Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Agradecemos os membros da UIC Biorespository, Dr. Klara Vinicius-Nagy e Alex Susma, bem como os urologistas, DRS Michael Abern, Daniel Moreira e Simone Crivallero, para facilitar a aquisição de tecido para as culturas de célula primária. Agradecemos os pacientes UIC Urologia para doar seus tecidos para pesquisa. Este trabalho foi financiado, em parte, pelo departamento de defesa próstata câncer pesquisa programa saúde disparidades ideia prêmio PC121923 (Nonn) e o centro de UIC para clínicos e tradução ciência Pre-doctoral educação para clínicos e cientistas translacional ( Programa bem) (McCray e Richards) e pelo Instituto Nacional do câncer o National Institutes of Health, Grant números U54CA202995, U54CA202997 e U54CA203000, conhecido como a saúde Chicago Equity colaborativo (Nonn e Richards). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos institutos nacionais de saúde ou do departamento de defesa.

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Cultura de organotypic é um excitante novo método de recapitulando o tecido com a praticidade de um ambiente em vitro . Atualmente, os laboratórios crescem organoids de muitos tipos de tecidos para vários pontos de extremidade. Os métodos descritos neste artigo resumem úteis pontos de extremidade e destacam as novas técnicas para caracterizar totalmente culturas 3D primário de células da próstata.
Há uma variedade de receitas de meios de cultivo primário de células da próstata humana organoids5,6,13. Enquanto todos alcançar resultados comparáveis e viáveis, mídia baseada em KSFM13 usa aditivos mínimos então é descrito aqui. Além disso, os papéis foram publicados usando várias concentrações para o gel de matriz, de 10% a 75% para a cultura da próstata organoids5,6,13. Porque a matriz gel é um reagente caro, e 33% gel de matriz foi mostrado para ser suficiente para cultivar a longo prazo (2-3 semanas), viável, unclumped organoids13, esta é a concentração recomendada. No entanto, gel de matriz pode variar na concentração de proteínas entre números de lote, portanto isso deve ter em conta quando o chapeamento. Também é aconselhável comprar gel de matriz a granel para uso em vários experimentos para reduzir inconsistência entre lotes. Outros laboratórios publicaram diferentes formatos para chapeamento gel de matriz, tais como as gotas em vez de uma placa de 96 poços bem5de revestimento. Ambos os métodos formam organoids viável, mas o formato descrito aqui permite células a ser chapeado mais escassa, que foi mostrado para promover a expansão de células em maior organoids13. No entanto, chapeamento densidade deveria ser otimizado baseado fora de eficiência de formação específicos do paciente. Gel de matriz está disponível em vários formatos, incluindo o fator de crescimento reduzido, vermelho de fenol-livre, alta concentração, etc. Fator de crescimento reduzido é indicado para condições de cultura definidas e livre de vermelho de fenol é recomendado quando se trabalha com células que expressam o GFP ou em experimentos que envolvem a captura de imagem de z-pilha. É fundamental que as etapas de chapeamento de gel de matriz ser realizada com reagentes gelados, como gel de matriz rapidamente se solidifica à temperatura ambiente.
Organoids cultivado sob diferentes tratamentos experimentais podem resultar em alterações à forma, então brilhante-campo imagem é amplamente utilizada para o estudo de fenótipos morfológicos observados. Não obstante, gravação e quantificar a área ou a forma são um desafio por duas razões: viés de seleção 1) durante a captura de imagem e 2) aplicando um parâmetro bidimensional como área para uma amostra tridimensional. Uma estratégia de captura de imagem é gravar um campo aleatório e medir um número predeterminado de organoids nesse campo, mas isso pode criar preconceito durante a seleção, e todos os organoids no campo selecionado não pode estar em foco. Imagem de todo bem otimizada para o formato de microplacas de 96 poços elimina este viés de amostragem através da recolha de organoides toda população de interesse. No entanto, dependendo dos objectivos de microscópio na mão, vários campos podem precisar ser coletados e lado a lado a fim de obter uma imagem de todo o bem. Alguns laboratórios têm descrito a área de medição de um único plano z12, mas para capturar todos os organoids em foco, é aconselhável coletar e empilhe vários aviões em uma única imagem-FED13. Em alguns casos, um menisco no gel matriz pode causar vinhetas na imagem, e métodos de correção de fundo talvez precise ser aplicada usando software de análise de imagem. Volume exato idealmente é a medida mais adequada para o tamanho de organoides; no entanto, é difícil obter precisamente, mesmo com várias imagens de z-pilha. Outras dimensões morfológicas úteis, tais como a circularidade e rácio máximo/mínimo, podem ser facilmente calculados de todos os organoids em uma imagem do FED de todo bem. Juntos, esses métodos superar desafios viés de amostragem e permitem a medição de parâmetros 2D de objetos 3D em um espaço 3D.
Fixação de formalina e parafina incorporação de organoids é um método comum para obter hematoxilina e eosina (H & E), imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF) mancha para visualização e análise6,11, 20. no entanto, publicações que têm descrito esta técnica faltam detalhes abrangentes sobre o processo de incorporação. Além disso, localizar organoids dentro do bloco de parafina pode ser desafiador. Alguns laboratórios pre-mancham organoids com trypan azul antes da incorporação para auxiliar na localização durante o corte de11. O método descrito aqui incorpora o uso de um corante histológico para orientação do gelplug de organoides/histologia durante a incorporação para promover a eficiência de corte. Slides de H & E facilitam o exame de necrose e proliferação nuclear textura, e, portanto, deveria ser um ponto de extremidade obrigatório para cultura de organoides para garantir que as células são saudáveis em toda a esfera. A força da cultura de organoides é que as amostras são compostas de uma mistura heterogênea de células que se assemelham a melhor na vivo paciente tecido. Na próstata, por exemplo, células basais e luminal estão presentes na próstata organoids5, enquanto as células cultivadas em 2D falta diferenciação luminal8. Para avaliar a diferenciação de organoides, recomenda-se que os pesquisadores avaliem marcadores basais como CK5 e p63 e luminal marcadores como receptores de andrógeno e CK88. Qualquer outras proteínas experimentais de interesse também podem ser estudadas usando essas técnicas de coloração.
Apesar de seções FFPE permitem a visualização de células que residem no interior do compartimento através de histológica métodos (H & E, se, IHC), limitam-se imagens de secções transversais e organoides forma pode ser alterada pelo processo de incorporação. Toda a montagem de coloração permite um organoides ser manchado e observada em situ, preservando fenótipos morfológicos e permitindo imagens da localização da proteína. Toda a montagem é uma ferramenta utilizada para manchar todo-tecido ou todo-animal espécimes, tais como o embrião do zebrafish ou mouse e é facilmente adaptada para organoids. A técnica descrita aqui foi modificada do procedimento por Mahéet al 11, que detalha o crescimento inicial e cultura de organoids gastrointestinal diretamente em um slide de câmara para a coloração e requer a fixação da cultura inteira de pai. O método descrito aqui envolve a transferência de um único organoides (ou organoids) de interesse numa lâmina de câmara no momento da coloração. Isto permite a seleção de organoids individual para análise de toda a montagem em um experimento em andamento sem fixação da cultura do pai. Ao realizar a coloração de toda a montagem, é necessário otimizar a permeabilização e o tempo de incubação para anticorpos primários e secundários garantir a penetração em toda a amostra (em qualquer lugar de um ou mais dias é recomendado). Uma vez que a criação da imagem através de microscopia confocal, renderings 3D podem ser produzidos para permitir a visualização e localização de uma proteína específica e calcular o número de células coradas positivamente presentes em uma amostra. Citometria de fluxo é um ponto de extremidade úteis para quantificar as populações da basal, luminal, ou tronco células5,14. Para fazer isso, as células são recuperou o gel da matriz e dissociadas suavemente para a coloração. Os usuários devem cuidadosamente selecionar marcadores apropriados para a separação com base na literatura atual. Para humanas células epiteliais da próstata primárias, CD26 e CD49f são marcadores luminal e basais adequados, respectivamente,5,21.
Em resumo, este protocolo detalha crescimento humano primário da próstata organoides, coleção e pontos de extremidade experimentais. Digno de nota, a técnica de montagem descrita pode ser aplicada a uma variedade de outros ensaios que são normalmente empregados para pilhas 2D, tais como fluorescentes experiências baseadas em investigação olhando para manchas das organelas subcelulares, apoptose e proliferação19. Além disso, o método de coleta e dissociação descrito aqui poderia ser utilizado na preparação para uma única célula de sequenciamento de RNA18. Coletivamente, isso demonstra a possibilidade para uma variedade de romance, pontos de extremidade de alta-fidelidade que pesquisadores podem otimizar e explorar no futuro.

Organoids são uma ferramenta valiosa para estudar a doença e organogênese. Eles fornecem uma alternativa mais barata para modelos animais, e organoids derivado de paciente estão evoluindo como estratégia de medicina personalizada1,2,3. Este sistema tridimensional (3D) cultura envolve a propagação de células estaminais ou progenitoras (colhido do tecido ou induzida por células estaminais pluripotentes) em um gel de componentes de matriz extracelular (gel de matriz)4. As células proliferam e se diferenciam, resultando em estruturas organotypic que recapitular a hierarquia de celular e a morfologia do órgão da unidade funcional do interesse. Organoids têm sido cultivadas usando células provenientes de uma variedade de órgãos, incluindo as glândulas salivares, estômago, intestino, fígado, próstata, pulmão e cérebro4. Embora existam inúmeros protocolos, descrevendo os passos para estabelecer a próstata organoids5,6, é difícil encontrar métodos suficientemente detalhados em como conseguir pontos de extremidade quantitativos de organoids. Este artigo resume os métodos desenvolvidos para células humanas de próstata primárias e detalha uma série de pontos de extremidade sugeridos para avaliar os fenótipos de organoides. Estas técnicas foram otimizadas para organoids da próstata e podem ser aplicáveis a outras culturas de célula 3D.
Próstata organoides culturas surgiram recentemente como um modelo valioso em vitro que não possui as limitações das culturas monocamada usando estabelecido linhas celulares imortalizado. Epitélio benigno de próstata e câncer de próstata é um desafio para o modelo em vitro usando linhas celulares imortalizado. O número de linhas celulares benignas é limitado, e todos sofreram transformação com oncogenes7. As células epiteliais da próstata primárias em monocamadas não diferenciar em células luminal e falta de receptores de andrógeno8. A maioria das linhas de células de câncer de próstata não tem receptores de andrógeno funcional, um mediador significativo de início estado de doença e falta chave as mudanças genéticas que foram encontradas em tumores paciente9. Culturas de organoides da próstata podem ser cultivadas facilmente do epitélio benigno e são valiosas no estudo de propriedades de célula-tronco, células progenitoras, diferenciação e efeitos das mudanças experimentais no microambiente4,5. Organoids de câncer de próstata pode ser cultivada como parte de uma abordagem de medicina de precisão para modelagem de doença do paciente e resposta a terapias10.
Este protocolo tem sido compilado a partir de protocolos existentes que usam vários tipos de células, mas isso foi aqui otimizado para uso em células humanas de próstata primários. Ele complementa protocolos delineados pela Sawyers, Clevers e Shen5,6 que descrevem o crescimento, passagem, imagem brilhante-campo, criopreservação e isolamento de RNA e DNA da próstata do rato e organoids humana. O protocolo de toda a montagem é modificado de Mahé et al 11, que usou organoids epiteliais gastrointestinais e descreve ao vivo de imagens e congelados e incorporação de parafina. Et al . Borten 12 descreveu a análise de mama, cólon e morfologia de organoides câncer colorretal do brilhante-campo de imagem. Além disso, Richards et al. 13 um método usado para a avaliação morfológica do organoids da próstata. Finalmente, Hu et al. 14 descreveu um método de próstata aderente organoids para um slide da câmara durante a noite antes da coloração imunofluorescente para observar células únicas e dispersão das esferas para análise de citometria de fluxo.
O objetivo do presente protocolo é demonstrar em detalhes suficientes esses métodos tecnicamente desafiadoras como um protocolo, incluindo a célula de semeadura; mídia e matriz de gel de manutenção; coleção de células por citometria de fluxo; RNA, DNA e extração da proteína; avaliação morfológica de análise brilhante-campo z-pilha; incorporação, transformação e seccionamento para coloração histológica; e toda a montagem por imunofluorescência ou ensaios de sonda fluorescente. A relevância biológica e interpretação destes vários pontos de extremidade irão variar entre os anticorpos utilizados para análise e delineamento experimental. Por meio da utilização do presente protocolo, os usuários devem sentir preparados para configurar uma experiência com um conjunto de ferramentas de pontos de extremidade.
Humano primário da próstata (PrE) células epiteliais estabeleceram-se no laboratório pelo protocolo descrito por Peehl,15,16 e mantida a um número limitado de passagens (até quatro) como descrito anteriormente,17, mas eles também são disponível a partir de fornecedores comerciais. Hepatócito soro livre baseada em mídia6, baseada em KSFM13e R-spondin 1-condicionado5 mídia é publicadas como tendo produzido com êxito o organoids. Baseado em KSFM requer o menor número de aditivos, assim é descrito aqui.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Este artigo descreve um protocolo detalhado para tridimensional (3D) de cultivo, manipulação e avaliação de organoids de próstata primário humano. O processo envolve a propagação de células epiteliais escassamente em um gel de matriz 3D em uma microplaca de 96 poços, com alterações de mídia para cultivar a expansão em organoids. Morfologia é então avaliada pelo bem de toda a captura de imagens de z-pilha. Compressão de z-pilhas cria uma única imagem em foco, dos quais organoids são medidos para quantificar uma variedade de saídas, incluindo circularidade, esfericidade e área. DNA, RNA e proteínas podem ser coletadas de organoids recuperadas o gel da matriz. Populações de células de interesse podem ser avaliadas por dissociação de organoides e citometria de fluxo. Formalina-fixação-parafina-incorporação (FFPE) seguido por corte é usado para a avaliação histológica e anticorpos. Toda a montagem de coloração imunofluorescente preserva a morfologia de organoides e facilita a observação da localização da proteína em organoids em situ. Ensaios comerciais que são tradicionalmente utilizados para células monocamadas 2D podem ser modificados para organoids 3D. Usados em conjunto, as técnicas neste protocolo fornecem uma caixa de ferramentas robusta para quantificar o crescimento da próstata organoides, características morfológicas e expressão de marcadores de diferenciação.

Cultura bem sucedida de organoids de próstata primário humana, morfologia e diferenciação podem ser avaliadas usando análise de imagem de campo brilhante e FFPE e técnicas de coloração de toda a montagem.
O processo de captura de imagem de campo claro é ilustrado na figura 1A. Organoids são crescidas em uma matriz 3D e dispersos em diferentes planos focais. Para observar organoids em foco através de muitos aviões, é aconselhável para usar uma imagem do FED (figura 1B, direita) em vez de um único plano z (figura 1B, à esquerda). No laboratório, organoids cultivadas sob diferentes condições experimentais podem resultar em alterações na morfologia. Usando a área, circularidade (definido por como semelhante a organoides é um círculo) e raio de min/max (medida de comprimento) dar aos usuários uma indicação da forma e tamanho de organoides e fornecem uma leitura quantificável da morfologia. Para enfatizar a utilidade destas medidas, imagens representativas de organoids com área semelhante mas morfologia diferente são mostradas na Figura 1, na qual uma longa organoides serão menos circular e têm uma relação de máximo/mínimo maior do que um esférico organoides.
Incorporação de organoids para a histologia é um ponto de extremidade útil para observar o interior das amostras e certifique-se de que necrose que não está presente dentro do núcleo de um organoides. Um fluxo de trabalho para este processo e resultados representativos das amostras sob um microscópio de campo claro imaculados, seccionados são fornecidos na Figura 2AB, C. A figura 3A mostra um organoides mal-cuidada (à esquerda) em comparação com devidamente entregue organoids na Figura 3A (à direita) e Figura 3B. Para determinar o estado de diferenciação da amostra, é recomendável olhar basocelular marcadores (citoqueratinas 5 e p63)8 juntamente com célula luminal marcadores (citoqueratina 8)8. Se se deseja manchar organoids em situ, manchando toda a montagem é uma alternativa conveniente, e esses resultados representativos são fornecidos na Figura 3D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figura 1: avaliação da morfologia de organoids na cultura 3D. (A) imagem coleção e compactação de fluxo de trabalho humano organoids de próstata primário adquirido por uma luz transmitida invertido microscópio com uma motorizada X / Y, palco e companheiro software de digitalização. (B) imagens representativas de um único z-pilha (esquerda) vs. uma imagem de FED (à direita) de uma amostra de todo o bem de organoids de próstata primário humano, mostrando que mais organoids estão no foco quando z-pilhas múltiplas são combinados em uma única imagem projetada (barra de escala = 1000 µm). (C) imagens representativas para a proporção de área, circularidade e min/max de morfologicamente diferentes humano primário organoids da próstata que tenham a mesma área (barra de escala = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figura 2: organoides incorporação de fluxo de trabalho e representante resultados de corte. (A) humana organoides de próstata primário, incorporação de fluxo de trabalho. (B) imagem representativa de um slide imaculado, fresco, contendo organoids de próstata primário humano sob um microscópio de campo claro retratando o ágar (seta verde), gel de histologia (seta preta), bolha (seta azul), organoids (setas vermelhas) (barra de escala = 1000 µ m). (C) Unstained recém cortadas slide (à esquerda) vs. unstained slide seco (à direita), organoids (setas vermelhas) aparecer translúcidos quando seco (barra de escala = 500 µm) e são mais difíceis de discernir sob um microscópio de campo claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figura 3: coloração histológica sobre organoids secionado e todo montado. (A) H & E mancha de um quebrado organoides humano primário da próstata de manuseio incorreto (pipetagem agressivo, protocolo de tratamento errado, esquerda) ao lado de um bem manuseada organoides (à direita) (barra de escala = 100 µm). (B) humana organoides próstata primário que foram fixada em formol, parafina, seccionado e corados com citoqueratinas basais 5 ou luminal citoqueratina 8 (em cima) ou basal p63 e luminal citoqueratina 8 (fundo) e fotografada com microscópio confocal ( barra de escala = 100 µm). (C) um conjunto montado humana primária da próstata organoides manchado com citoqueratinas basais 5 ou 8 a citoqueratina luminal e counterstained com faloidina e DAPI, fotografada com microscópio confocal (barra de escala = 100 µm). (D) um organoides montado todo humano primário da próstata de células coradas com fluorescente etiquetado EdU e contador manchado com Hoescht, fotografada com microscópio confocal (barra de escala = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Aqui, apresentamos um protocolo para orientar a manipulação de organoides humano de próstata primário, em seguida, sugerir pontos de extremidade para avaliar o fenótipo. Semeadura, manutenção de cultura, recuperação de gel da matriz, quantificação morfológica, incorporação e seccionamento, FFPE seccionamento, toda a montagem coloração e aplicação de ensaios comerciais são descritos.

Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Organoides de próstata são um sistema in vitro excitante para estudar desenvolvimento e doenças. Eles superam desafios das linhas celulares imortalizadas e oferecem uma alternativa barata aos modelos animais. Elas podem ser cultivadas a partir de células da próstata humana, como mostramos neste protocolo, bem como células de próstata de camundongos, como um sistema de modelo pré-clínico relevante para a doença.Muitos laboratórios descreveram métodos de cultura úteis e pontos finais. Mas esperamos reunir esses detalhes em um protocolo e demonstrar os passos particularmente desafiadores para novos usuários. À medida que as técnicas melhoram, os organoides do câncer de próstata podem ser cultivados a partir de amostras de pacientes como uma abordagem de medicina de precisão para modelar doenças e responder às terapias.As condições de cultura são específicas para organoides de próstata, porém muitos dos pontos finais foram adaptados de outros tipos de tecidos. Um usuário poderia adaptar partes deste protocolo ao seu tipo de interesse celular. Inicie este experimento cultivando células epiteliais em placas de 96 poços codificadas em gel matricial, conforme descrito no manuscrito.Para coletar organoides das placas após 12 dias, remova o meio dos poços sem perturbar o gel de matriz. Em seguida, adicione imediatamente aproximadamente 200 microliters de protease neutra a cada poço em cerca de uma proporção de um a dois de gel de matriz para protease neutra. Incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, pipeta para cima e para baixo para dissociar mecanicamente a mistura, e incubar novamente por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, transfira a mistura neutra de células de gel da matriz protease de alguns poços para um tubo de microcentrifuuge. Pelota as células por centrifugação a 300 vezes g por três a cinco minutos.Remova o supernatante e guarde a pelota organoide para análises subsequentes. Para criar moldes para incorporar, corte uma pequena seção de uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres para fazer um cilindro que contém 50 microliters. Em seguida, a partir da parte mais larga da mesma ponta, faça um segundo molde mais largo que se encaixa em torno do primeiro molde.Para criar um bloco frio, enrole uma embalagem de gelo com fita adesiva para cima. Em seguida, adere os moldes perpendicularmente à fita. Para incorporar os organoides em um plugue de gel de histologia para processamento, primeiro lave a pelota organoide obtida anteriormente com um mililitro da Solução de Sal Balanceado de Hank.Depois de centrifugar a 300 vezes g por três a cinco minutos, remova o supernatante. Em seguida, adicione 30 a 50 microliters de gel de histologia líquida à pelota organoide, e misture suavemente, pipetando lentamente para cima e para baixo para resuspensar a pelota. Transfira essa mistura para um molde no bloco frio e deixe que o espécime esfrie e solidifique em um plugue.Em seguida, use um êmbolo para empurrar o plugue para fora do molde pequeno e para o centro do molde maior, e preenchê-lo por pipetting claro 2% ágar ao redor do plugue. Para marcar o topo da amostra, pipeta histologic dye-tinted 2% ágar em cima do plugue. Uma vez que o ágar tenha esfriado, use um êmbolo para transferir o plugue para um de histologia.Rotule o com um lápis e coloque-o em formalina tamponada 10% neutra para fixação durante a noite. No dia seguinte, transfira o de formalina tamponada 10% neutra para 70% de etanol histológico, e processe-o ainda mais e incorpore em parafina. Comece aparando a base do bloco com uma espessura de 10 micrômetros.Uma vez que uma seção que contenha a área do plugue apareça, pare de aparar. Bloqueie o rotor de microtome e transfira o bloco de volta para o gelo para esfriar. Mova a lâmina para uma nova porção não utilizada.E transfira o bloco de volta para o grampo. Desbloqueie a máquina e comece a aparar a cinco micrômetros por seção. Use pinças para transferir a seção para o banho de água Celsius de 40 graus e deixe que ela se espalhe.Mergulhe um slide verticalmente na água para transferir a seção para ela. Em seguida, observe o slide sob um microscópio de campo brilhante para garantir que um organoide esteja presente na seção. Asse durante a noite a 45 a 50 graus Celsius, e depois prossiga com a coloração como descrito no manuscrito.Inicie esta parte do experimento com poços nãousados da placa revestida de gel de matriz de 96 poços com organoides. Ao se desargar contra o lado do poço, deixando espaço entre a mídia e o gel de matriz, remova cuidadosamente o máximo de mídia possível sem interromper a cultura organoide. Use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter aparada, pré-molhada com PBS para elaborar uma gota de gel de matriz que contenha os organoides de interesse.Dispense a gota no meio de um deslizamento de câmara. A olho nu, aspire o excesso de mídia e gel de matriz do slide da câmara usando uma pipeta de ponta fina. Promover a adesão organoide ao vidro e evitar a perda de amostras durante as etapas subsequentes de lavagem.Coloque o slide em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Pipetando lentamente para evitar o desprendimento do prato, adicione 200 microliters de 1X PBS para lavar os organoides por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Remova cuidadosamente o PBS 1X e adicione 200 microliters de 4%de paraformaldeído.Fixar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Na PFA, lave e prossiga com etapas subsequentes de permeabilização e coloração, conforme descrito por este protocolo. Monte e imagem imediatamente.Slide recém-cortado não manchado mostra claramente organoides primários da próstata humana, enquanto em deslizamento seco não manchado, organoides parecem translúcidos e são mais difíceis de detectar sob um microscópio de campo brilhante. A hematoxilina e a coloração de eosina mostram um organoide de próstata primário humano quebrado por manipulação incorreta, como pipetação agressiva, protocolo de processamento errado em comparação com um organoide bem manuseado. O organoide de próstata primário humano foi formado, embutido em parafina, seccionado e manchado com citokeratina basal 5 e citokeratin luminal 8, p63 basal e citokeratina luminal 8, e imageado com microscópio confocal.Um organoide de próstata primário humano montado inteiro foi manchado com citokeratina basal 5 ou citokeratina luminal 8, e contra-manchado com falitina e DAPI, e imageado com microscópio confocal. Um organoide de células primárias da próstata foi manchado com Edu rotulado fluorescentemente e contra-manchado com Hoescht, e imageado com microscópio confocal. É importante visualizar seus organoides durante todo o procedimento.Depois de coletar as seções, certifique-se de visualizar as amostras no slide e certifique-se de observar organoides durante a montagem total. Depois de coletar os organoides do gel de matriz, você pode montá-los inteiros e usar ensaios comerciais, ou dissociar-se a células únicas para citometria de fluxo ou sequenciamento de células únicas. A cultura 3D fornece aos pesquisadores uma nova maneira de estudar tecido na configuração de um prato de laboratório.Pode ser aplicado à organogênese, ou à compreensão da patologia da doença de um paciente. Ao trabalhar com amostras de pacientes, sempre tenha cuidado e manuseie os materiais como potencial para exposição ao patógeno transmitido pelo sangue.

Research

JoVE Journal

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Bioengenharia

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