Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
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一次電池文化の組織取得の円滑化のための泌尿器ドクター マイケル ・ Abern、ダニエル ・ モレイラ、シモーネ ・ Crivallero と同様に、UIC Biorespository メンバー、博士クララ Valyi-ナジとアレックス Susma に感謝いたします。私たちは研究に彼らのティッシュの寄付の UIC の泌尿器疾患を感謝します。この作業によって賄われていた、一部、部門の防衛前立腺がん研究プログラム健康格差アイデア賞 PC121923 (Nonn) と UIC 臨床センター、臨床や医療科学者 (翻訳科学呼称される教育展望) プログラム (McCray とリチャーズ)、国立衛生研究所の国立癌研究所、助成番号 U54CA202995、U54CA202997、U54CA203000、によってシカゴの健康資本共同 (Nonn とリチャーズ) として知られています。内容は著者の責任と健康の国民の協会、または国防総省の公式見解を必ずしも表さない。

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

培養は、体外環境の利便性と組織の概説のためのエキサイティングな新しい方法です。現在、ラボは成長 organoids 様々 なエンドポイントのためのティッシュの多くの種類からです。本稿で説明する方法は、有用なものを要約し、3 D の主な前立腺細胞培養を完全に特徴づける新しい手法を強調表示。
主な前立腺細胞オルガノイド5,6,13の育成のためのメディア レシピはたくさんあります。一方、実行可能な対等な結果を達成するすべて KSFM ベースのメディア13を使用最小限の添加物が記載されているのでここで。さらに、論文は、マトリックス ゲル、文化前立腺 organoids5,6,1375% に 10% からの複数の集中を使用して公開されています。マトリックスのゲルは、高価な試薬と 33% 行列ゲルは長期 (2-3 週間) を養うに十分であると示されているので実行可能な unclumped organoids13、推奨の濃度です。ただし、ロット番号、ので、これはアカウントに取られるべきときにめっき間の蛋白質の集中のゲルのマトリックスは異なります。また、多くの不一致を軽減する複数の実験中用一括でマトリックス ゲルを購入することをお勧めします。他のラボは、メッキ コーティング 96 ウェル プレートも5ではなく水滴などのマトリックス ゲルの異なるフォーマットを公開しています。両方の方法は実行可能なオルガノイドを形成、細胞より希薄で、メッキがここで説明されている形式により大きい organoids13に細胞の拡大を促進するために示されています。しかし、播種密度最適化してください患者固有の形成の効率に基づきます。マトリックス ゲル成長因子減少、フェノールレッド フリー、高濃度、等を含む多くのフォーマットで利用可能です。培養条件を定義し、GFP を発現する細胞または z スタック画像キャプチャを伴う実験で作業してときフェノールレッド フリーをお勧め、成長因子減少することをお勧めします。マトリックス ゲルは室温で迅速に固化、冷たい試薬とマトリックス ゲル メッキ ステップを実行することが重要です。
オルガノイドのさまざまな実験的治療法で栽培した可能性があります変更、図形に明視野イメージングを使用広く観察された形態学的表現型を研究しています。それにもかかわらず、記録領域または形状の定量化が挑戦 2 つの理由: 1) 偏り中にイメージをキャプチャし、2) 三次元サンプル エリアなどの 2 次元のパラメーターに適用します。画像キャプチャの方法の 1 つは、レコードのランダムなフィールドとそのフィールドにオルガノイドの所定の数を測定、これは選択時バイアスを作成することができます選択したフィールドすべてオルガノイドのフォーカスできない場合があります。全体もイメージングの 96 ウェル マイクロ プレート フォーマット用に最適化は、利益の全体における人口を集めることによってこのサンプリング バイアスを排除します。しかし、一方で顕微鏡対物レンズに応じて複数のフィールドは収集し全体もイメージを得るためにタイル張りの必要があります。いくつかの研究所は単一の z 平面12からの測定領域を説明しているが、フォーカスのすべてオルガノイドをキャプチャするを収集、単一 EDF 画像13に複数の平面をスタックすることは勧め。いくつかの場合、行列ゲルに半月板のイメージでケラレが発生する可能性があります、バック グラウンド補正法は、画像解析ソフトを使用して適用する必要があります。正確なボリュームは理想的に organoid サイズの最も適切な測定ただし、これは正確に得るために、複数画像を z スタックとも困難です。真円度、最大値/最小値比など、その他の有用な形態学的寸法は、全体も EDF イメージですべての organoids から簡単に算出することができます。一緒に、これらのメソッドは、サンプリング バイアス課題を克服し、3 D 空間内の 3D オブジェクトの 2D パラメーターの測定を有効にします。
ホルマリン固定・ パラフィン包埋オルガノイドのヘマトキシリンとエオシン (H & E)、(IHC)、免疫組織化学的および免疫蛍光 (IF) は、可視化と分析の6,11,の染色を取得する一般的な方法は、します。20します。 ただし、この方法を説明している出版物不足埋め込みプロセスの詳細については包括的な。また、organoids パラフィン ブロック内を検索、挑戦的なことができます。いくつかのラボは、前11の区分の間に場所で支援するために埋め込む前に青いトリパン ブルーとオルガノイドを汚します。ここで説明したメソッドには、断面の効率を促進する埋め込み中 organoid/組織 gelplug の方向の組織学的の染料の使用が組み込まれています。H & E スライド壊死、核の質および増殖の検討を容易にする、従ってそれは培養細胞の球を通して、健康を確実にするための必須のエンドポイントをする必要があります。培養の強さは、サンプルはより良い患者組織体内のような細胞の異種混合物から成ることです。前立腺でたとえば、基底部および管腔細胞は前立腺 organoids5、2 D の不足, 分化8で育った細胞中に存在。における差別化を評価するためには、CK5 など p63 基底マーカーとアンドロゲン受容体など CK88内腔マーカー研究者を評価することをお勧めします。興味の他の実験的蛋白質はまたこれらの染色技術を使用して習得します。
FFPE のセクションには、細胞内部のコンパートメントで組織学的方法 (H & E、場合、IHC) 在住の可視化ができるように、画像、断面に制限されます、organoid 図形埋め込みプロセスによって改変すること。全取り付ける染色により染色し観察場で、形態学的表現型を維持し、蛋白質のローカリゼーションの画像を許可する organoid です。全体取り付けはマウスやゼブラフィッシュ胚など、全体組織または全体の動物の標本を染色するために利用するツールをオルガノイドのために容易に適応です。ここで説明する手法は、Mahéらによってプロシージャから変更されました。11, 初期生育と染色、チェンバー スライドに直接胃腸オルガノイドの文化の詳細と全体の親カルチャの固定が必要です。ここで概説している方法には染色時にチェンバー スライドに興味の単一の器官毛細 (または organoids) の転送が含まれます。これは、親カルチャの固定せず継続的な実験の全体マウント分析個々 オルガノイドの選択できます。それは透過と試料全体で確実にするために第一次および二次抗体の孵化時間を最適化するために必要な全取り付ける染色の際、(任意の場所 1 つまたは複数の日からを推奨)。一度経由共焦点顕微鏡のイメージを作成、可視化と特定の蛋白質の局在化を有効にして積極的に染色細胞サンプルで現在の数を計算する 3 D レンダリングを作り出すことができます。フローサイトメトリーは、基底の内腔、集団を定量化する有用なエンドポイントまたは幹細胞5,14。これを行うには、セルをマトリックス ゲルから回収して優しく汚損のため解離。ユーザーは慎重に現在の文献に基づく分離の適切なマーカーを選択してください。ひと前立腺上皮細胞、CD26 と CD49f が適切な内腔と基底マーカー、それぞれ5,21。
要約すると、このプロトコル詳細人間プライマリ前立腺における成長、コレクション、および実験的エンドポイントを示します。注記のうち、説明する実装手法は様々 な 2次元細胞増殖19、アポトーシスおよび細胞内オルガネラの汚れ見て蛍光プローブを用いた実験などの通常使用されていた他のアッセイに適用できます。さらに、ここで説明したコレクションと解離のメソッドは、単一細胞 RNA シーケンス18のための準備で利用できます。まとめると、これは小説、研究者が最適化され、将来的に探索する忠実度の高いエンドポイントのさまざまな可能性を示しています。

Organoids、器官形成と疾患を検討する貴重なツールです。彼らは動物モデルに安価な代替手段を提供、患者由来 organoids が個人化された薬1,2,3の戦略として進化しています。この三次元 (3 D) 培養システムを含む細胞外マトリックス成分 (マトリックス ゲル)4のゲルに幹または前駆細胞 (組織から収穫または誘導多能性幹細胞) を播種します。細胞増殖し、の興味の機能単位の器官の形態と細胞階層を要約脊髄構造で区別する.さまざまな臓器、唾液腺、胃、腸、肝臓、前立腺、肺、脳の4を含む由来細胞を用いたオルガノイドを栽培されています。前立腺 organoids5,6を確立する手順を説明する多数のプロトコルが organoids から定量的なエンドポイントを実現する方法について詳細な方法を見つけることに挑戦です。本稿はひと前立腺細胞の開発方法をまとめたもの、シリーズにおける表現型を評価するために提案されたエンドポイントの詳細。これらのテクニックは、前立腺 organoids 用に最適化され、3 D の細胞の他の文化に適用される場合があります。
前立腺における文化は、不死化細胞株を用いた単層培養の制限に欠けている貴重な生体外モデルとして最近浮上しています。良性前立腺上皮、前立腺癌モデルの in vitro不死化細胞株を使用するは困難です。良性の細胞の数は限られているとすべては遺伝子7変換を受けています。単分子膜における一次前立腺上皮細胞は管腔細胞に分化しないし、アンドロゲン受容体8を欠いています。機能的なアンドロゲン受容体、初期の病気の状態や患者の腫瘍9で発見されている不足キー遺伝的変更の重要なメディエーターである前立腺癌細胞株の大半を持っていません。前立腺における文化は良性の上皮から簡単に育てることができる、茎セルのプロパティ、前駆細胞、分化および微小環境4、5の実験的変化の影響の研究に貴重です。患者の疾患や治療10への応答のモデリング精度医学アプローチの一環として前立腺癌オルガノイドを栽培できます。
このプロトコルは、さまざまなセルの種類を使用して、既存のプロトコルからコンパイルされていますが、それはここでひと前立腺細胞での使用に最適化されています。トムソーヤ、Clevers、シェン、説明したプロトコルをほめる5,6成長、継、明視野イメージング、凍結、および前立腺マウスと人間オルガノイドの RNA と DNA の分離を記述します。Mahéらから全体マウント プロトコルを変更します。11、消化管上皮オルガノイドを使用してについて説明しますライブ イメージングと冷凍とパラフィンを埋め込みます。Bortenら12は、胸、コロン、および明るいフィールド画像から大腸癌における形態の分析を説明します。また、リチャーズら。13は、前立腺オルガノイドの形態学的評価法を使用しました。最後に、胡主席ら14は、チェンバー スライドする organoids 一晩単一細胞およびフローサイトメトリー解析のための球のばらつきを観察する蛍光抗体染色前に付着した前立腺のメソッドを説明します。
このプロトコルの目的細胞播種; を含む、1 つのプロトコルとして十分詳細にこれらの技術的に挑戦的な方法を示すことです。メディアと行列のゲルのメンテナンス;フローサイトメトリー用セルのコレクションRNA、DNA および蛋白質の抽出;明るいフィールド z スタック分析の形態学的評価埋め込み処理と組織染色; の断面蛍光抗体法や蛍光プローブの全体マウントを試金します。生物学的関連性とこれらのさまざまなエンドポイントの解釈は、実験的なデザインと分析に使用する抗体の間で異なります。このプロトコルを活用すると、ユーザーは、エンドポイントのツールキットを使った実験を設定する準備ができて感じるはずです。
ひと前立腺上皮 (PrE) 細胞、ラボで Peehl15,16によって記述され、前述の17通路 (最大 4 つ) の限られた数に維持のプロトコルによって設立されたが、また商用ベンダーから利用できます。肝細胞無血清メディア ベース6、KSFM ベース13、および R spondin 1 エアコン5メディアは、organoids 制作正常に発行されます。KSFM ベースで、添加物の少ないが必要とするは、ここに記述されますので。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

本稿では、三次元 (3 D) の培養、処理、および人間のプライマリ前立腺オルガノイドの評価のための詳しいプロトコルについて説明します。プロセスは、まばら organoids 進出を育成するメディアの変更と 96 ウェル マイクロ プレート上に 3 D マトリックス ゲルにおける上皮細胞の播種を行います。形態を全体もキャプチャ画像を z スタックの評価します。Z スタック圧縮 organoids 様々 な出力、真円度、真円度、エリアなどを定量化する測定から単一の焦点でイメージを作成します。DNA、RNA および蛋白質は、マトリックス ゲルから回収オルガノイドから収集できます。興味の細胞集団における解離によって評価され、フローサイトメトリーします。ホルマリン固定・ パラフィン-埋め込み (FFPE) 断面に続いては、組織学的評価および抗体の汚損のため使用されます。ホール マウント免疫蛍光染色における形態を維持し、オルガノイドの in situにおけるタンパク質局在の観察が容易になります。3 D オルガノイドの 2次元単層細胞に伝統的に使用される商業のアッセイを変更できます。一緒に使用すると、このプロトコルの技術は前立腺における成長、形態学上の特性、および分化マーカーの発現を定量化する堅牢なツールボックスを提供します。

人間プライマリ前立腺オルガノイド培養に成功、時に、明視野画像解析と FFPE と全取り付ける染色技術を使用すると、形態と差別化を評価できます。
図 1 aに明視野イメージ キャプチャのプロセスを示します。Organoids が 3 D マトリックスで成長し、異なった焦点面に 。多くの面でフォーカス オルガノイドを観察するには、は、(図 1 b、左) 1 つの z 平面の代わりに EDF 画像 (図 1 b右) を使用することをお勧めします。演習では、形態変化 organoids 異なる実験条件下で栽培した可能性があります。領域を使用して、循環 (円、どのように似て、organoid で定義) と最大/最小半径 (長さの単位) organoid サイズと形状の指示をユーザーに与えるし、形態の定量化可能な読み出しを提供します。図 1、長い organoid が小さい円形になるし、球面よりも大きく最大値/最小値比を持っているのこれらの措置の有用性を強調するため同じような区域が異なる形態オルガノイドの代表的な画像が表示されます。organoid。
組織学のためオルガノイドの埋め込みは、サンプルの内部を観察し、壊死組織が、organoid のコア内に存在しないことを確認する便利なエンドポイントです。このプロセスと明視野顕微鏡断面無染色試料の代表の結果のためのワークフローは、図 2 a、B、Cで提供されます。図 3 aは、不適切 organoid (左) と比較して正しく渡した (右)図 3Aおよび図 3 bでオルガノイドを示しています。サンプルの分化状態を調べるを基底細胞のマーカー (サイトケラチン 5 および p63)8管腔細胞マーカー (サイトケラチン 8)8と一緒に見ることをお勧めします。オルガノイドを染色する必要がある場合はその場で、全取り付ける染色は便利な代替手段とこれらの代表的な結果は、図 3、d.で提供されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> 図 1: 3 D 培養オルガノイドの形態評価。(A)透過光によって取得した人間のプライマリ前立腺オルガノイドのイメージ コレクションと圧縮ワークフロー反転電動顕微鏡 X ・ Y ステージとコンパニオン ソフトウェアをスキャンします。(B)単一 z スタック (左)対の代表的なイメージ。複数 z スタックは、単一の投影イメージに組み込まれるより organoids がフォーカスされていることを示す人間のプライマリ前立腺オルガノイドの全体もサンプルの (右) EDF 画像 (スケールバー = 1000 μ m)。(C)同じ領域のある形態学的に異種の人間プライマリ前立腺オルガノイドのエリア、真円度、最大値/最小値の比の代表的画像 (スケールバー = 200 μ m)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> 図 2: ワークフローと代表の結果を断面に埋め込む Organoid。(A)人間プライマリ前立腺におけるワークフローを埋め込みます。(B)寒天培地 (緑の矢印)、組織ゲル (黒矢印)、バブル (青い矢印)、organoids (赤矢印) を描いた明るいフィールド顕微鏡下で人間のプライマリ前立腺オルガノイドを含む無染色、新鮮なスライドの代表的な画像 (スケールバー = 1000 μm). (C)新鮮なカット スライド (左)対を無染色します。無染色のドライ スライド (右)、organoids (赤い矢印) は乾燥すると半透明表示される (スケール バー = 500 μ m)、明るいフィールド顕微鏡下で識別するは難しい。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> 図 3: 断面と全体載オルガノイドの組織染色します。(A) H & E 染色よく処理されます organoid (右) の横にある (積極的なピペッティング、不適切な処理プロトコル、左) で壊れた人間プライマリ前立腺 organoid (スケールバー = 100 μ m)。(B)ホルマリン固定、パラフィン包埋されている人間のプライマリ前立腺 organoid 断面、および 8 (上) または基底 p63 と内腔サイトケラチン 8 (下) 基底サイトケラチン 5 や内腔のサイトケラチン染色し、共焦点顕微鏡 (イメージスケールバー = 100 μ m)。(C) 、全体に取り付けられた人間プライマリ前立腺における基底サイトケラチン 5 または内腔サイトケラチン 8 とステンド グラスし、ファロイジンと共焦点顕微鏡を用いたイメージング DAPI counterstained (スケールバー = 100 μ m)。(D)蛍光染色全体載人間原発前立腺細胞器官毛細エドゥをラベルし、カウンター Hoescht、共焦点顕微鏡とイメージングで染色 (スケールバー = 500 μ m)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

ここでは、人間プライマリ前立腺における処理をガイドし、表現型を評価するためにエンドポイントを提案するプロトコルを提案する.播種、文化の維持、マトリックス ゲルからの回復形態の定量化、埋め込み断面、FFPE 切片、全取り付ける染色と商業アッセイの適用を示します。

処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

前立腺オルガノイドは、発達と病気を研究するためのエキサイティングなインビトロシステムです。彼らは不死化細胞株の課題を克服し、動物モデルに代わる安価な代替手段を提供します。彼らは、このプロトコルで示したように、ヒト前立腺細胞とマウス前立腺細胞から、疾患関連の前臨床モデルシステムとして成長させることができる。多くのラボでは、有用なカルチャの方法とエンドポイントについて説明しています。しかし、これらの詳細を1つのプロトコルにまとめ、新しいユーザーにとって特に困難なステップを実証したいと考えています。技術が向上するにつれて、前立腺癌オルガノイドは、疾患をモデル化し、治療への応答をモデル化するための精密医療アプローチとして患者のサンプルから成長させることができる。培養条件は前立腺オルガノイドに特異的であるが、エンドポイントの多くは他の組織タイプから適応されている。ユーザーは、このプロトコルの一部をセルの種類に合わせて調整できます。原稿に記載されているように、マトリックスゲルコード96ウェルプレートで上皮細胞を成長させることによって、この実験を開始します。12日後にプレートからオルガノイドを採取するには、マトリックスゲルを乱すことなく井戸から培地を取り除きます。その後、すぐに約200マイクロリットルの中性プロテアーゼを各ウェルに加え、マトリックスゲルと中性プロテアーゼの約1対2の比率で添加します。プレートを摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、ピペットを上下にして機械的に解体し、摂氏37度で20分間再びインキュベートします。インキュベーション後、中性プロテアーゼマトリックスゲル細胞混合物を数ウェルからマイクロ遠心チューブに移します。300回gで300回の遠心分離により細胞を3〜5分間ペレットする。上清を除去し、その後の分析のためにオルガノイドペレットを保存します。埋め込み用の金型を作成するには、1,000マイクロリットルのピペットチップの小さな部分を切り取り、50マイクロリットルを保持するシリンダーを作ります。次に、同じ先端の広い部分から、最初の金型の周りに収まる2番目の広い金型を作ります。コールドブロックを作成するには、接着剤の側面を上にしてテープでアイスパックを包みます。次に、金型をテープに垂直に貼り付けます。処理用の組織学のゲルプラグにオルガノイドを埋め込むには、まず、ハンクのバランス塩溶液の1ミリリットルで以前に得られたオルガノイドペレットを洗浄します。300回gで3〜5分間遠心した後、上清を取り除きます。その後、オルガノイドペレットに30〜50マイクロリットルの液体組織学ゲルを加え、ゆっくりと上下にピペットしてペレットを再中断して穏やかに混ぜます。この混合物をコールドブロックの金型に移し、試料を冷却してプラグに固めます。次に、プランジャーを使用して、小さな金型から大きな金型の中心にプラグを押し出し、プラグの周りに2%寒天を透明にピペットで充填します。サンプルの上部をマークするには、ピペット組織染色色2%寒天をプラグの上に着色します。寒天が冷却されたら、プランジャーを使用してプラグを占体カセットに移します。カセットに鉛筆のラベルを付け、一晩固定するために10%中性緩衝ホルマリンに入れます。翌日、カセットを10%中性緩衝ホルマリンから70%組織グレードのエタノールに移し、さらにパラフィンに埋め込んで処理する。まず、ブロックの底面を10マイクロメートルの厚さでトリミングします。プラグ領域を含むセクションが表示されたら、トリミングを停止します。ミクロトームローターをロックし、氷の上にブロックを戻して冷やします。ブレードを未使用の新しい部分に移動します。そして、ブロックをクランプに戻します。機械のロックを解除し、セクションあたり5マイクロメートルでトリミングを開始します。ピンセットを使用して、セクションを摂氏40度の水浴に移し、広げます。スライドを水に垂直に浸してセクションをその上に移します。次に、明視野顕微鏡下でスライドを観察し、オルガノイドがセクションに存在することを確認します。摂氏45~50度で一晩焼き、原稿に記載されているように染色を進めます。96ウェルマトリックスゲルコーティングプレートの未使用のウェルとオルガノイドを使用して、実験のこの部分を開始します。ウェルの側面にピペットを入れることで、培地とマトリックスゲルの間に空間を残し、オルガノイド培養を中断することなくできるだけ多くの培地を慎重に除去する。トリミングされた1,000マイクロリットルのピペットチップを使用し、PBSでプリウェットして、目的のオルガノイドを含むマトリックスゲルの1滴を作成します。チャンバースライドの真ん中にドロップを分配します。肉眼で、細かいチップピペットを使用してチャンバースライドから余分な培地およびマトリックスゲルを吸引する。ガラスへのオルガノイド付着を促進し、その後の洗浄工程中にサンプルの損失を防ぐために。37°Cインキュベーターに30〜45分間スライドを置きます。皿からの剥離を防ぐためにゆっくりとピペットを作り、1X PBSの200マイクロリットルを加え、オルガノイドを穏やかな揺れで室温で5分間洗浄します。慎重に1X PBSを取り除き、4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを追加します。穏やかな揺れで室温で30分間固定します。PFAでは、このプロトコルで説明されているように、洗浄し、その後のパーメアビライゼーションと染色手順を進めます。マウントとイメージはすぐに。染色されていない切断スライドは、ヒトの一次前立腺オルガノイドをはっきりと示していますが、染色されていないドライスライドでは、オルガノイドは半透明に見え、明視野顕微鏡下で検出するのが難しくなります。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、アグレッシブなピペットニング、適切に処理されたオルガノイドと比較して間違った処理プロトコルなどの誤った取り扱いによる壊れたヒト一次前立腺オルガノイドを示す。ヒト一次前立腺オルガノイドをホルマリン固定、パラフィン埋め込み、切り離し、基底シトケラチン5とルミナルサイトケラチン8で染色し、基底p63および発光サイトケラチン8、共焦点顕微鏡で画像化した。全身に取り付けられたヒト初立前立腺オルガノイドを、基底シトケラチン5または発光サイトケラチン8で染色し、タロイジンおよびDAPIで対数化し、共焦点顕微鏡で画像化した。全身に取り付けられたヒト初代前立腺細胞オルガノイドを蛍光標識されたエドゥで染色し、Hoeschtでカウンター染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。手順を通してオルガノイドを視覚化することが重要です。セクションを収集した後、スライド上のサンプルを視覚化し、オルガノイドを全体取り付け中に観察することを確認してください。マトリックスゲルからオルガノイドを収集した後、それらを完全にマウントして市販のアッセイを使用したり、フローサイトメトリーまたは単一細胞シーケンシングのために単一細胞に解離することができます。3D培養は、ラボディッシュの設定で組織を研究する新しい方法を研究者に提供します。それは、器官形成に適用することができ、または患者の疾患の病理を理解するために。患者のサンプルを扱う場合は、常に注意を払い、血液媒介病原体暴露の可能性として材料を処理してください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

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A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

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