Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Ringraziamo i membri UIC Biorespository, Dr. Klara Vályi-Nagy e Alex Susma, come pure gli urologi, DRS. Michael Abern, Daniel Moreira e Simone Crivallero, per la facilitazione dell'acquisizione di tessuto per le colture cellulari primarie. Ringraziamo i pazienti UIC urologia per donare loro tessuto alla ricerca. Questo lavoro è stato finanziato, in parte, il dipartimento della difesa prostata cancro ricerca programma salute disparità Idea Award PC121923 (Nonn) e il centro di UIC per la clinica e scienze della traduzione corso formazione per scienziati traslazionale e clinica ( Gli aspetti) programma (McCray e Richards) e il National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant numeri U54CA202995, U54CA202997 e U54CA203000, conosciuto come il Chicago Health Equity collaborativo (Nonn e Richards). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health o il dipartimento della difesa.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Coltura organotypic è un eccitante nuovo metodo per ricapitolare il tessuto con la comodità di un ambiente in vitro . Attualmente, laboratori crescono organoids da molti tipi di tessuti per vari endpoint. I metodi descritti in questa carta riassumono gli endpoint utili ed evidenziare nuove tecniche per caratterizzare completamente culture 3D primario delle cellule della prostata.
Ci sono una varietà di ricette di media per la coltivazione delle cellule della prostata primaria umana organoids5,6,13. Mentre tutti ottenere risultati comparabili e praticabile, supporti basati su KSFM13 utilizza additivi minimi così è descritto qui. Inoltre, i lavori sono stati pubblicati utilizzando concentrazioni multiple per gel "matrix", dal 10% al 75% al cultura della prostata organoids5,6,13. Perché il gel "matrix" è un reagente costoso, e 33% gel "matrix" ha dimostrato di essere sufficiente per coltivare a lungo termine (2-3 settimane), organoids valida, unclumped13, questa è la concentrazione consigliata. Tuttavia, il gel "matrix" può variare in concentrazione proteica tra numeri di lotto, quindi questo dovrebbe essere preso in considerazione quando placcatura. Si consiglia inoltre di acquistare gel "matrix" in massa per l'utilizzo attraverso esperimenti multipli per ridurre l'incoerenza tra i lotti. Altri laboratori hanno pubblicato diversi formati per la placcatura di gel "matrix", come le goccioline invece di rivestimento una piastra a 96 pozzetti ben5. Entrambi i metodi formano organoids praticabile, ma il formato descritto qui permette affinchè le cellule piastrate più scarsamente, che ha dimostrato di promuovere l'espansione delle cellule in più grandi organoids13. Tuttavia, placcatura densità deve essere ottimizzato in base al largo efficienza di formazione di paziente-specifici. Matrice gel è disponibile in molti formati tra cui il fattore di crescita-ridotto, privo di rosso fenolo, ad alta concentrazione, ecc. Fattore di crescita-ridotto è raccomandato per definite condizioni di coltura e privo di rosso fenolo è consigliato quando si lavora con le cellule che esprimono GFP o in esperimenti che comportano l'acquisizione di immagini di z-stack. È fondamentale che qualsiasi procedura di placcatura gel matrice essere eseguita con reagenti ghiacciati, come gel "matrix" si solidifica rapidamente a temperatura ambiente.
Organoids coltivate in diversi trattamenti sperimentali possono provocare i cambiamenti alla forma, così luminoso-campo imaging è ampiamente utilizzato per studiare i fenotipi morfologici osservati. Tuttavia, la registrazione e quantificare la zona o la forma è una sfida per due motivi: bias di selezione 1) durante l'acquisizione di immagini e 2) applicando un parametro bidimensionale come zona ad un campione tridimensionale. Una strategia di acquisizione di immagini consiste nel registrare un campo casuale e misurare un numero predeterminato di organoids in quel campo, ma questo può creare bias durante la selezione, e tutte le organoids nel campo selezionato potrebbe non essere a fuoco. Formazione immagine di intero-ben ottimizzata per il formato micropiastra a 96 pozzetti Elimina questo bias di campionamento raccogliendo la popolazione intera organoid di interesse. Tuttavia, a seconda degli obiettivi del microscopio su mano, più campi potrebbero essere necessario essere raccolti e piastrellati al fine di ottenere un'immagine di intero-pozzo. Alcuni laboratori sono descritti da un singolo piano z12dell'area di misura, ma per catturare tutte le organoids a fuoco, si consiglia di raccogliere e impilare piani multipli in un singolo EDF-immagine13. In alcuni casi, un menisco nel gel matrice potrebbe causare vignettatura dell'immagine, e metodi di correzione del fondo potrebbero essere necessario essere applicato utilizzando software di analisi di immagine. Volume esatto è idealmente la misura più appropriata per dimensione organoid; Tuttavia, questo è difficile da ottenere con precisione, anche con immagini multiple di z-stack. Altre dimensioni morfologiche utili, come circolarità e rapporto di massima/minima, possono essere facilmente calcolati da tutti i organoids in un'immagine EDF di tutto-bene. Insieme, questi metodi superare sfide bias di campionamento e consentono una misurazione dei parametri 2D da oggetti 3D in uno spazio 3D.
Fissazione in formalina e inclusione in paraffina dei organoids è un metodo comune per ottenere ematossilina ed eosina (H & E), immunoistochimica (IHC) e macchiatura immunofluorescente (IF) per la visualizzazione e l'analisi6,11, 20. Tuttavia, le pubblicazioni che hanno descritto questa tecnica mancano completi dettagli sul processo di incorporamento. Inoltre, l'individuazione di organoids all'interno del blocco di paraffina può essere impegnativo. Alcuni laboratori pre-macchiano organoids con trypan blu prima di incorporare agli aiuti in posizione durante il sezionamento11. Il metodo qui descritto incorpora l'uso di un colorante istologico per orientamento del gelplug organoid/istologia durante l'incorporamento per promuovere l'efficienza di taglio. Diapositive di H & E facilitano l'esame di necrosi, la struttura nucleare e proliferazione, e deve quindi essere un endpoint obbligatorio per organoid cultura per garantire che le cellule sono sane per la sfera. Un punto di forza della cultura organoid è che i campioni sono costituiti da una miscela eterogenea di cellule che assomigliano meglio nel vivo tessuto del paziente. Nella prostata, ad esempio, sia cellule basali di Luminale sono presenti in organoids della prostata5, mentre le cellule coltivate in 2D mancanza luminal differenziazione8. Per valutare la differenziazione organoid, è consigliabile che i ricercatori valutano basali marcatori quali CK5 e p63 e luminal come recettori per gli androgeni e CK88. Eventuali altre proteine sperimentale di interesse possono essere studiate anche utilizzando queste tecniche di colorazione.
Sebbene FFPE sezioni consentono la visualizzazione delle cellule residenti nel compartimento interno via istologica metodi (H & E, se, IHC), immagini sono limitati a sezioni trasversali e organoid forma può essere modificato tramite il processo di incorporamento. Intero-monta la macchiatura consente un organoid essere macchiato e osservato in situ, preservando fenotipi morfologici e permettendo immagini di localizzazione della proteina. Intero-montaggio è uno strumento utilizzato per colorare campioni del intero-tessuto o intero-animale, come l'embrione di pesce zebra o il mouse e si adatta facilmente per organoids. La tecnica qui descritta è stata modificata dalla procedura da Mahéet al. 11, che dettagli la crescita iniziale e la cultura dei organoids gastrointestinale direttamente in una diapositiva di alloggiamento per la colorazione e richiede la fissazione della cultura intera genitore. Il metodo descritto qui comporta il trasferimento di un singolo organoid (o organoids) di interesse in una diapositiva di camera al momento della colorazione. Questo consente la selezione di singoli organoids per analisi di intero-monta in un esperimento in corso senza fissazione della cultura padre. Quando si esegue intero-monta colorazione, è necessario ottimizzare la permeabilizzazione e il tempo di incubazione per anticorpi primari e secondari garantire la penetrazione in tutto il campione (ovunque da uno o più giorni è consigliato). Una volta ripreso tramite microscopia confocale, rendering 3D può essere prodotto per attivare la visualizzazione e la localizzazione di una proteina specifica e calcolare il numero di cellule positivamente marcate presenti in un campione. Citometria a flusso è un endpoint utile quantificare popolazioni di basale, luminal, o cellule staminali5,14. Per effettuare questa operazione, le cellule sono recuperate dal gel matrix e delicatamente dissociate per la colorazione. Gli utenti devono selezionare attentamente gli indicatori appropriati per separazione sulla base della letteratura attuale. Per cellule epiteliali prostatiche primarie umane, CD26 e CD49f sono marcatori adatti luminal e basali, rispettivamente5,21.
In sintesi, questo protocollo dettagli sperimentali endpoint, raccolta e crescita umano primario della prostata organoid. Da notare, la tecnica di montaggio descritta può applicarsi ad una varietà di altri saggi che sono normalmente impiegate per celle 2D, ad esempio fluorescente esperimenti basati su sonda guardando19di proliferazione, apoptosi e macchie organello subcellulare. Inoltre, il metodo di raccolta e dissociazione qui descritto potrebbe essere utilizzato in preparazione per cella singola sequenziamento del RNA,18. Collettivamente, questo dimostra la possibilità per una varietà di romanzo, gli endpoint di alta fedeltà che i ricercatori in grado di ottimizzare ed esplorare in futuro.

Organoids sono uno strumento prezioso per studiare l'organogenesi e malattia. Essi forniscono un'alternativa meno costosa ai modelli animali, e paziente-derivati organoids stanno evolvendo come una strategia per la medicina personalizzata1,2,3. Questo sistema tridimensionale (3D) cultura coinvolge la semina di cellule staminali o progenitrici (raccolte da tessuti o cellule staminali pluripotenti indotte) in un gel di componenti della matrice extracellulare (gel "matrix")4. Le cellule proliferano e si differenziano, conseguente organotipiche strutture che ricapitolano la gerarchia cellulare e la morfologia dell'organo dell'unità funzionale di interesse. Organoids sono state coltivate utilizzando cellule provenienti da una varietà di organi, tra cui delle ghiandole salivari, stomaco, intestino, fegato, prostata, polmone e cervello4. Anche se esistono numerosi protocolli che descrive i passaggi per stabilire della prostata organoids5,6, è difficile trovare metodi sufficientemente dettagliate su come raggiungere quantitativi endpoint da organoids. Questo documento riassume i metodi sviluppati per cellule umane della prostata primarie e dettagli di una serie di endpoint suggerite per valutare i fenotipi organoid. Queste tecniche sono state ottimizzate per organoids della prostata e possono essere applicabili alle altre colture cellulari 3D.
Culture della prostata organoid recentemente sono emerso come stabilito un modello prezioso in vitro che manca le limitazioni delle colture monostrato utilizzando linee cellulari immortalizzate. Epitelio benigno della prostata e carcinoma della prostata è impegnativo per il modello in vitro utilizzando linee cellulari immortalizzate. Il numero di linee cellulari benigne è limitato, e tutti sono stati sottoposti a trasformazione con oncogeni7. Cellule epiteliali della prostata primarie negli strati monomolecolari non differenziarsi in cellule luminal e mancanza dell'androgeno recettori8. La maggior parte delle linee cellulari del carcinoma della prostata non hanno recettori per gli androgeni funzionale, un importante mediatore di precoce stato di malattia e mancanza chiave modifiche genetiche che sono state trovate in pazienti tumori9. Della prostata organoid culture possono essere coltivate facilmente da epitelio benigno e sono utili nello studio delle proprietà delle cellule staminali, cellule progenitrici, differenziazione e gli effetti di modifiche sperimentali nel microambiente4,5. Organoids di carcinoma della prostata può essere coltivata come parte di un approccio di medicina di precisione alla modellazione malattia paziente e della risposta a terapie10.
Questo protocollo è stato compilato da protocolli esistenti che utilizzano vari tipi di cellule, ma è stato qui ottimizzato per l'uso in cellule umane di carcinoma della prostata primarie. Complimenti protocolli delineati da Sawyers, Clevers e Shen5,6 che descrivono la crescita, passaggio, campo chiaro imaging, crioconservazione e isolamento di RNA e DNA del mouse della prostata e organoids umano. Il protocollo di intero-monta viene modificato da Mahé et al. 11, che ha usato organoids epiteliali gastrointestinali e descrive live imaging e congelati e l'incorporamento di paraffina. Borten et al. 12 descritto l'analisi del seno, del colon e cancro colorettale organoid morfologia da campo chiaro imaging. Inoltre, Richards et al. 13 utilizzato un metodo per la valutazione morfologica dei organoids della prostata. Infine, Hu et al. 14 descritto un metodo della prostata aderente organoids a una diapositiva di camera pernottamento prima la macchiatura immunofluorescente per osservare cellule singole e dispersione delle sfere per analisi di citometria a flusso.
L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare in modo sufficientemente dettagliato questi metodi tecnicamente impegnativi come un protocollo, tra cui semina delle cellule; media e matrice gel manutenzione; insieme di celle per citometria a flusso; RNA, DNA ed estrazione di proteine; valutazione morfologica da analisi dello stack z campo chiaro; l'incorporamento, lavorazione e sezionamento per la macchiatura istologici; e tutto-montaggio per immunofluorescenza o sonda fluorescente saggi. La rilevanza biologica e l'interpretazione di questi vari endpoint varierà tra disegno sperimentale e gli anticorpi usati per l'analisi. Attraverso l'utilizzo di questo protocollo, gli utenti dovrebbero sentirsi pronti a impostare un esperimento con un toolkit di endpoint.
Cellule di (PrE) epiteliali prostatiche primarie umane sono state stabilite in laboratorio dal protocollo descritto da15,16 e mantenuto a un numero limitato di passaggi (fino a quattro) come descritto in precedenza17, ma sono anche disponibili da fornitori commerciali. Dell'epatocita privo di siero basato su media6, basati su KSFM13e R-spondin 1-condizionati5 media è tutti pubblicati come avendo prodotto con successo organoids. Basato su KSFM richiede il minor numero di additivi, quindi viene descritto qui.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la coltura (3D) tridimensionale, il trattamento e la valutazione dei organoids della prostata primaria umana. Il processo prevede la semina delle cellule epiteliali scarsamente in un gel di matrix 3D su una micropiastra da 96 pozzetti con le modifiche di supporto a coltivare espansione in organoids. Morfologia è quindi valutato bene tutta la cattura di immagini dello stack z. Compressione di z-stack crea un'unica immagine di messa a fuoco da cui organoids sono misurati per quantificare una varietà di uscite, tra cui circolarità, rotondità e area. DNA, RNA e proteine possono essere raccolti da organoids recuperati dal gel matrix. Popolazioni di cellule di interesse possono essere valutate da dissociazione organoid e citometria a flusso. Formalina-fissazione--inclusione in paraffina (FFPE) seguita da sezionamento viene utilizzato per la valutazione istologica e la macchiatura dell'anticorpo. Intero-monta macchiatura immunofluorescente conserva morfologia organoid e facilita l'osservazione di localizzazione della proteina in organoids in situ. Test commerciali che sono tradizionalmente usate per le cellule dello strato monomolecolare 2D possono essere modificate per organoids 3D. Le tecniche in questo protocollo, utilizzati insieme, forniscono una robusta cassetta degli attrezzi per quantificare la crescita organoid della prostata, le caratteristiche morfologiche e l'espressione di marcatori di differenziazione.

Su coltura riuscita dei organoids della prostata primaria umana, morfologia e differenziazione può essere valutate utilizzando analisi delle immagini in campo chiaro e FFPE e tecniche di colorazione del intero-monta.
Il processo di acquisizione di immagini di campo chiaro è illustrato in Figura 1A. Organoids sono cresciuta in una matrice 3D e disperse attraverso diversi piani focali. Per osservare organoids a fuoco attraverso molti aerei, si consiglia di utilizzare un'immagine EDF (Figura 1B, destra) anziché un singolo piano z (Figura 1B, sinistra). In laboratorio, organoids coltivate in condizioni sperimentali diverse può provocare cambiamenti nella morfologia. Utilizzando area, circolarità (definito da come il organoid è simile a un cerchio) e raggio di max/min (misura di lunghezza) dare agli utenti un'indicazione di forma e dimensioni organoid e fornire una lettura quantificabile della morfologia. Per sottolineare l'utilità di queste misure, immagini rappresentative dei organoids con area simile ma differente morfologia sono mostrati in Figura 1, in cui una lunga organoid sarà meno circolare e hanno un più grande rapporto di massimo/minimo rispetto uno sferico organoid.
L'incorporamento di organoids per l'istologia è un endpoint utile per osservare l'interno di campioni e garantire che la necrosi non è presente all'interno del nucleo di un organoid. Un flusso di lavoro per questo processo e risultati rappresentativi dei campioni non macchiati, sezionati con un microscopio a campo chiaro sono forniti in Figura 2AB, C. Figura 3A Mostra un organoid maltrattato (a sinistra) rispetto al correttamente consegnato organoids in Figura 3A (a destra) e Figura 3B. Per determinare lo stato di differenziazione del campione, si consiglia di guardare delle cellule basali marcatori (citocheratina 5 e p63)8 insieme a luminal delle cellule marcatori (citocheratina 8)8. Se si desidera macchia organoids in situ, intero-monta la macchiatura è una conveniente alternativa, e questi risultati rappresentativi sono forniti in Figura 3D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figura 1: valutazione della morfologia dei organoids nella cultura 3D. (A) immagine raccolta e la compressione del flusso di lavoro per umano primario della prostata organoids acquisita da una luce trasmessa invertito microscopio con un motorizzato X / Y stage e compagno software di scansione. (B) immagini rappresentative di un singolo z-stack (sinistra) vs. un'immagine EDF (a destra) di un campione di tutto-bene di umano primario organoids della prostata, mostrando che altre organoids sono a fuoco quando più z-stack sono combinati in una singola immagine proiettata (scala bar = 1000 µm). (C) immagini rappresentative per zona, circolarità e max/min rapporto di morfologicamente dissimili umano organoids primario della prostata che hanno la stessa area (barra della scala = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figura 2: Organoid incorporamento di flusso di lavoro e rappresentante risultati di sezionamento. (A) umano primario della prostata organoid incorporamento del flusso di lavoro. (B) immagine rappresentativa di una diapositiva non colorata, fresca contenenti umano primario della prostata organoids sotto un microscopio a campo chiaro raffigurante agar (freccia verde), gel di istologia (freccia nera), bolla (freccia blu), organoids (frecce rosse) (scala bar = 1000 µ m). (C) senza macchia appena tagliata diapositiva (a sinistra) vs. non macchia scorrevole asciutto (a destra), organoids (frecce rosse) appaiono traslucido quando asciutto (barra della scala = 500 µm) e sono più difficili da discernere sotto un microscopio a campo chiaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figura 3: macchiatura istologici su organoids sezionato e montato tutto. (A) H & E colorazione di un rotto umano organoid primario della prostata dal maltrattamento (pipettaggio aggressivo, protocollo di trattamento sbagliato, a sinistra) accanto a un ben gestito organoid (a destra) (barra della scala = 100 µm). (B) umano primario organoid della prostata che è stato fissato in formalina, paraffina, sezionati e colorato con basale cytokeratin 5 o luminal cytokeratin 8 (in alto) o basale p63 e luminal cytokeratin 8 (in basso) e ripreso con microscopio confocale ( barra della scala = 100 µm). (C) un intero-montato umano primario della prostata organoid macchiato con il cytokeratin basale 5 o luminal cytokeratin 8 e controcolorati con falloidina e DAPI, imaged con microscopio confocale (barra della scala = 100 µm). (D) un intero-montato umano primario delle cellule della prostata organoid macchiato con fluorescente etichettati EdU e contatore macchiato con Hoescht, imaged con microscopio confocale (barra della scala = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Qui, presentiamo un protocollo per guidare la gestione umana primaria della prostata organoid quindi suggerire gli endpoint per valutare il fenotipo. Semina, manutenzione di cultura, recupero da gel "matrix", quantificazione morfologica, l'incorporamento e sezionamento, FFPE sezionamento, intero-monta macchiatura e applicazione di test commerciali sono descritti.

Gestione e valutazione della cultura umana Organoid primario della prostata

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Gli organoidi prostatico sono un eccitante sistema in vitro per lo studio dello sviluppo e delle malattie. Superano le sfide delle linee cellulari immortalate e offrono un'alternativa economica ai modelli animali. Possono essere coltivati da cellule prostatiche umane, come abbiamo dimostrato in questo protocollo, così come cellule prostatiche del topo, come un sistema di modelli preclinali rilevanti per la malattia.Molti laboratori hanno descritto metodi ed endpoint di impostazioni cultura utili. Ma speriamo di riunire questi dettagli in un unico protocollo e dimostrare i passaggi particolarmente impegnativi per i nuovi utenti. Man mano che le tecniche migliorano, gli organoidi del cancro alla prostata possono essere coltivati da campioni di pazienti come approccio di medicina di precisione per modellare le malattie e rispondere alle terapie.Le condizioni di coltura sono specifiche degli organoidi prostatico, tuttavia molti degli endpoint sono stati adattati da altri tipi di tessuto. Un utente potrebbe adattare parti di questo protocollo al proprio tipo di cella di interesse. Iniziate questo esperimento coltivando cellule epiteliali in tavole a 96 pozzi codificate in gel a matrice come descritto nel manoscritto.Per raccogliere gli organoidi dalle piastre dopo 12 giorni, rimuovere il mezzo dai pozzi senza disturbare il gel a matrice. Quindi aggiungere immediatamente circa 200 microlitri di proteasi neutra ad ogni pozzo a circa un rapporto uno-a-due di gel matrice a proteasi neutra. Incubare il piatto per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi pipettare su e giù per dissociare meccanicamente la miscela e incubare di nuovo per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire la miscela gel-cella a matrice proteasi neutra da alcuni pozzi a un tubo di microcentrifugo. Pellettare le cellule per centrifugazione a 300 volte g per tre o cinque minuti.Rimuovere il supernatante e salvare il pellet organoide per le analisi successive. Per creare stampi per l'incorporamento, ritagliare una piccola sezione di una punta di pipetta da 1.000 microlitri per creare un cilindro che contiene 50 microlitri. Quindi dalla parte più ampia della stessa punta, fare un secondo stampo più ampio che si adatta intorno al primo stampo.Per creare un blocco freddo, avvolgere un impiglio di ghiaccio con nastro adesivo verso l'alto. Quindi aderire gli stampi perpendicolarmente al nastro. Per incorporare gli organoidi in un tappo di gel istologico per la lavorazione, lavare prima il pellet organoide precedentemente ottenuto con un millilitro della soluzione di sale bilanciato di Hank.Dopo aver centrifugato a 300 volte g per tre o cinque minuti, rimuovere il supernatante. Quindi aggiungere da 30 a 50 microlitri di gel istologico liquido al pellet organoide e mescolare delicatamente pipettando lentamente su e giù per rimescolare il pellet. Trasferire questa miscela in uno stampo sul blocco freddo e lasciare raffreddare e solidificare il campione in una spina.Successivamente, utilizzare uno stantuffo per spingere la spina fuori dal piccolo stampo e al centro dello stampo più grande e riempirla pipettando chiaro 2%agar intorno alla spina. Per contrassegnare la parte superiore del campione, pipetta istologica tinta di colorante 2%agar sopra la spina. Una volta raffreddato l'agar, utilizzare uno stantuffo per trasferire la spina in una cassetta istologia.Etichettare la cassetta con una matita e posizionarla in formalina tamponata neutra al 10% per la fissazione notturna. Il giorno seguente, trasferire la cassetta dalla formalina tamponata al 10% neutra al 70% di etanolo di grado istologico, e elaborarla ulteriormente e incorporarla in paraffina. Iniziare tagliando la base del blocco con uno spessore di 10 micrometri.Una volta visualizzata una sezione che contiene l'area della spina, interrompere il taglio. Bloccare il rotore del microtomo e trasferire il blocco sul ghiaccio per raffreddare. Spostare la lama in una nuova porzione inutilizzata.E trasferire il blocco di nuovo al morsetto. Sbloccare la macchina e iniziare a tagliare a cinque micrometri per sezione. Usa le pinzette per trasferire la sezione al bagno d'acqua Celsius di 40 gradi e consentirgli di diffondersi.Immergere uno scivolo verticalmente nell'acqua per trasferire la sezione su di esso. Quindi osservare lo scivolo sotto un microscopio a campo luminoso per assicurarsi che nella sezione sia presente un organoide. Cuocere durante la notte a 45-50 gradi Celsius, quindi procedere con la colorazione come descritto nel manoscritto.Inizia questa parte dell'esperimento con pozzi inutilizzati della piastra rivestita in gel a matrice di 96 pozzi con organoidi. Pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra il supporto e il gel matrice, rimuovere con cura il maggior numero possibile di mezzi senza interrompere la coltura organoide. Utilizzare una punta di pipetta rifilata da 1.000 microliter, pre-bagnata con PBS per disegnare una goccia di gel matrice che contiene gli organoidi di interesse.Distribuire la goccia al centro di uno scivolo da camera. Ad occhio nudo, aspirare il supporto in eccesso e il gel a matrice dallo scivolo della camera utilizzando una pipetta a punta fine. Per promuovere l'aderenza organoide al vetro e prevenire la perdita di campioni durante le successive fasi di lavaggio.Posizionare la diapositiva in un incubatore di 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Pipettando lentamente per evitare il distacco dal piatto, aggiungere 200 microlitri di 1X PBS per lavare gli organoidi per cinque minuti a temperatura ambiente con tremori delicati. Rimuovere con cura il PBS 1X e aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4%.Fissare per 30 minuti a temperatura ambiente con tremori delicati. In PFA, lavare e procedere con le successive fasi di permeabilizzazione e colorazione come descritto da questo protocollo. Montare e immagine immediatamente.Lo scivolo appena tagliato non macchiato mostra chiaramente gli organoidi prostatici primari umani, mentre nello scivolo secco non macchiato, gli organoidi appaiono traslucidi e sono più difficili da rilevare al microscopio a campo luminoso. La colorazione di ematossilina ed eosina mostra un organoide prostatico primario umano rotto da cattiva gestione, come pipettazione aggressiva, protocollo di elaborazione errato rispetto a un organoide ben gestito. L'organoide prostatico primario umano era fissato alla formalina, incorporato nella paraffina, sessato e macchiato con citocheratina basale 5 e citocheratina luminare 8, p63 basale e citocheratina luminare 8, e immaginato con microscopio confocale.Un organoide prostatico primario umano a tutto montato era macchiato con citocheratina basale 5 o citocheratina luminale 8, e controsostenibile con phalloidina e DAPI, e immaginato con microscopio confocale. Un organoide a cellule prostatiche primarie umane montato su intero era macchiato con Edu con etichetta fluorescente e controsostenibile con Hoescht, e immaginato con microscopio confocale. È importante visualizzare i tuoi organoidi durante tutta la procedura.Dopo aver raccolto le sezioni, assicurarsi di visualizzare i campioni sulla diapositiva e assicurarsi di osservare gli organoidi durante il montaggio intero. Dopo aver raccolto gli organoidi dal gel matrice, è possibile montarli interamente e utilizzare saggi commerciali o dissociarli su singole cellule per la citometria a flusso o il sequenziamento a cella singola. La cultura 3D offre ai ricercatori un nuovo modo di studiare i tessuti nell'impostazione di un piatto da laboratorio.Può essere applicato all'organogenesi o alla comprensione della patologia della malattia di un paziente. Quando si lavora con campioni di pazienti, prestare sempre attenzione e maneggiare i materiali come potenziale di esposizione agli agenti patogeni trasmessa dal sangue.

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