Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy og Alex Susma, samt urologer, Dr. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, for tilrettelegging av vev kjøp for primært cellekulturer. Vi takker UIC urologi pasienter for donerer vev til forskning. Dette arbeidet ble finansiert, delvis av den avdeling av forsvarer prostata kreft forskning Program helse forskjeller ideen Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for klinisk og oversettelse naturfag for kliniske og translasjonsforskning forskere (Pre-doctoral PECTS) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant tall U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kjent som Chicago helse egenkapital samarbeidet (Nonn og Richards). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health eller forsvarsdepartementet.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Organotypic kultur er en spennende ny metode for recapitulating vev av et i vitro miljø. Foreløpig vokse labs organoids fra mange typer vev for ulike endepunkter. Metodene som er beskrevet i denne artikkelen oppsummerer nyttig endepunktene og markere nye teknikker for å fullt karakterisere 3D primære prostata cellekulturer.
Det finnes en rekke medier oppskrifter dyrke human primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle oppnå levedyktig og sammenlignbare resultater, bruker KSFM-baserte medier13 minimal tilsetningsstoffer slik det er beskrevet her. I tillegg har artikler blitt publisert i flere konsentrasjoner matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrisen gel er en dyr reagens, og 33% matrix gel har vist seg å være tilstrekkelig til å dyrke langsiktige (2-3 uker), levedyktig, unclumped organoids13, dette er den anbefalte konsentrasjonen. Men kan matrix gel varierer i protein konsentrasjon mellom partinumre, så dette bør tas i betraktning når plating. Det anbefales også å kjøpe matrix gel i bulk for bruk over flere eksperimenter for å redusere inkonsekvens mellom. Andre labs har publisert forskjellige formater for plating matrix gel, som dråper i stedet for belegg en 96-brønns plate med5. Begge metodene danne levedyktige organoids, men formatet beskrevet her gir cellene til å være belagt mer tynt, som har vist seg å fremme ekspansjon av celler i større organoids13. Imidlertid bør plating tetthet optimeres basert på pasient-spesifikke formasjon effektivitet. Matrix gel er tilgjengelig i mange formater, inkludert vekst faktor-redusert, fenol red-fri, høy konsentrasjon, osv. Vekstfaktor-redusert anbefales for definert oppdrettsforholdene, og fenol red-fri anbefales når du arbeider med celler som uttrykker GFP eller eksperimenter som involverer z stabel bildeoppløsning. Det er viktig at alle matrise gel plating trinnene utføres med iskald reagenser, som matrise gel stivner raskt ved romtemperatur.
Organoids dyrket under annerledes eksperimentell behandlinger kan resultere i endringer for figuren så lyse-feltet imaging er mye brukt til å studere observert morfologiske fenotyper. Likevel, opptak og kvantifisere området eller figur er en utfordring for to grunner: 1) utvalget bias bildeoppløsning og 2) bruker en todimensjonal parameter som området et tredimensjonalt utvalg. En strategi for bildebehandling er å registrere et tilfeldig felt og måle et forhåndsbestemt antall organoids i dette feltet, men dette kan skape bias under valget, og alle organoids i det valgte feltet kan ikke være i fokus. Hel-og bildebehandling optimalisert for 96-brønnen microplate formatet eliminerer denne prøvetaking skjevhet ved å samle hele organoid befolkningen av interesse. Imidlertid avhengig av mikroskopet målene på hånden må flere felt samles inn og side ved side for å få en hel-og bilde. Noen labs har beskrevet måle området fra en enkelt z-plane12, men for å fange alle organoids i fokus, er det anbefalt å samle og stable flere fly i en enkelt EDF-image13. I noen tilfeller en menisk i matrix gel forårsake vignettering i bildet, og bakgrunnen korreksjonsmetoder må brukes ved hjelp av analyseprogramvare. Nøyaktig volum ligger passende målene for organoid størrelse; Dette er imidlertid vanskelig å nettopp ha, selv med flere z-stakk bilder. Andre nyttige morfologiske dimensjoner, for eksempel sirkularitet og maksimum/minimum forhold, kan lett bli beregnet fra alle organoids i en hel-og EDF bilde. Sammen disse metodene overvinne prøvetaking bias utfordringer og aktiverer måling av 2D parameterne fra 3D-objekter i et 3D-rom.
Formalin fiksering og parafin innebygging av organoids er en vanlig måte å få hematoxylin og eosin (H & E), immunohistochemical (IHC) og immunofluorescent (hvis) flekker for visualisering og analyseverktøy6,11, 20. men publikasjoner som har beskrevet denne teknikken mangler omfattende informasjon om innebygging prosessen. I tillegg kan finne organoids i parafin blokken være utfordrende. Noen labs pre flekken organoids med trypan blå før innebygging for å hjelpe sted under snitting11. Metoden beskrevet her omfatter bruk av en histologiske fargestoff for retningen av organoid/histology gelplug under innebygging for å fremme effektiv snitting. H & E lysbilder rette undersøkelse av nekrose, kjernefysiske tekstur og spredning, og dermed bør det være et obligatorisk endepunkt for organoid kultur slik at cellene er sunt i hele området. En styrke for organoid kultur er at prøver består av en heterogen blanding av celler som ligner bedre i vivo pasienten vev. I prostata, for eksempel finnes både basal og luminal celler i prostata organoids5, mens celler dyrket i 2D mangel luminal differensiering8. For å vurdere organoid differensiering, anbefales det at forskere vurdere basale markører som CK5 og p63 og luminal markører som androgen reseptorer og CK88. Noen andre eksperimentelle proteiner rundt kan også studeres disse flekker teknikkene.
FFPE deler tillater visualisering av cellene er bosatt i indre rommet via histologic metoder (H & E, hvis IHC), bilder er begrenset til tverrsnitt og organoid form kan endres av innebygging prosessen. Hele-mount flekker kan en organoid farget og observert i situ, bevare morfologiske fenotyper og tillater bilder av protein lokalisering. Hele-montering er et verktøy benyttet til stain hele-vev eller hele-dyr prøver, som sebrafisk eller mus fosteret, og er lett tilpasses for organoids. Teknikken er beskrevet her ble endret fra prosedyren av Mahéet al. 11, som viser den opprinnelige veksten og kultur av gastrointestinal organoids direkte i et kammer lysbilde til farging, og krever fiksering av hele overordnede kultur. Metoden skissert her innebærer overføring av en enkelt organoid (eller organoids) av interesse på et kammer lysbilde ved flekker. Dette gjør utvalget av individuelle organoids for hele-mount analyse i et pågående eksperiment uten fiksering av overordnede kultur. Når du utfører hele-mount flekker, er det nødvendig å optimalisere permeabilization og inkubasjon tiden for primær og sekundær antistoffer å sikre penetrasjon i prøven (hvor som helst fra én eller flere dager anbefales). Når fotografert via AC confocal mikroskopi, kan 3D-gjengivelser produseres for å aktivere visualisering og lokalisering av et bestemt protein og beregne antall positivt farget celler i et utvalg. Flowcytometri er et nyttig sluttpunkt å kvantifisere bestander av basale, luminal, eller stamceller5,14. Dette er celler utvinnes fra matrix gel og forsiktig avstand til farging. Brukere bør nøye velge riktig markører for å skille basert på gjeldende litteratur. Menneskets primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnet luminal og basal markører, henholdsvis5,21.
I sammendraget detaljer denne protokollen menneskelige primære prostata organoid vekst, innsamling og eksperimentelle endepunktene. Av notatet, kan montering teknikken beskrevet brukes til en rekke andre analyser som brukes vanligvis for 2D celler, for eksempel fluorescerende probe-baserte eksperimenter ser på spredning19apoptose og subcellular organelle flekker. Innsamling og dissosiasjon metoden beskrevet her kan i tillegg benyttes i forberedelse til én celle RNA sekvensering18. Kollektivt, viser dette muligheten for en rekke roman, Hi-Fi-endepunkter som forskere kan optimalisere og utforske i fremtiden.

Organoids er et verdifullt verktøy for å studere organogenesen og sykdom. De gir et billigere alternativ til dyremodeller og pasient-avledede organoids er utvikling som en strategi for personlige medisin1,2,3. Tredimensjonale (3D) kultur systemet innebærer seeding stammen eller progenitor celler (høstet fra vev eller indusert pluripotent stamceller) i en gel ekstracellulær matrix komponenter (matrise gel)4. Cellene spredning og differensiere, som resulterer i organotypic strukturer som recapitulate mobilnettet hierarkiet og morfologi av orgelet av interest funksjonell enhet. Organoids har vokst med celler fra forskjellige organer, inkludert salivary kjortelen, mage, tarm, lever, prostata, lunge og hjernen4. Men det er flere protokoller som beskriver fremgangsmåten for å opprette prostata organoids5,6, er det utfordrende å finne tilstrekkelig detaljert metoder på hvordan å oppnå kvantitative endepunkter fra organoids. Denne artikkelen oppsummerer metoder utviklet for menneskelig primære prostata celler og detaljer en rekke foreslåtte endepunktene å vurdere organoid fenotyper. Disse teknikkene var optimalisert for prostata organoids og kan anvendes på andre 3D cellekulturer.
Prostata organoid kulturer har nylig dukket opp som en verdifull i vitro modell som mangler begrensningene for monolayer kulturer bruker etablert udødeliggjort linjer. Godartet prostata epitel og prostatakreft er utfordrende modell i vitro bruker udødeliggjort linjer. Godartet cellelinjer er begrenset, og alle har gjennomgått en transformasjon med oncogenes7. Primære prostata epitelceller i monolayers ikke skille ut luminal celler og mangler androgen reseptorer8. Flertallet av prostatakreft cellelinjer har ikke funksjonelle androgen reseptorer, en betydelig megler til tidlig sykdom og manglende viktige genetiske endringer som har blitt funnet i pasienten svulster9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes lett fra godartet epitel og er verdifulle i å studere stamcelleforskningen egenskaper, stamfar celler, differensiering og effekter av eksperimentell endringer i microenvironment4,5. Prostatakreft organoids kan dyrkes som del av en presisjon medisin tilnærming til modellering pasientens sykdom og respons på behandling10.
Denne protokollen er utarbeidet fra eksisterende protokoller som bruker ulike celletyper, men det er optimalisert her for bruk i menneskelig primære prostata celler. Den komplementerer protokoller skissert av Sawyers, Clevers og Shen5,6 som beskriver vekst, passaging, lyse-feltet bildebehandling, kryonisk bevaring og RNA og DNA isolering av prostata musen og menneskelige organoids. Hele-mount protokollen endres fra Mahé et al. 11, som brukte gastrointestinal epithelial organoids og beskriver live bildebehandling og frosne og parafinen innebygging. Borten et al. 12 beskrevet analyse av bryst, tykktarm og endetarmskreft organoid morfologi lyse-feltet bildebehandling. I tillegg Richards et al. 13 brukte en metode for morfologiske vurdering av prostata organoids. Til slutt, Hu et al. 14 beskrevet en metode for å overholde prostata organoids et kammer lysbilde over natten før den immunofluorescent flekker å observere enkeltceller og spredning av kuler for flyt cytometri analyse.
Målet med denne protokollen er å demonstrere i tilstrekkelig detalj metodene teknisk utfordrende som en protokoll, inkludert celle frø; Media og matrix gel vedlikehold; samlingen av celler for flowcytometri; RNA og DNA protein utvinning; morfologiske vurdering fra lyse-feltet z stabel analyse; embedding, behandling og snitting til histologiske farging; og hele-montering for immunofluorescence eller fluorescerende sonde analyser. Biologiske relevansen og tolkning av disse ulike endepunktene varierer blant eksperimentell design og antistoffer brukes til analyseformål. Gjennom utnyttelse av denne protokollen, bør brukere føler forberedt på å sette opp et eksperiment med et verktøysett for endepunkt.
Menneskets primære prostata (PrE) epitelceller ble etablert i laboratoriet av protokollen beskrevet av Peehl15,16 og vedlikeholdes til et begrenset antall ganger (opptil fire) som beskrevet tidligere17, men de er også tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Hepatocyte serum-free mediebasert6, KSFM-baserte13og R-spondin 1-conditioned5 medier publiseres alle som har produsert organoids. KSFM-baserte krever færrest tilsetningsstoffer, slik det er beskrevet her.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for tredimensjonale (3D) dyrking, håndtering og evaluering av menneskelig primære prostata organoids. Prosessen omfatter såing av epitelceller tynt i en 3D matrix gel på en 96-brønnen microplate med media endringer å dyrke ekspansjon i organoids. Morfologi vurderes deretter av hele-og fangst av z-stakk bilder. Komprimering av z-stabler oppretter ett i fokus bilde som organoids måles for å kvantifisere ulike utganger, inkludert sirkularitet, rundhet og området. DNA, RNA og protein kan hentes fra organoids fra matrisen gel. Celle populasjoner av interesse kan bli vurdert av organoid dissosiasjon og flow cytometri. Formalin-fiksering--parafininnstøper (FFPE) etterfulgt av skjæring brukes til histologiske vurdering og antistoff flekker. Hele-mount immunofluorescent flekker bevarer organoid morfologi og forenkler observasjon av protein lokalisering i organoids i situ. Kommersielle analyser som tradisjonelt brukes for 2D monolayer celler kan endres for 3D organoids. Teknikkene i denne protokollen brukes sammen, og gir en robust verktøykasse for å kvantifisere prostata organoid vekst, morfologiske egenskaper og uttrykk for differensiering.

Etter vellykket kultur for menneskelig primære prostata organoids, kan morfologi og differensiering vurderes lyse-feltet bildeanalyse og FFPE og hele-mount flekker teknikker.
Prosessen med lyse-feltet image fange er illustrert i figur 1A. Organoids er dyrket i en 3D matrise og spredt over ulike fokal plan. For å observere organoids i fokus over mange fly, er det foreslått for å bruke et EDF bilde (figur 1B, høyre) i stedet for et enkelt z-fly (figur 1B, venstre). I laboratoriet, kan organoids dyrket under forskjellige eksperimentelle forhold medføre endringer i morfologi. Bruker området, sirkularitet (definert av hvor like organoid er til en sirkel) og max/min radius (mål lengden) gir brukere en indikasjon på organoid størrelse og form og en kvantifiserbare avlesning av morfologi. Vil fremheve nytten av disse tiltakene, er representant bilder av organoids med tilsvarende område men ulike morfologi vist i figur 1 c, der en lang organoid vil være mindre sirkulære og har en større maksimum/minimum forhold enn en sfærisk organoid.
Bygge inn organoids for histology er et nyttig sluttpunkt å observere indre av prøver og sikre at nekrose ikke finnes i kjernen av en organoid. En arbeidsflyt for denne prosessen og representant resultatene av unstained kvinne, valgte prøvene under mikroskop lyse-feltet finnes i figur 2AB, C. Figur 3A viser en feilsendt organoid (til venstre) sammenlignet med riktig ga organoids i figur 3A (høyre) og figur 3B. For å fastslå den differensiering-staten prøven, er det anbefalt å betrakte basal celle markører (cytokeratin 5 og p63)8 med luminal celle markører (cytokeratin 8)8. Hvis det er ønskelig å flekk organoids i situ, hele-mount flekker er et praktisk alternativ, og disse representant resultatene finnes i Figur 3 cD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figur 1: morfologi vurdering av organoids i 3D kultur. (A) bildet samlingen og komprimering arbeidsflyt for menneskelig primære prostata organoids kjøpt av en lyset invertert mikroskop med motoriserte X / Y scenen og følgesvenn skanneprogramvare. (B) representant bilder av en enkelt z stabel (venstre) vs. en EDF bilde (høyre) i en hel-godt utvalg av menneskelig primære prostata organoids, viser at flere organoids er i fokus når flere z-stabler er kombinert i en enkelt bildet (skala bar = 1000 µm). (C) representant bilder for området, sirkularitet og max/min forholdet mellom morphologically ulike menneskelige primære prostata organoids som har samme område (skala bar = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figur 2: Organoid innebygging arbeidsflyt og representant snitting resultater. (A) menneskelige primære prostata organoid innebygging arbeidsflyt. (B) representativt bilde av en unstained kvinne, frisk lysbilde som inneholder menneskelige primære prostata organoids under lysende felt mikroskop som viser agar (grønn pil), histology gel (svart pil), boble (blå pil), organoids (røde piler) (skala bar = 1000 µ m). (C) unstained kvinne fersk kuttet lysbildet (venstre) vs. unstained kvinne tørr lysbildet (høyre), organoids (røde piler) vises gjennomsiktig når tørr (skala bar = 500 µm) og er vanskeligere å skjelne under mikroskop lyse-feltet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figur 3: histologiske flekker på delt og hele montert organoids. (A) H & E farging av en ødelagt menneskelige primære prostata organoid fra mishandling (aggressiv pipettering, feil behandling protokollen, venstre) ved siden av en godt håndtert organoid (høyre) (skala bar = 100 µm). (B) menneskelige primære prostata organoid som har vært formalin-fast, parafin-innebygd, delt, og farget med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8 (øverst) eller basale p63 og luminal cytokeratin 8 (nederst) og fotografert med AC confocal mikroskop ( skala bar = 100 µm). (C) en hel montert menneskelige primære prostata organoid farget med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8 og counterstained med phalloidin og DAPI, fotografert med AC confocal mikroskop (skala bar = 100 µm). (D) en hel montert human primære prostata celle organoid farget med fluorescently merket EdU og counter farget med Hoescht, fotografert med AC confocal mikroskop (skala bar = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Her presenterer vi en protokoll for veiledning om menneskets primære prostata organoid håndtering så foreslår endepunktene for å vurdere fenotypen. Såing, kultur vedlikehold, utvinning fra matrix gel, er morfologiske kvantifisering innebygging og skjæring, FFPE skjæring, hele-mount flekker og anvendelse av kommersielle analyser beskrevet.

Håndtering og vurdering av menneskelig primære prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostata organoider er et spennende in vitro system for å studere utvikling og sykdom. De overvinner utfordringer med udødelige cellelinjer og tilbyr et billig alternativ til dyremodeller. De kan dyrkes fra menneskelige prostataceller, som vi har vist i denne protokollen, samt mus prostataceller, som en sykdom-relevant pre-klinisk modell system.Mange laboratorier har beskrevet nyttige kulturmetoder og endepunkter. Men vi håper å bringe disse detaljene sammen i en protokoll og demonstrere de spesielt utfordrende trinnene for nye brukere. Etter hvert som teknikkene forbedres, kan prostatakreft organoider dyrkes fra pasientprøver som en presisjonsmedisin tilnærming til modellsykdom og respons på terapier.Kulturforholdene er spesifikke for prostata organoider, men mange av endepunktene er tilpasset fra andre vevstyper. En bruker kan tilpasse deler av denne protokollen til sin celletype av interesse. Start dette eksperimentet ved å dyrke epitelceller i matrisegelkodede 96-brønnplater som beskrevet i manuskriptet.For å samle organoider fra platene etter 12 dager, fjern medium fra brønnene uten å forstyrre matrisegelen. Deretter legger du umiddelbart til ca 200 mikroliter nøytral protease til hver brønn på omtrent et en-til-to-forhold mellom matrisegel og nøytral protease. Inkuber platen i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Deretter pipette opp og ned for å mekanisk dissosiere blandingen, og inkubere igjen i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjonen overfører du den nøytrale proteasematrisegelcelleblandingen fra noen få brønner til et mikrocentrifugerør. Pellet cellene ved sentrifugering på 300 ganger g i tre til fem minutter.Fjern det overnaturlige, og lagre organoidpellet for påfølgende analyser. For å lage former for innebygging, kutt ut en liten del av en 1000 mikroliter pipettespiss for å lage en sylinder som rommer 50 mikroliter. Deretter fra den bredere delen av samme tips, gjør en annen bredere form som passer rundt den første formen.For å lage en kald blokk, pakk en ispakke med tape med klebemiddelsiden opp. Deretter holder formene vinkelrett på båndet. For å bygge inn organoider i en histologigelplugg for behandling, vask først den tidligere oppnådde organoidpelleten med en milliliter Hanks balanserte saltløsning.Etter sentrifugering på 300 ganger g i tre til fem minutter, fjern supernatanten. Tilsett deretter 30 til 50 mikroliter flytende histologigel til organoidpellet, og bland forsiktig ved å sakte pipettering opp og ned for å gjenopplive pelleten. Overfør denne blandingen til en mugg på den kalde blokken, og la prøven avkjøles og stivne inn i en plugg.Deretter bruker du et stempel til å skyve pluggen ut av den lille formen og inn i midten av den større formen, og fyll den ved å pipettere klar 2% agar rundt pluggen. For å markere toppen av prøven, pipette histologiske fargestoff-farget 2% agar på toppen av pluggen. Når agaren er avkjølt, bruk et stempel til å overføre pluggen til en histologikassett.Merk kassetten med en blyant og plasser den i 10 % nøytral bufret formalin for fiksering over natten. På neste dag overfører du kassetten fra 10% nøytral bufret formalin til 70% histologisk karakter etanol, og behandle den videre og bygge inn i parafin. Begynn med å trimme bunnen av blokken med en tykkelse på 10 mikrometer.Når en del som inneholder pluggområdet vises, slutter du å trimme. Lås mikrotomrotoren, og overfør blokken tilbake på isen for å kjøle seg ned. Flytt bladet til en ny, ubrukt del.Og overfør blokken tilbake til klemmen. Lås opp maskinen og begynn å trimme med fem mikrometer per seksjon. Bruk pinsett til å overføre seksjonen til 40-graders Celsius vannbad, og la den spre seg ut.Dypp en glide vertikalt i vannet for å overføre delen til den. Observer deretter lysbildet under et lyst feltmikroskop for å sikre at en organoid er tilstede i seksjonen. Stekes over natten på 45 til 50 grader Celsius, og fortsett deretter med farging som beskrevet i manuskriptet.Start denne delen av eksperimentet med ubrukte brønner av den 96-brønns matrisegelbelagte platen med organoider. Ved å pipetter mot siden av brønnen, slik at det er plass mellom media og matrisegel, fjern forsiktig så mye media som mulig uten å forstyrre organoidkulturen. Bruk en trimmet 1000 mikroliter pipettespiss, pre-våt med PBS for å tegne opp en dråpe matrisegel som inneholder organoider av interesse.Dispenser dråpen på midten av et kammersklie. Med det blotte øye, aspirer overflødig media og matrisegel fra kammersklien ved hjelp av en fin-tippet pipette. For å fremme organoid overholdelse av glasset og forhindre tap av prøver under påfølgende vasketrinn.Plasser lysbildet i en 37-graders Celsius inkubator i 30 til 45 minutter. Pipettering sakte for å hindre løsrivelse fra parabolen, tilsett 200 mikroliter av 1X PBS for å vaske organoidene i fem minutter ved romtemperatur med mild risting. Fjern forsiktig 1X PBS og tilsett 200 mikroliter med 4% paraformaldehyd.Fest i 30 minutter ved romtemperatur med mild risting. Ved PFA, vask og fortsett med påfølgende permeabilisering og farging trinn som beskrevet av denne protokollen. Monter og bilde umiddelbart.Uoppståelig nykuttet lysbilde viser tydelig menneskelige primære prostata organoider, mens i uopphetet tørrsklie ser organoider gjennomsiktige ut og er vanskeligere å oppdage under et lyst feltmikroskop. Hematoksylin og eosinfarging viser en ødelagt human primær prostata organoid fra feilhåndtering, for eksempel aggressiv pipettering, feil behandlingsprotokoll sammenlignet med en godt håndtert organoid. Humant primært prostataorganoid var formalin-fast, parafin-innebygd, seksjonert og farget med basal cytokeratin 5 og luminal cytokeratin 8, basal p63 og luminal cytokeratin 8, og avbildet med konfokal mikroskop.En helmontert humant primært prostata organoid ble farget med basal cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8, og motvirket med falloidin og DAPI, og avbildet med konfokal mikroskop. En helmontert humant primær prostatacelleorganoid ble farget med fluorescerende merket Edu og motvirket med Hoescht, og avbildet med konfokal mikroskop. Det er viktig å visualisere organoidene dine gjennom hele prosedyren.Etter å ha samlet seksjonene, sørg for å visualisere prøvene på lysbildet, og sørg for at du observerer organoider under fullmontering. Etter å ha samlet organoider fra matrisegelen, kan du helmontere dem og bruke kommersielle analyser, eller dissosiere til enkeltceller for strømningscytometri eller encellesekvensering. 3D-kulturen gir forskere en ny måte å studere vev på i innstillingen av en laboratorierett.Det kan brukes på organogenese, eller for å forstå patologien til pasientens sykdom. Når du arbeider med pasientprøver, må du alltid utvise forsiktighet og håndtere materialene som potensial for blodbåren patogeneksponering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensutredning av gjentatt eksponering av organotypiske 3D Bronkitt og Nasal Tissue Kultur Modeller til Whole sigarettrøyk

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Et hormon-responsive 3D Culture Model of Human melkekjertlene Epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatisert robot flytende håndtering samlingen av modulære DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikrofluid Flow Chamber Modell for platetransfusjon og Hemostase Måler blodplateavleiring og fibrindannelse i sanntid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær avklaring av CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjelp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En åpen kildekode-teknologiplattform for produksjon av Hydrogel-baserte 3D-kulturmodeller på en automatisert og standardisert måte

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetode for å opprettholde quiescent humane hematopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...