit Wohnsitz in Innenfach über histologische Methoden (H & E, IF, IHC) ermöglichen, Bilder beschränken sich auf Querschnitten und organoide Form kann durch die Einbettung Prozess verändert werden. Vollständig-hängen Färbung ermöglicht eine organoide eingefärbt und in Situ, Erhaltung der morphologische Phänotypen und schönem Bilder von Protein Lokalisierung beobachtet. Gesamte Montage ist ein Werkzeug verwendet, um ganze Gewebe oder ganze Tier Exemplare, wie dem Zebrafisch oder Maus Embryo, färben und Organellen leicht angepasst. Die hier beschriebene Technik wurde von MahéEt Al. von der Prozedur geändert. 11, die details der ursprünglichen Wachstum und Kultur des Magen-Darm-Organellen direkt auf einer Kammer-Folie zum Beizen und Fixierung der gesamte übergeordnete Kultur erfordert. Die hier beschriebene Methode beinhaltet die Übertragung eines einzigen organoide (oder Organellen) von Interesse in eine Kammer-Folie zum Zeitpunkt der Färbung. Dies ermöglicht die Auswahl der einzelnen Organellen für die gesamte-Mount Analyse in ein laufendes Experiment ohne Fixierung der übergeordnete Kultur. Bei der Durchführung ganz-Mount Färbung, es ist notwendig, Optimierung Permeabilisierung und die Inkubationszeit für primäre und sekundäre Antikörper gegen Eindringen während der Probe zu gewährleisten (überall von einem oder mehreren Tagen wird empfohlen). Sobald über konfokalen Mikroskopie abgebildet, können 3D-Renderings hergestellt werden, um zu ermöglichen, Visualisierung und Lokalisierung eines spezifischen Proteins und berechnen Sie die Anzahl der positiv gefärbten Zellen in einer Probe vorhanden. Durchflusszytometrie ist eine nützliche Endpunkt Populationen von basalen, luminalen quantifizieren oder Stammzellen-5,14. Um dies zu tun, sind Zellen erholt aus dem Matrix-Gel und sanft zum Beizen dissoziiert. Benutzer sollten entsprechende Markierungen für die Trennung anhand der aktuellen Literatur sorgfältig wählen. Für menschliche primäre epitheliale Zellen der Prostata sind CD26 und CD49f geeignete luminalen und basalen Marker, bzw.5,21.
Zusammenfassend lässt sich sagen details dieses Protokolls menschliche primäre Prostata organoide Wachstum, Sammlung und experimentelle Endpunkte. Der Hinweis kann die Montage-Technik beschrieben zu einer Vielzahl von anderen Assays angewandt werden, die normalerweise für 2D Zellen, wie z. B. fluoreszierende Testbasierte Experimente betrachten Verbreitung19, Apoptose und subzelluläre Organelle Flecken eingesetzt werden. Darüber hinaus könnten die hier beschriebene Erhebung und Dissoziation Methode in Vorbereitung auf die einzelne Zelle RNA Sequenzierung18genutzt werden. Kollektiv, zeigt dies die Möglichkeit für eine Vielzahl von Roman, High-Fidelity-Endpunkte, die Forscher optimieren und in der Zukunft erkunden können.

Organellen sind ein wertvolles Instrument zur Organogenese und Krankheit zu studieren. Sie bieten eine preiswertere Alternative zu Tierversuchen und Patienten-abgeleitete Organellen sind als Strategie zur personalisierten Medizin1,2,3entwickelt. Dieses dreidimensionale (3D) Kultursystem umfasst zu einem Gel der extrazellulären Matrix Komponenten (Matrix Gel)4Aussaat Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (geerntet aus Gewebe oder induzierte pluripotente Stammzellen). Die Zellen vermehren und zu differenzieren, was zu organotypischen Strukturen, die die zellulären Hierarchie und Morphologie der Orgel von Interesse der Funktionseinheit zu rekapitulieren. Organellen sind mit Zellen aus verschiedenen Organen, einschließlich der Speicheldrüse, Magen, Darm, Leber, Prostata, Lunge und Gehirn4gewachsen worden. Zwar gibt es zahlreiche Protokolle beschreibt Schritte, um Prostata Organellen5,6herzustellen, ist es schwierig, ausreichend detaillierte Methoden zu finden, wie quantitative Endpunkte von Organellen zu erreichen. Dieses Dokument fasst Methoden für menschliche primäre Prostata-Zellen entwickelt und beschreibt eine Reihe von vorgeschlagenen Endpunkte die organoide Phänotypen zu beurteilen. Diese Techniken wurden optimiert für Prostata Organellen und können für andere 3D Zellkulturen gelten.
Prostata organoide Kulturen sind vor kurzem entstanden, als ein wertvollen in-vitro- Modell, das die Grenzen der Monolayer-Kulturen mit fehlt immortalisierte Zelllinien etabliert. Gutartige Prostata Epithel und Prostatakrebs ist herausfordernd, Modell in Vitro mit immortalisierte Zelllinien. Die Anzahl der gutartigen Zelllinien ist begrenzt, und alle haben Transformation mit Onkogene7unterzogen. Primäre epitheliale Zellen der Prostate in Monolagen luminalen Zellen differenzieren und Androgen-Rezeptoren8fehlt nicht. Die Mehrheit der Prostatakrebs-Zelllinien muss keinen funktionalen Androgen-Rezeptoren, eine bedeutende Vermittler der frühen Krankheitsstadium und fehlen wichtige genetische Veränderungen, die im Patienten Tumoren9gefunden wurden. Prostata organoide Kulturen von gutartige Epithel leicht angebaut werden können und sind wertvolle im Studium Stammzellen Eigenschaften, Vorläuferzellen, Differenzierung und Auswirkungen von Änderungen in der Mikroumgebung4,5. Prostatakrebs Organellen können als Bestandteil einer Präzisionsanflug Medizin zur Modellierung Patienten Krankheit und Reaktion auf Therapien10angebaut werden.
Dieses Protokoll wurde von bestehenden Protokolle, mit denen verschiedene Zelltypen zusammengestellt, aber es wurde hier für den Einsatz in primären menschlichen Prostata-Zellen optimiert. Es Komplimente Protokolle von Holzfällern, Clevers und Shen skizziert5,6 , die Wachstum, Passagierung Hellfeld Bildgebung, Kryokonservierung und RNA und DNA-Isolierung der Prostata Maus und menschlichen Organellen zu beschreiben. Das ganze-Mount-Protokoll wird von Mahé Et Al. geändert. 11, die Magen-Darm-epitheliale Organellen verwendet und beschreibt live imaging und gefrorenen und paraffin einbetten. Borten Et al. 12 beschriebenen Analyse der Brust-, Darm und Darmkrebs organoide Morphologie von Hellfeld Imaging. Darüber hinaus Richards Et Al. 13 verwendet eine Methode für die morphologische Beurteilung der Prostata Organellen. Zu guter Letzt Hu Et al. 14 beschrieb eine Methode von anhaftenden Prostata Organellen zu einer Kammer-Folie über Nacht vor der immunofluorescent Färbung Einzelzellen und Streuung der Kugeln für Flow-Zytometrie-Analyse zu beobachten.
Das Ziel dieses Protokolls ist ausreichend detailliert diese technisch anspruchsvollen Methoden als ein Protokoll, einschließlich der Zelle Aussaat nachweisen; Medien und Matrix gel Wartung; Auflistung von Zellen für Durchflusszytometrie; RNA, DNA und Protein Extraktion; morphologische Beurteilung von Hellfeld Z-Stapel-Analyse; einbetten, Verarbeitung und Schnitt für histologische Färbung; und ganz-Halterung für Immunfluoreszenz oder fluoreszierende Sonde Assays. Die biologische Bedeutung und Interpretation dieser verschiedenen Endpunkte variiert unter den Versuchsplan und Antikörper, die für die Analyse verwendet. Durch Nutzung dieses Protokolls sollten Benutzer einrichten, ein Experiment mit einem Toolkit von Endpunkten vorbereitet.
Menschliche primäre Prostate (PrE) Epithelzellen entstanden im Labor durch das Protokoll von Peehl15,16 beschrieben und beibehalten, um eine begrenzte Anzahl von Passagen (bis zu vier) als zuvor beschriebenen17, aber sie sind auch von kommerziellen Anbietern erhältlich. Hepatozyten serumfreie Medien basierende6, KSFM-basierte13und R-Spondin 1-konditionierte5 Medien sind alle veröffentlichten als Organellen erfolgreich produziert. KSFM-basierte erfordert die geringste Anzahl von Zusatzstoffen, so dass es hier beschrieben wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll für dreidimensionale (3D) Kultivierung, Handhabung und Auswertung des menschlichen primäre Prostata Organellen. Der Prozess umfasst Aussaat von Epithelzellen dünn in eine 3D Matrix Gel auf einer 96-Well-Mikrotestplatte mit Medien Änderungen an Expansion in Organellen zu kultivieren. Morphologie ist dann durch die ganze gut Erfassung von Z-Stapel Bilder bewertet. Kompression des Z-Stacks erstellt ein Einzelbild im Fokus aus dem Organellen gemessen werden, um eine Vielzahl von Ausgaben, einschließlich der Zirkularität, Rundheit und Umgebung zu quantifizieren. DNA, RNA und Proteine können von Organellen erholt aus dem Matrix-Gel gesammelt werden. Zell-Populationen von Interesse durch organoide Dissoziation beurteilt werden können und flow Cytometry. Formalin-Fixierung-Paraffin-Einbettung (FFPE) gefolgt von schneiden die histologische Bewertung und Antikörper Färbung dient. Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung erhält organoide Morphologie und erleichtert die Beobachtung von Protein-Lokalisierung in Organellen in Situ. Kommerziellen Assays, die traditionell für 2D Monolage Zellen verwendet werden können für 3D Organellen geändert werden. Zusammen verwendet werden, bieten die Techniken in diesem Protokoll eine robuste Toolbox um Prostata organoide Wachstum, morphologische Merkmale und Ausdruck der Differenzierung Marker zu quantifizieren.

Nach erfolgreichen Kultur der menschlichen primäre Prostata Organellen können Morphologie und Differenzierung mit Hellfeld Bildanalyse und Proteinkinase und vollständig-hängen befleckenden Techniken bewertet.
Der Prozess der Hellfeld Bilderfassung ist in Figur 1Adargestellt. Organellen in einer 3D Matrix angebaut und über verschiedene Schwerpunkte Flugzeuge verstreut. Um Organellen im Fokus über viele Flugzeuge zu beobachten, wird vorgeschlagen, um ein EDF-Bild (Abbildung 1 b, rechts) anstelle einer Z-Ebene (Abbildung 1 b, links) zu verwenden. Im Labor führen Änderungen in der Morphologie Organellen, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen angebaut. Mit Bereich, Rundheit (definiert durch wie die organoide zu einem Kreis ähnelt) und Max/min Radius (Maß für die Länge) Benutzer einen Hinweis auf organoide Größe und Form geben und bieten eine quantifizierbare Auslesen der Morphologie. Um den Nutzen dieser Maßnahmen zu unterstreichen, sind repräsentative Bilder von Organellen mit ähnlichen Bereich aber unterschiedliche Morphologie in Abbildung 1, gezeigt, in denen eine lange organoide werden weniger kreisförmig und haben eine größere maximal/minimal-Verhältnis als eine sphärische organoide.
Einbetten von Organellen für Histologie ist ein nützliche Endpunkt das Innere der Proben zu beobachten und sicherstellen, dass die Nekrose nicht im Kern eine organoide vorhanden ist. Ein Workflow für diesen Prozess und repräsentative Ergebnisse der ungefärbten, geschnittenen Proben unter dem Hellfeld Mikroskop sind gemäß Abbildung 2AB, C. Abbildung 3A zeigt ein fehlgeleitetes organoide (links) im Vergleich zu richtig Organellen in Abbildung 3A (rechts) und Abbildung 3 bübergeben. Um die Differenzierung-Zustand der Probe zu bestimmen, empfiehlt es sich, Basalzell-Marker (Cytokeratin 5 und p63)8 zusammen mit der luminalen Zelle Marker (Cytokeratin 8)8anschauen. Wenn es gewünscht ist, Organellen Fleck in Situ, ganze-Mount-Färbung ist eine bequeme Alternative, und diese repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3D. zur Verfügung gestellt
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Beurteilung der Morphologie der Organellen in 3D Culture. (A) Bild Sammlung und Kompression Workflow für menschliche primäre Prostata Organellen erworben durch eine Durchlicht-Mikroskop mit einem motorisierten invertiert X / Y Scansoftware Bühne und Begleiter. (B) repräsentative Bilder von einem Z-Stapel (links) Vs. ein EDF-Bild (rechts) einer Probe ganz gut der menschlichen primäre Prostata Organellen, zeigen, dass mehr Organellen im Mittelpunkt stehen, wenn mehrere Z-Stapel zu einem projizierten Bild kombiniert werden (Maßstabsleiste = 1000 µm). (C) repräsentative Bilder Bereich, Rundheit und Max/min-Verhältnis von morphologisch unterschiedliche menschliche primäre Prostata Organellen, die der gleichen Gegend haben (Maßstabsleiste = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Abbildung 2: organoide einbetten, Workflow und Vertreter Ergebnisse-Schnitt. (A) menschliche primäre Prostata organoide Einbettung Workflow. (B) repräsentatives Bild einer ungefärbten, frische Folie mit menschlichen primäre Prostata Organellen unter dem Hellfeld-Mikroskop Darstellung Agar (grüner Pfeil), Histologie Gel (schwarzer Pfeil), Blase (blauer Pfeil), Organellen (rote Pfeile) (Maßstabsleiste = 1000 µ (m). (C) unbefleckt frisch geschnittene Folie (links) Vs. ungefärbten trocken Folie (rechts), Organellen (rote Pfeile) erscheinen durchscheinenden, trockenem (Maßstabsleiste = 500 µm) und sind schwerer zu erkennen, unter dem Hellfeld Mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Abbildung 3: histologische Färbung auf geschnitten und ganze montierte Organellen. (A) H & E Färbung von einer gebrochenen menschlichen primäre Prostata organoide von Misshandlung (aggressive pipettieren, falsche Handgriffe Protokoll, links) neben einem gut verarbeiteten organoide (rechts) (Maßstabsleiste = 100 µm). (B) menschliche primäre Prostata organoide, das Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten, geschnitten, gefärbt mit basalen Cytokeratin 5 oder luminalen Cytokeratin 8 (oben) oder basalen p63 und luminalen Cytokeratin 8 (unten) und mit confocal Mikroskop (abgebildet Maßstabsleiste = 100 µm). (C) eine ganze montierte menschliche primäre Prostata organoide mit basalen Cytokeratin 5 oder luminalen Cytokeratin 8 befleckt und counterstained mit Phalloidin und DAPI, abgebildet mit confocal Mikroskop (Maßstabsleiste = 100 µm). (D) eine ganze montierte menschliche primäre Prostata Zelle organoide gebeizt mit Gewebekulturen beschriftet EdU und Zähler mit Hoechst, abgebildet mit confocal Mikroskop befleckt (Maßstabsleiste = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um menschliche primäre Prostata organoide Handhabung führen dann empfehle Endpunkte zur Beurteilung der Phänotyp. Aussaat, Kultur Wartung, Wiederherstellung von Matrix Gel sind morphologische Quantifizierung, einbetten und schneiden, FFPE-Schnitt, ganz-Mount Färbung und Anwendung von kommerziellen Assays bezeichnet.

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostata-Organoide sind ein spannendes In-vitro-System zur Untersuchung von Entwicklung und Krankheit. Sie meistern Herausforderungen verewigter Zelllinien und bieten eine kostengünstige Alternative zu Tiermodellen. Sie können aus menschlichen Prostatazellen, wie wir in diesem Protokoll gezeigt haben, sowie Ausmaus-Prostatazellen als krankheitsrelevantes präklinisches Modellsystem angebaut werden.Viele Übungseinheiten haben nützliche Kulturmethoden und Endpunkte beschrieben. Aber wir hoffen, diese Details in einem Protokoll zusammenzuführen und die besonders herausfordernden Schritte für neue Benutzer aufzuzeigen. Wenn sich die Techniken verbessern, können Prostatakrebs-Organoide aus Patientenproben als präzisionsmedizinischer Ansatz zur Modellierung von Krankheiten und zur Reaktion auf Therapien angebaut werden.Die Kulturbedingungen sind spezifisch für Prostata-Organoide, aber viele der Endpunkte wurden von anderen Gewebetypen angepasst. Ein Benutzer kann Teile dieses Protokolls an seinen Zelltyp anpassen. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie Epithelzellen in Matrix-Gel-kodierten 96-Well-Platten anbauen, wie im Manuskript beschrieben.Um Organoide nach 12 Tagen von den Platten zu sammeln, entfernen Sie Medium aus den Brunnen, ohne das Matrixgel zu stören. Dann fügen Sie sofort ca. 200 Mikroliter neutrale Protease zu jedem Brunnen bei etwa einem Ein-zu-zwei-Verhältnis von Matrix-Gel zu neutraler Protease hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.Dann Pipette auf und ab, um die Mischung mechanisch zu dissoziieren, und wieder für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Nach der Inkubation die neutrale Proteasematrix-Gelzellmischung aus wenigen Brunnen in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 mal g für drei bis fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand, und speichern Sie das Organoidpellet für nachfolgende Analysen. Um Formen zum Einbetten zu erstellen, schneiden Sie einen kleinen Abschnitt einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze aus, um einen Zylinder herzustellen, der 50 Mikroliter fasst. Dann aus dem breiteren Teil der gleichen Spitze, machen eine zweite breitere Form, die um die erste Form passt.Um einen kalten Block zu erstellen, wickeln Sie eine Eispackung mit Klebeband mit der Klebeseite nach oben. Dann die Formen senkrecht auf das Band kleben. Um die Organoide zur Verarbeitung in einen Histologie-Gel-Stecker einzubetten, waschen Sie zunächst das zuvor erhaltene Organoidpellet mit einem Milliliter Hanks Balanced Salt Solution.Nach der Zentrifugierung bei 300 mal g für drei bis fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter flüssiges Histologie-Gel in das Organoid-Pellet und mischen Sie sanft, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen, um das Pellet wieder aufzuhängen. Diese Mischung in eine Form auf dem kalten Block geben und die Probe abkühlen lassen und in einen Stecker verfestigen.Als nächstes verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker aus der kleinen Form in die Mitte der größeren Form zu schieben, und füllen Sie ihn, indem Sie klare 2%Agar um den Stecker herum pfeifen. Um die Oberseite der Probe zu markieren, Pipette histologic gefärbt 2%Agar auf dem Stecker. Sobald der Agar abgekühlt ist, verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker in eine Histologiekassette zu übertragen.Beschriften Sie die Kassette mit einem Bleistift und legen Sie sie zur nächtlichen Fixierung in 10% neutral gepuffertes Formalin. Am nächsten Tag die Kassette von 10% neutral gepuffertem Formalin auf 70% histologisches Ethanol übertragen und weiter verarbeiten und in Paraffin einbetten. Beginnen Sie mit dem Trimmen der Basis des Blocks bei einer Dicke von 10 Mikrometern.Sobald ein Abschnitt angezeigt wird, der den Steckerbereich enthält, beenden Sie das Trimmen. Verriegeln Sie den Mikrotom-Rotor und übertragen Sie den Block zurück auf das Eis, um zu kühlen. Verschieben Sie das Blatt in einen neuen, nicht verwendeten Teil.Und den Block zurück auf die Klemme übertragen. Entsperren Sie die Maschine und beginnen Sie mit dem Trimmen von fünf Mikrometern pro Abschnitt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Abschnitt in das 40-Grad-Wasserbad Celsius zu übertragen und sich ausbreiten zu lassen.Tauchen Sie eine Rutsche vertikal in das Wasser, um den Abschnitt darauf zu übertragen. Beobachten Sie dann das Dia unter einem hellen Feldmikroskop, um sicherzustellen, dass ein Organoid in dem Abschnitt vorhanden ist. Backen Sie über Nacht bei 45 bis 50 Grad Celsius, und gehen Sie dann mit Färbung, wie in der Handschrift beschrieben.Beginnen Sie diesen Teil des Experiments mit ungenutzten Brunnen der 96-Well-Matrix-Gel-beschichteten Platte mit Organoiden. Durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, den Raum zwischen Medien und Matrixgel zu verlassen, entfernen Sie sorgfältig so viele Medien wie möglich, ohne die organoide Kultur zu stören. Verwenden Sie eine getrimmte 1.000-Mikroliter Pipettenspitze, vornass mit PBS, um einen Tropfen Matrixgel zu erstellen, der die organischen Stoffe enthält.Geben Sie den Tropfen auf die Mitte einer Kammerrutsche. Mit bloßem Auge die überschüssigen Medien und Matrixgel aus der Kammerrutsche mit einer feinspitzen Pipette aspirieren. Förderung der organoiden Haftung am Glas und Vermeidung von Probenverlust bei nachfolgenden Waschschritten.Legen Sie die Rutsche 30 bis 45 Minuten in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator. Pipettieren Langsam, um ablösen von der Schale zu verhindern, fügen Sie 200 Mikroliter 1X PBS, um die Organoide für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig die 1X PBS und fügen Sie 200 Mikroliter 4%Paraformaldehyd hinzu.Fix für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln. Bei PFA waschen und gehen Sie mit nachfolgenden Permeabilisations- und Färbeschritten fort, wie in diesem Protokoll beschrieben. Mount und Bild sofort.Ungefärbte frisch geschnittene Folie zeigt deutlich menschliche primäre Prostata-Organoide, während in ungefärbten Trockenschlitten, Organoide scheinen durchscheinend und sind schwieriger unter einem hellen Feldmikroskop zu erkennen. Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigt eine gebrochene menschliche primäre Prostata Organoid von Misshandlung, wie aggressive Pipettierung, falsche Verarbeitung Protokoll im Vergleich zu einem gut behandelten Organoid. Das menschliche primäre Prostataorganoid wurde formalinfixiert, paraffin-eingebettet, geschnitten und mit basalem Cytokeratin 5 und luminalem Cytokeratin 8, Basal p63 und luminalem Cytokeratin 8 befleckt und mit konfokalem Mikroskop abgebildet.Ein vollmontiertes menschliches primäres Prostataorganoid wurde mit Basalzytokeratin 5 oder luminalem Cytokeratin 8 gefärbt und mit Phalloidin und DAPI gegengefärbt und mit konfokalem Mikroskop abgebildet. Ein vollmontiertes menschliches primäres Prostatazellorganoid wurde mit fluoreszierend emlogemeem Edu gefärbt und mit Hoescht konterkariert und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Es ist wichtig, Ihre Organoide während des gesamten Verfahrens zu visualisieren.Nachdem Sie die Abschnitte gesammelt haben, stellen Sie sicher, dass Sie die Proben auf der Folie visualisieren und sicherstellen, dass Sie Organoide während der Gesamtenmontage beobachten. Nachdem Sie die Organoide aus dem Matrixgel gesammelt haben, können Sie sie ganz mounten und kommerzielle Assays verwenden oder sich für die Durchflusszytometrie oder einzellige Sequenzierung mit Einzelzellen dissoziieren. Die 3D-Kultur bietet Forschern eine neue Möglichkeit, Gewebe in der Einstellung einer Laborschale zu untersuchen.Es kann auf die Organogenese angewendet werden, oder um die Pathologie der Krankheit eines Patienten zu verstehen. Bei der Arbeit mit Patientenproben immer Vorsicht walten lassen und die Materialien als Potenzial für eine Exposition durch blutübertragene Krankheitserreger behandeln.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Forschung

Biotechnik

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Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

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