Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
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우리는 UIC Biorespository 멤버, 닥터 클라라 Valyi-Nagy, 알렉스 Susma, 뿐만 아니라 1 차 셀 문화에 대 한 조직 획득의 촉진에 대 한 박사 마이클 Abern, 다니엘 Moreira, 그리고 시몬 Crivallero, 비뇨기과 감사합니다. 우리는 그들의 조직 연구에 기부 UIC 비뇨기과 환자를 감사 합니다. 이 작품, 부분에 부의 방어 전립선 암 연구 프로그램 건강 불균형 아이디어 상 PC121923 (Nonn)와 임상의 UIC 센터 및 임상 및 변환 과학자 (번역 과학 Pre-doctoral 교육에 의해 투자 되었다 PECTS) 프로그램 (McCray와 리차드)는 시카고 건강 주식 공동 (Nonn와 리차드)로 알려져 있는 국립 보건원의 국립 암 연구소, 보조금 번호 U54CA202995, U54CA202997, 및 U54CA203000에 의해. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 건강의 국가 학회 또는 국방부의 공식 의견을 대표 하지는 않습니다.

<ol>
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저자는 공개 없다.

Organotypic 문화는 업과 환경 체 외에서 의 편의와 조직에 대 한 흥미 진 진한 새로운 방법입니다. 현재, 실험실 organoids 여러 종류의 다양 한 끝점에 대 한 조직에서 성장. 이 문서에서 설명 하는 방법 유용한 끝점 요약 및 새로운 기술을 완전히 3D 기본 전립선 세포 배양의 특성을 강조.
미디어 인간 기본 전립선 세포 organoids5,,613양성을 위한 조리법의 다양 한이 있다. 모두 실용적이 고 유사한 결과 얻기 위해 하는 동안 KSFM에 기초를 둔 미디어13 사용 하 여 최소한의 첨가제 그것 설명 그래서 여기. 또한, 서류 10%에서 75%로 문화 전립선 organoids5,,613매트릭스 젤에 대 한 여러 농도 사용 하 여 출판 되었습니다. 매트릭스 젤 비싼 시 약 때문에 33% 매트릭스 젤 장기 (2-3 주), 육성 하기 위해 충분 한 것 표시 되었습니다 가능한, unclumped organoids13, 이것이 권장된 농도. 그러나, 매트릭스 젤 많은 숫자, 그래서이 한다 고려 될 때 도금 사이 단백질 농도에서 달라질 수 있습니다. 그것은 또한 많은 사이 불일치를 줄이기 위해 여러 실험에서 사용 하기 위해 대량에서 매트릭스 젤을 구입 하는 것이 좋습니다. 다른 실험실 96 잘 접시 잘5코팅 대신 방울 같은 매트릭스 젤, 도금에 대 한 다양 한 포맷을 출판 했습니다. 두 방법 모두 형성 가능한 organoids, 하지만 여기에 설명 된 형식 수 있습니다 더 부족 하 게, 도금 하는 셀에 대 한 더 큰 organoids13로 셀의 확장을 촉진을 보여줘 왔다. 그러나, 도금 밀도 최적화 되어야 합니다 환자 전용 대형 효율성 기반으로. 매트릭스 젤 증가율 감소, 페 놀 레드-무료, 높은 농도, 등등을 포함 하 여 여러 형태로 제공 됩니다. 성장 인자 감소 것이 좋습니다 문화 조건, 정의 및 페 놀 레드 무료 GFP를 표현 하는 셀 또는 z-스택 이미지 캡처를 포함 하는 실험에서 작업할 때 좋습니다. 그것은 매트릭스 젤 실내 온도에 신속 하 게 굳은 매트릭스 젤 도금 단계 차가운 약으로 수행 해야 합니다.
Organoids 다른 실험적 치료에서 성장 될 수 있습니다 변경 모양, 그래서 밝은 필드 이미징 연구 관찰된 형태학 고기에 널리 사용 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 기록 하 고 영역 또는 모양 측정은 도전 두 가지 이유: 이미지 캡처 및 3 차원 샘플 2) 적용 지역 등 2 차원 매개 변수 중 선택 1) 바이어스. 이미지 캡처의 한 전략 임의의 필드를 기록 하 고 해당 필드에 organoids의 미리 결정 된 수를 측정 하는 것입니다 하지만이 선택, 동안 바이어스를 만들 수 있으며 선택한 필드에서 모든 organoids 초점에서 되지 않을 수 있습니다. 전체-잘 이미징 96 잘 microplate 형식에 대 한 최적화 된 관심의 전체 organoid 인구를 수집 하 여이 샘플링 바이어스를 제거 합니다. 그러나, 반면에 현미경 목표에 따라 여러 분야를 수집 하 고 전체 잘 이미지를 얻기 위해 바둑판식으로 할 수 있습니다. 하나의 z-비행기12의 경우, 측정 영역을 설명 하는 일부 실험실 하지만 초점에 모든 organoids을 잡으려고 그것 수집 하 고 단일 EDF 이미지13에 여러 비행기를 쌓아 좋습니다. 경우에 따라 매트릭스 젤에 초승달 모양의 이미지를에서 vignetting을 발생할 수 있습니다 그리고 배경 교정 방법 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 적용할 필요가 있습니다. 정확한 볼륨은 organoid 크기;에 대 한 가장 적절 한 측정 그러나,이를 정확 하 게, 여러 z-스택 이미지로 어렵습니다. 순환 및 최대/최소 비율와 같은 다른 유용한 형태학 크기 전체-그럼 EDF 이미지에 모든 organoids에서 쉽게 계산할 수 있습니다. 함께, 이러한 방법을 샘플링 바이어스 도전을 극복 하 고 3D 공간에서 3D 개체에서 2D 매개 변수 측정 사용.
포 르 말린 고정 및 파라핀 organoids의 포함 되며 고 오신 (H & E), immunohistochemical (IHC), 및 immunofluorescent (IF) 얼룩 시각화 및 분석6,11, 에 대 한 일반적인 방법입니다. 그러나 20.,이 기술을 설명 하는 게시 포함 프로세스에 대 한 포괄적인 내용을 부족. 또한, organoids 파라핀 블록 내에서 찾기 어려운 수 있습니다. 일부 실험실 미리 trypan와 organoids11단면 동안 위치에 원조를 포함 하기 전에 블루 얼룩. 여기 설명 하는 방법을 단면 효율을 증진을 포함 하는 동안 organoid/조직학 gelplug의 방향에 대 한 조직학 염료를 사용 하 여를 통합 합니다. H & E 슬라이드의 괴 사, 핵, 질감과 확산, 시험을 촉진 하 고 따라서 셀 영역에 걸쳐 건강 한 되도록 organoid 문화에 대 한 필수 끝점 이어야 한다. Organoid 문화의 힘은 샘플을 더 나은 환자 조직 vivo에서 세포의 다른 유형의 혼합물의 구성 되어 있다. 예를 들어 전립선, 기저와 luminal 세포는 전립선 organoids5, 2D 부족 luminal 차별화8성장 세포 동안에. Organoid 차별화, 평가 연구원 평가 CK5 등 p63 기저 표식과 같은 안 드로 겐 수용 체와 CK88luminal 표식 것이 좋습니다. 관심의 다른 실험적인 단백질 얼룩 이러한 기술을 사용 하 여 공부도 수 있다.
비록 FFPE 섹션 내부 구획을 통해 조직학 방법 (H & E, IF, IHC)에 있는 셀의 수, 이미지는 횡단면, 그리고 organoid 모양 포함 프로세스에 의해 변경 될 수 있습니다. 전체-마운트 얼룩 얼룩을 제자리에서형태학 고기를 보존 하 고 허용 하는 단백질 지 방화의 이미지 관찰 organoid 수 있습니다. 전체 설치 전체 조직 또는 전체 동물 표본, zebrafish 또는 마우스 배아 등 얼룩을 활용 하는 도구 이며 쉽게 organoids에 대 한 적응. 여기에 설명 된 기술은 마헤외. 여 프로시저에서 수정 된 11, 초기 성장 및 얼룩에 대 한 챔버 슬라이드에 직접 위장 organoids의 문화를 자세히 설명 하 고 전체 부모 문화 정착 필요. 여기에 설명 된 메서드 얼룩의 시간에서 챔버 슬라이드에 대 한 관심의 단일 organoid (또는 organoids)의 이전을 포함 한다. 부모 문화의 정착 없이 지속적인 실험에서 전체 산 분석에 대 한 개별 organoids의 선택 수 있습니다. 그것은 permeabilization와 표본을 통해 침투 되도록 1 차 및 이차 항 체에 대 한 보육 시간을 최적화 하는 데 필요한 전체 마운트 얼룩을 수행할 때 (어디 하나 이상의 일에서 권장). 일단 몇 군데 통해 confocal 현미경 검사 법, 3D 렌더링 시각화 및 특정 단백질의 지역화 샘플에 존재 하는 긍정적으로 얼룩진된 셀의 수를 계산을 생산 수 있습니다. Cytometry 기저, luminal의 인구를 계량 하기 유용한 끝점 또는 줄기 세포5,14. 이 세포는 매트릭스 젤에서 복구 하 고 부드럽게 얼룩에 대 한 해리. 사용자가 현재 문학에 따라 분리에 대 한 적절 한 마커를 선택 신중 하 게 해야 합니다. 인간의 기본 전립선 상피 세포에 대 한 CD26 및 CD49f는 적합 한 luminal 기저 마커, 각각5,21.
요약,이 프로토콜은 인간의 기본 전립선 organoid 성장, 수집, 및 실험적인 끝점을 자세히 설명합니다. 메모의, 설명 설치 기술 일반적으로 형광 프로브 기반 실험 확산19, apoptosis, subcellular 세포 기관이 얼룩 보고 같은 2D 셀에 대 한 고용 하는 다른 분석 실험의 다양 한에 적용할 수 있습니다. 또한, 수집 및 분리 방법은 여기에 설명 된 단일 셀 RNA 시퀀싱18에 대 한 준비에 활용 될 수 있습니다. 이 소설, 연구자 최적화 하 고 미래에 찾아보기 수 있는 고 충실도 끝점의 다양 한 가능성을 보여 줍니다.

Organoids는 organogenesis 및 질병 연구에 귀중 한 도구입니다. 그들은 동물 모델을 덜 비싼 대안을 제공 하 고 환자 파생 된 organoids 맞춤된 의학1,2,3에 대 한 전략으로 발전 하 고 있습니다. 이 3 차원 (3D) 문화 시스템 기질 구성 요소 (매트릭스 젤)4의 젤으로 시드 줄기 또는 조상 세포 조직에서 수확 (유도 만능 줄기 세포) 포함. 세포 증식 하 고 차별화, 셀룰러 계층 구조와 관심의 기능 단위의 장기의 형태를 정리 하는 organotypic 구조체에 발생 합니다. Organoids 다양 한 장기, 침 샘, 위, 소장, 간, 전립선, 폐 및 두뇌4등에서 발생 하는 셀을 사용 하 여 재배 되었습니다. 비록 수많은 프로토콜 전립선 organoids5,6을 설정 하는 단계를 설명 하는, organoids에서 양적 끝점을 달성 하는 방법에 자세한 방법을 찾기 위해 도전 이다. 이 종이 인간의 기본 전립선 세포에 대 한 개발 하는 방법을 요약 하 고 세부 organoid 고기를 평가 하기 위해 제안 된 끝점의 시리즈. 이러한 기술은 전립선 organoids 최적화 했다 고 다른 3D 셀 문화에 적용 될 수 있습니다.
전립선 organoid 문화는 귀중 한 생체 외에서 모델을 사용 하 여 단층 문화의 한계 없다 설립 불멸 하 게 셀 라인으로 최근에 나왔다. 양성 전립선 상피와 전립선 암 모델에 생체 외에서 불멸 하 게 세포를 사용 하 여 도전 이다. 양성 세포의 수는 제한, 그리고 모든 oncogenes7변화 받은. Monolayers에 기본 전립선 상피 세포 하지 luminal 세포로 분화 하 고 안 드로 겐 수용 체8부족. 전립선 암 세포 선의 대다수는 기능 안 드로 겐 수용 체, 초기 질병 상태, 및 부족 키 유전자 변화 환자 종양9에서 발견 되었습니다 중요 한 중재자를 필요가 없습니다. 전립선 organoid 문화 양성 상피에서 쉽게 재배 될 수 있으며 줄기 세포 속성, 조상 세포, 분화, 및 microenvironment4,5에 실험 변경의 효과 공부 하 고 귀중 한. 전립선 암 organoids 환자 질환과 치료10에 대 한 응답을 모델링 하는 정밀 의학 접근의 일환으로 성장 수 있다.
이 프로토콜은 다양 한 세포 유형, 사용 하는 기존 프로토콜에서 컴파일 되었습니다 하지만 그것은 여기 인간의 기본 전립선 세포에서 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 그것은 칭찬 Sawyers, Clevers, 고 쉔에 의해 제시 된 프로토콜5,6 , 뿌리고, 밝은 필드 이미징, cryopreservation, 성장과 전립선 쥐와 인간 organoids의 RNA와 DNA 격리를 설명 하는. 전체-마운트 프로토콜 마헤 외 에서 수정 11, 위장 상피 organoids를 사용 하 고 설명 합니다 라이브 이미징 및 냉동 고 포함 파라핀. Borten 외. 12 유 방, 결 장, 그리고 밝은 필드 영상에서 대 장 암 organoid 형태학의 분석을 설명합니다. 또한, 리차드는 외. 13 전립선 organoids의 형태 론 적 평가 대 한 메서드를 사용. 마지막으로, Hu 외. 14 챔버 슬라이드를 organoids immunofluorescent 단일 셀과 교류 cytometry 분석 분야의 분산에 얼룩 전에 하룻밤 접착 전립선의 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 목표 셀 시드; 포함 한 프로토콜로이 기술적으로 도전적인 방법 충분 한 세부 사항에서 설명 하는 것입니다. 미디어와 매트릭스 젤 유지 보수; cytometry;에 대 한 셀의 컬렉션 RNA, DNA, 단백질 추출; morphologic 평가 밝은 필드 z-스택 분석; 포함, 처리 및 조직학 얼룩;에 대 한 단면 그리고 면역 형광 또는 형광등 조사 분석에 대 한 전체 설치. 생물 학적 관련성 및 이러한 다양 한 끝점의 해석 실험 설계 및 분석에 사용 되는 항 체 사이에서 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜의 활용을 통해 사용자가 끝점의 도구 키트와 함께 실험을 설정할 준비가 느껴야 합니다.
인간의 기본 전립선 상피 (사전) 세포 프로토콜 Peehl15,16 에서 설명 하 고 앞에서 설명한17, (4)까지 통행의 제한 된 수를 유지 하 여 실험실에서 설립 되었다 그러나 그들은 또한 상업용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. Hepatocyte 미디어 기반 혈 청 무료6, KSFM 기반13및 R-spondin 1 조절5 미디어 모두 성공적으로 organoids을 생산 하는 데로 게시 됩니다. KSFM 기반 그래서 여기 설명 첨가제의 적은 번호가 필요 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

이 문서에서는 3 차원 (3D) 경작, 처리, 및 인간의 기본 전립선 organoids의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 과정의 미디어 변경 organoids로 확장을 육성 하기 위해 96-잘 microplate에 3D 매트릭스 젤에 띄엄띄엄 상피 세포의 시드를 포함 한다. 형태는 다음 z 스택 이미지의 전체 잘 포착 하 여 평가 됩니다. Z 스택의 압축은 organoids 출력, 순환, 진원도, 지역 등의 다양 한 계량 측정은 단일 포커스 이미지를 만듭니다. DNA, RNA 및 단백질 organoids 매트릭스 젤에서 복구에서 수집할 수 있습니다. 관심의 세포 인구 organoid 분리에 의해 평가 될 수 있다 고 cytometry 흐름. 포 르 말린-고정-파라핀-포함 (FFPE) 단면 이어서 조직학 평가 및 항 체 얼룩이 지기 사용 됩니다. 전체-마운트 immunofluorescent 얼룩 organoid 형태를 유지 하 고 제자리에organoids 단백질 지 방화의 관찰을 용이 하 게. 3D organoids에 대 한 2 차원 단층 세포에 전통적으로 사용 되는 상업 분석 실험을 수정할 수 있습니다. 함께 사용이 프로토콜 기술을 전립선 organoid 성장, morphologic 특성 및 분화 마커의 표현 척도를 강력한 도구를 제공 합니다.

인간의 기본 전립선 organoids의 성공적인 문화, 시 형태학과 차별화 수 수 평가 밝은 필드 이미지 분석 및 FFPE 및 전체 마운트 얼룩 기법을 사용 하 여.
밝은 분야 심상 붙 잡음의 과정은 그림 1A에 나와 있습니다. Organoids 3D 매트릭스에 성장 하 고 다른 초점 비행기에 걸쳐 분산 됩니다. 관찰 하기 위해 초점에 organoids 많은 비행기를 통해, 그것은 하나의 z-비행기 (그림 1B, 왼쪽) 대신 EDF 이미지 (그림 1B, 오른쪽)을 사용 하 여 좋습니다. 연구실에서 organoids 다른 실험 조건 하에서 성장 형태에 변화 될 수 있습니다. 영역을 사용 하 여, 순환 (에 의해 얼마나 비슷한는 organoid 원 정의) 및 최대/최소 반경 (길이 측정) 사용자 organoid 크기와 모양의 표시 주고 형태학의 정량 판독을 제공. 이 측정의 유용성을 강조, 유사한 지역 하지만 각기 다른 형태와 organoids의 대표 이미지 그림 1C, 있는 긴 organoid 덜 순환 되며 구형 보다 더 큰 최대/최소 비율에 표시 됩니다. organoid입니다.
조직학에 대 한 organoids를 포함 하는 것은 샘플의 내부를 관찰 하 고 그 괴가 한 organoid의 핵심 내 존재를 유용한 끝점입니다. 그림 2AB, C에서이 프로세스 및 밝은 분야 현미경 흠 없는, sectioned 샘플의 대표적인 결과 대 한 워크플로 제공 됩니다. 그림 3A (왼쪽)에 비해 제대로 분실된 organoid 손으로 그림 3A (오른쪽)와 그림 3B에서 organoids를 보여 줍니다. 샘플의 분화 상태를 확인, 기저 세포 마커 (cytokeratin 5 및 p63)8 luminal 셀 표식 (cytokeratin 8)8함께 보고 하는 것이 좋습니다. Organoids 얼룩을 바란다면 제자리에, 전체 산 얼룩이 지는 편리한 대안을 이며 이러한 대표적인 결과 그림 3C디에서 제공 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> 그림 1: 3D 문화에서 organoids의 형태 평가. ( A) 인간의 기본 전립선 organoids 전송 된 빛에 의해 인수에 대 한 이미지 수집 및 압축 워크플로 거꾸로 현미경을 동력으로 X / Y 검색 단계와 동반자 소프트웨어. (B) 단일 z-스택 (왼쪽된) 대의 대표 이미지. 보여주는 여러 z-스택 단일 투사 이미지에 결합 될 때 더 많은 organoids 초점에는 인간의 기본 전립선 organoids의 전체 음 샘플의 EDF 이미지 (오른쪽) (눈금 막대 = 1000 µ m). (C) 같은 지역에 있는 형태학 상으로 다른 인간의 기본 전립선 organoids의 지역, 순환, 및 최대/최소 비율을 위한 대표 이미지 (눈금 막대 = 200 µ m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> 그림 2: Organoid 흐름과 결과 구분 하는 대표를 포함. ( A) 인간의 기본 전립선 organoid 워크플로 포함. (B) agar (녹색 화살표), 조직학 젤 (검은색 화살표), (파란색 화살표), organoids (빨간색 화살표)을 묘사한 밝은 분야 현미경 인간의 기본 전립선 organoids를 포함 하는 흠 없는, 신선한 슬라이드의 대표 이미지 (눈금 막대 1000 μ = m). (C) 갓 잘라 슬라이드 (왼쪽) vs흠 없는. 흠 없는 건조 슬라이드 (오른쪽), organoids (빨간 화살표) 건조 하 때 반투명 표시 (눈금 막대 = 500 µ m) 밝은 분야 현미경 분별 힘들어 하 고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> 그림 3: sectioned 및 전체 실장 organoids에 조직학 얼룩. (A) H & E 잘 처리 organoid (오른쪽) 옆 (공격적 pipetting, 잘못 처리 프로토콜, 왼쪽) 실패에서 깨진된 인간의 기본 전립선 organoid의 얼룩 (눈금 막대 = 100 µ m). (B) , 포 르 말린 고정 파라핀 포함 된 인간의 기본 전립선 organoid sectioned, 그리고 8 (위)와 기저 p63 luminal cytokeratin 8 (아래) 기저 cytokeratin 5 또는 luminal cytokeratin 얼룩이 지 고 confocal 현미경 (몇 군데 눈금 막대 = 100 µ m). (C) 는 전체 탑재 인간의 기본 전립선 organoid 기저 cytokeratin 5 또는 luminal cytokeratin 8 얼룩이 지 고 phalloidin와 DAPI, confocal 현미경으로 몇 군데 counterstained (눈금 막대 = 100 µ m). (D) 붙일 물 전체 탑재 인간 기본 전립선 세포 organoid 듀 고 카운터 Hoescht, confocal 현미경으로 몇 군데 물 (눈금 막대 = 500 µ m) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

전립선 오르가노이드는 발달과 질병을 공부하기위한 생체 외 시스템입니다. 그들은 불멸의 세포주 문제를 극복하고 동물 모델에 대한 저렴한 대안을 제공합니다. 그(것)들은 인간적인 전립선 세포에서, 우리가 이 프로토콜에서 보여주었듯이, 마우스 전립선 세포, 질병 관련 전 임상 모형 시스템으로, 성장될 수 있습니다.많은 실험실에서 유용한 문화 권 법과 끝점을 설명했습니다. 그러나 우리는 하나의 프로토콜에 이러한 세부 사항을 함께 가져와 새로운 사용자를위한 특히 어려운 단계를 보여 줄 수 있기를 바랍니다. 기술이 향상됨에 따라 전립선암 오르가노이드는 환자 샘플에서 치료 에 대한 모델 및 반응에 대한 정밀 의학 접근법으로 재배될 수 있습니다.배양 조건은 전립선 오르가노이드에 특정, 그러나 끝점의 많은 다른 조직 유형에서 적응 되었습니다. 사용자는 이 프로토콜의 일부를 셀 유형의 관심에 맞게 조정할 수 있습니다. 원고에 설명된 바와 같이 매트릭스 겔 코딩 96-웰 플레이트에서 상피 세포를 성장시킴으로써 이 실험을 시작합니다.12 일 후에 플레이트에서 오르가노이드를 수집하려면 매트릭스 젤을 방해하지 않고 우물에서 배지를 제거하십시오. 그런 다음 즉시 약 200 마이크로리터의 중성 프로테아제에 매트릭스 겔의 1 대 2 비율로 중성 프로테아제에 대해 잘 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 20분 동안 접시를 배양합니다.그런 다음 파이펫을 위아래로 위아래로 사용하여 혼합물을 기계적으로 분리하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 다시 배양합니다. 인큐베이션 후, 중성 프로테아제 매트릭스 젤 세포 혼합물을 몇 가지 우물에서 마이크로센트심리립지 튜브로 이송한다. 3~5분 동안 300배 g의 원심분리로 세포를 펠렛합니다.상체를 제거하고 후속 분석을 위해 오르가노이드 펠릿을 저장합니다. 포함형 금형을 만들려면 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁의 작은 부분을 잘라 50 마이크로리터를 보유한 실린더를 만듭니다. 그런 다음 동일한 팁의 넓은 부분에서 첫 번째 금형 주위에 맞는 두 번째 더 넓은 금형을 만듭니다.차가운 블록을 만들려면 접착제 면으로 아이스팩을 테이프로 감쌉니다. 그런 다음 금형을 테이프에 수직으로 부착합니다. 처리를 위한 조직학 젤 플러그에 오르가노이드를 포함하기 위하여, 먼저 행크의 균형 잡힌 소금 용액의 1 밀리리터로 이전에 얻은 오르가노이드 펠릿을 세척하십시오.3~5분 동안 300배 g에서 원심분리한 후 상체를 제거합니다. 그런 다음 30~50마이크로리터의 액체 조직학 젤을 오르가노이드 펠릿에 넣고 천천히 위아래로 배관하여 부드럽게 섞어 펠릿을 재보펜합니다. 이 혼합물을 콜드 블록의 금형으로 옮기고 시편이 냉각되어 플러그로 응고할 수 있도록 합니다.다음으로 플런저를 사용하여 작은 금형의 플러그를 더 큰 금형의 중심으로 밀어 내고 플러그 주위에 2% 한고를 투명하게 피펫팅하여 채웁니다. 샘플의 상단을 표시하려면 플러그 위에 파이펫 히스토알로이트 염색 2% 천을 표시합니다. 한천이 식으면 플런저를 사용하여 플러그를 히스토로지 카세트로 옮길 수 있습니다.카세트를 연필로 라벨로 붙이고 10% 중성 버퍼링 된 포르말린에 넣고 하룻밤 고정하십시오. 다음 날, 카세트를 10% 중성 완충 포르말린에서 70%의 조직학 등급 에탄올로 옮기고, 카세트를 더 처리하고 파라핀에 포함시켰다. 먼저 블록의 베이스를 10 마이크로미터 두께로 트리밍합니다.플러그 영역이 포함된 섹션이 나타나면 트리밍을 중지합니다. 마이크로톤 로터를 잠그고 블록을 얼음으로 다시 옮겨 서늘하게 합니다. 블레이드를 사용하지 않은 새 부분으로 이동합니다.그리고 블록을 다시 클램프로 옮기습니다. 기기의 잠금을 해제하고 섹션당 5마이크로미터로 트리밍을 시작합니다. 핀셋을 사용하여 섹션을 섭씨 40도의 수조로 옮기고 확산되도록 하십시오.슬라이드를 물에 수직으로 찍어 섹션을 위로 옮깁니다. 그런 다음 밝은 필드 현미경 아래에서 슬라이드를 관찰하여 오간노이드가 섹션에 있는지 확인합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 45~50도에서 구운 다음 원고에 설명된 대로 염색을 진행합니다.오가노이드가 있는 96웰 매트릭스 젤 코팅 플레이트의 사용하지 않은 우물로 실험의 이 부분을 시작합니다. 우물의 측면에 대해 파이프를 하여 미디어와 매트릭스 젤 사이의 공간을 남기고, 유기성 문화를 방해하지 않고 가능한 한 많은 미디어를 조심스럽게 제거하십시오. 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 PBS로 미리 젖어 관심 있는 오르가노이드를 함유한 매트릭스 젤 한 방울을 그립니다.챔버 슬라이드의 중간에 드롭을 분배합니다. 육안으로, 미세 한 파이펫을 사용하여 챔버 슬라이드에서 여분의 미디어와 매트릭스 젤을 흡인. 유리에 오르가노이드 준수를 촉진하고 후속 세척 단계 동안 샘플의 손실을 방지합니다.슬라이드를 섭씨 37도 인큐베이터에 30~45분간 배치합니다. 접시에서 분리를 방지하기 위해 천천히 파이프, 부드러운 흔들림과 실온에서 5 분 동안 오르가노이드를 세척하는 1X PBS의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 조심스럽게 1X PBS를 제거하고 4 %의 파라 포름 알데히드의 200 마이크로 리터를 추가합니다.부드러운 흔들림으로 실온에서 30분 간 고정하십시오. PFA에서, 세척하고 이 프로토콜에 의해 설명된 대로 후속 투과화 및 염색 단계를 진행합니다. 즉시 마운트 및 이미지.얼룩이 없는 갓 잘라낸 슬라이드는 인간의 1차 전립선 비건구를 명확하게 보여주는 반면, 염색되지 않은 드라이 슬라이드에서는 오르가노이드가 반투명하게 나타나고 밝은 필드 현미경으로 감지하기가 더 어렵습니다. Hematoxylin 및 eosin 염색은 잘 처리된 오르가노이드에 비해 공격적인 파이펫팅, 잘못된 처리 프로토콜과 같은 잘못된 취급에서 깨진 인간 1차 전립선 오르간로이드를 보여줍니다. 인간 1차 전립선 오르간노이드는 포르말린 고정, 파라핀 임베디드, 단면, 기저 사이토케라틴 5 및 발광 사이토케라틴 8, 기저 p63 및 발광 사이토케라틴 8으로 염색되었으며, 공초점 현미경으로 이미지화되었다.전체 장착 된 인간 기본 전립선 오르간노이드는 기저 사이토케라틴 5 또는 발광 사이토케라틴 8으로 염색되었으며, phalloidin및 DAPI로 대응하고 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. 전체 장착 된 인간 1 차 전립선 세포 오르가노이드는 형광 라벨 에듀로 염색하고 Hoescht로 반소하고 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 오르가노이드를 시각화하는 것이 중요합니다.섹션을 수집한 후 슬라이드의 샘플을 시각화하고 전체 장착 중에 오르가노이드를 관찰해야 합니다. 매트릭스 젤에서 오르가노이드를 수집한 후, 이를 전체적으로 마운트하고 상업적 분석서를 사용하거나 유동 세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱을 위해 단일 세포로 해리할 수 있습니다. 3D 배양은 연구자들이 실험실 접시의 설정에서 조직을 연구하는 새로운 방법을 제공합니다.그것은 유기 발생에 적용 될 수있다, 또는 환자의 질병의 병리를 이해. 환자 샘플로 작업 할 때, 항상 주의를 기울이고 혈액 매개 병원체 노출의 가능성으로 재료를 처리합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

연구

생체공학

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...