Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Мы благодарим членов МСЖД Biorespository, доктор Klara Valyi-Надя и Алекс Сюзьмы, а также урологи, Drs. Майкл Эйберн, Даниэль Морейра и Симоне Crivallero, для облегчения приобретения тканей для культур клеток первичного. Мы благодарим МСЖД урологии пациентов за пожертвования их ткани для исследования. Эта работа была, частично финансируется, Департамент из обороны простаты рак исследований программы здравоохранения неравенства идея премии PC121923 (Нонне) и МСЖД центр клинической и перевод науки Pre-doctoral образование для клинической и трансляционная ученых ( МИЧЕСКАЯ) программа (Мак-Крей и Ричардс) и национальных институтов здравоохранения Национальный институт рака, Грант номера U54CA202995, U54CA202997, и U54CA203000, известный как Чикаго здоровья справедливости совместной (Нонне и Ричардс). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здравоохранения или Министерство обороны.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Organotypic культура является захватывающей новый метод для изложив ткани с удобством обстановки в пробирке . В настоящее время лаборатории растет organoids от многих видов тканей для различных конечных точек. Методы, описанные в настоящем документе кратко полезных конечных точек и выделить новые методы полностью охарактеризовать культур 3D первичных клеток простаты.
Есть множество рецептов СМИ для выращивания простаты клеток человека первичной organoids5,6,13. Хотя все достижения жизнеспособного и сопоставимые результаты, на основе KSFM СМИ13 использует минимальный добавки так это описано здесь. Кроме того документы были опубликованы с использованием нескольких концентрации для матрицы геля, от 10% до 75% к культуре простаты organoids5,6,13. Потому что матрицы геля является дорогим реактивом, и 33% матрицы геля было показано, чтобы быть достаточно, чтобы культивировать долгосрочные (2-3 недели), жизнеспособной, unclumped organoids13, это рекомендуемая концентрация. Однако матрица гель может варьироваться в концентрации белка между много чисел, так что это должно приниматься во внимание, когда покрытие. Мы также рекомендуем приобрести матрицы геля навалом для использования через несколько экспериментов, чтобы уменьшить несоответствие между партиями. Другие лаборатории опубликовали различные форматы для покрытие матрицы геля, как капельки вместо покрытия хорошо 96-луночных плита5. Оба метода формирования жизнеспособной organoids, но формат, описанный здесь позволяет для ячеек с покрытием более редко, которое было показано, содействовать расширению клеток в больших organoids13. Однако покрытие плотности должны быть оптимизированы в зависимости от эффективности формирования конкретного пациента. Матрицы геля доступен во многих форматах, в том числе фактор роста снижение, фенола Красного бесплатно, высокая концентрация и т.д. Фактор роста снижение рекомендуется для определенных условий культуры и свободного фенола Красного рекомендуется при работе с ячейками, которые выражают GFP или в экспериментах, которые включают захват изображения z стека. Важно, что любой матрицы геля обшивка действия с ледяной реагентов, как матрица гель быстро затвердевает при комнатной температуре.
Organoids, выращиваемые в различных экспериментальных процедур может привести к изменениям в форму, поэтому светлые области изображения широко используется для изучения наблюдаемых морфологических фенотипов. Тем не менее, запись и количественного определения области или фигуры является проблемой по двум причинам: 1) систематическая во время захвата изображения и 2) трехмерный образец применения двумерных параметра как области. Одна стратегия захвата изображения – записать случайное поле и измерить определенное количество organoids в этой области, но это может создать предвзятость во время выбора, и все organoids в выбранном поле не может быть в центре внимания. Целом ну изображений, оптимизированный для 96-луночных микропланшетов формат устраняет этой погрешности выборки, собирая всю органоид населения интерес. Однако в зависимости от целей Микроскоп на руке, несколько полей может потребоваться быть собраны и плиткой для того чтобы получить образ в целом хорошо. Некоторые лаборатории описали измерительной области из одной плоскости z12, но захватить все organoids в фокусе, рекомендуется собирать и стек несколько плоскостей в единый EDF-изображения-13. В некоторых случаях мениска в матрице геля может вызвать виньетирование в изображении, и методы коррекции фона может потребоваться применить с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Точный объем идеально наиболее подходящие измерения для размера органоид; Однако это трудно точно получить, даже с несколькими изображениями z стека. Другие полезные морфологических измерения, такие как округлости и максимального/минимального соотношения, легко могут быть рассчитаны от всех organoids в целом ну EDF изображения. Вместе эти методы преодолеть выборки смещения проблемы и включить измерение параметров 2D 3D объектов в трехмерном пространстве.
Формалин фиксации и парафин встраивание organoids является распространенным методом для получения гематоксилином и эозином (H & E), иммуногистохимический (IHC) и immunofluorescent (если) пятная для визуализации и анализа6,11, 20. Однако, публикаций, которые описал эту технику отсутствуют подробные сведения о процессе внедрения. Кроме того обнаружение organoids в блоке парафин может быть сложным. Некоторые лаборатории предварительно пятно organoids с Трипановый синий до внедрения для помощи в месте при резании11. Метод, описанный здесь включает в себя использование гистологический краситель для ориентации органоид/гистология gelplug во время внедрения для повышения эффективности секционирование. H & E слайды содействовать изучению некроза, ядерной текстуры и распространением, и таким образом она должна быть обязательной конечную точку для органоид культуры для обеспечения того, чтобы клетки здоровых всей области. Сила органоид культуры является, что образцы состоят из гетерогенных смесь клеток, которые лучше напоминают в vivo пациента ткани. Например, в предстательной железе, базальную и просветный клетки присутствуют в простаты organoids5, при этом клетки, выращенных в 2D отсутствие Люминал дифференцировки8. Чтобы оценить органоид дифференциации, рекомендуется, что исследователи оценить базальной маркеры например CK5 и Р63 и просветный маркеры например андрогенных рецепторов и CK88. Любые другие экспериментальные протеинов интереса также могут быть изучены с помощью эти методы окраски.
Хотя FFPE разделы позволяют визуализации ячеек, проживающих в внутренний отсек через гистологических методов (H & E, если, ИГХ), изображения ограничены сечения, и органоид формы могут быть изменены в процессе внедрения. Целом гора окрашивание позволяет органоид витражи и наблюдается в месте, сохраняя морфологических фенотипы и разрешение изображения белка локализации. Целом монтаж представляет собой инструмент использовать пятно целом ткани или целое животное образцов, например мыши или zebrafish эмбриона и легко адаптируется для organoids. Метод, описанный здесь была изменена от процедуры Маэи др. 11, в котором детали первоначального роста и культуры желудочно-кишечного тракта organoids прямо на слайде камеры для окраски и требует фиксации всей родительской культуры. Метод конспектированный здесь включает в себя передачу одного органоид (или organoids) интерес на камере слайд во время окрашивания. Это позволяет выбор отдельных organoids для анализа состава Гора в ходе текущего эксперимента без фиксации родительской культуры. При выполнении всего гора окрашивание, необходимо оптимизировать permeabilization и время инкубации для первичных и вторичных антител для обеспечения проникновения во всем образца (везде от одного или более дней рекомендуется). После того, как образ через confocal микроскопии, 3D визуализации могут быть изготовлены для включения визуализации и локализации определенного белка и рассчитать количество положительно окрашенных клеток в образце. Проточной цитометрии является полезным конечной точкой для количественного определения населения базальной, Люминал, или стволовых клеток5,14. Чтобы сделать это, клетки оправился от матрицы геля и аккуратно отделить для окрашивания. Пользователям следует тщательно выбрать соответствующие маркеры для разделения на основе текущей литературы. Для человека первичной эпителиальных клеток простаты CD26 и CD49f являются подходящей Люминал и базальной маркеры, соответственно5,21.
Таким образом этот протокол детали роста человека первичной простаты органоид, коллекции и экспериментальной конечные точки. Следует отметить описал технику монтажа может применяться к целому ряду других анализов, которые обычно используются для 2D клеток, таких как флуоресцентный зонд на основе экспериментов, глядя на распространение19, апоптоз и внутриклеточных органелл пятна. Кроме того сбор и диссоциации метод, описанный здесь могли бы использоваться в рамках подготовки к одной клеточной РНК последовательности18. Коллективно это демонстрирует возможность для различных роман, высококачественный конечные точки, которые исследователи могут оптимизировать и изучить в будущем.

Organoids являются ценным инструментом для изучения Органогенез и болезни. Они обеспечивают менее дорогой альтернативой животных моделях, и пациент производные organoids развиваются как стратегия для персонализированной медицины1,2,3. Эта система трехмерного (3D) культуры включает в себя заполнение стволовых и прогениторных клеток (из ткани или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) в гель компоненты внеклеточного матрикса (матрицы геля)4. Клетки размножаются и дифференцировать, что приводит к organotypic структур, которые пилки сотовой иерархии и морфология органа интерес в функциональной единицы. Organoids с использованием клеток, происходящих из различных органов, в том числе слюнной железы, желудка, кишечника, печени, простаты, легких и мозга4были выросли. Хотя существует множество протоколов, описывающие шаги по созданию простаты organoids5,6, это сложно найти достаточно подробную методы о том, как добиться количественного конечных точек от organoids. В этом документе обобщаются методы, разработанные для человека первичных клеток простаты и подробности ряд предлагаемых конечных точек для оценки органоид фенотипов. Эти методы были оптимизированы для простаты organoids и могут применяться в других 3D клеточных культур.
Простаты органоид культур недавно появились как ценный в vitro модель, которая не имеет ограничений монослоя культур с использованием установленных увековечен клеточных линий. Доброкачественные эпителия простаты и рака простаты является сложной задачей для модели в пробирке с помощью увековечен клеточных линий. Количество линий доброкачественных клеток ограничено, и все претерпели изменения с онкогенов7. Первичный эпителиальные клетки простаты в монослои не дифференцироваться в Люминал клетки и отсутствие андрогенных рецепторов8. Большинство линий клеток рака простаты не имеют функциональные андрогенных рецепторов, посредником значительное раннее болезненное состояние, и отсутствие ключевых генетические изменения, которые были найдены в пациента опухоли9. Простаты органоид культур можно легко выращивать из доброкачественных эпителия и ценность в изучении свойств стволовых клеток, клеток-предшественников, дифференциация и экспериментальных изменений микроокружения4,5. Рак простаты organoids можно выращивать как часть подхода медицины точности для моделирования пациента заболеваний и реагирования на терапии10.
Этот протокол был составлен из существующих протоколов, которые используют различные типы клеток, но он был оптимизирован здесь для использования в человека первичных клеток простаты. Он делал комплименты протоколы, изложенные Сойерс, Clevers и Шэнь5,6 , описывающие рост, пассированый, светлые области изображения, криоконсервация и РНК и ДНК изоляции простаты мыши и человека organoids. Целом гора протокол изменяется от Маэ и др. 11, который использовал желудочно-кишечного эпителия organoids и описывает живут изображений и замороженных и парафиновые встраивание. Borten и др. 12 описал анализ груди, толстой кишки и рака прямой кишки органоид морфологии от ярко поля изображений. Кроме того, Ричардс и др. 13 используется метод морфологической оценки простаты organoids. Наконец, Ху и др. 14 описал метод придерживаясь простаты, organoids в камере слайд на ночь перед immunofluorescent окрашивание соблюдать отдельные ячейки и дисперсия сфер для анализа потока цитометрии.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации достаточно подробно эти технически сложные методы как один протокол, включая заполнение ячейки; средства массовой информации и матрицы геля обслуживания; Коллекция ячеек для проточной цитометрии; РНК, ДНК и белка добычу; морфологическая оценка от ярко поле z стека анализа; Встраивание, обработка и секционирование для гистологической пятнать; и всего монтаж иммунофлюоресценции или флуоресцентного зонда анализов. Биологическое значение и толкование этих различных конечных точек будет варьироваться между экспериментальный дизайн и антитела, которые используются для анализа. Путем использования этого протокола пользователи должны чувствовать себя готовы создать эксперимент с инструментарий конечных точек.
Человека первичной предстательной железы клетки эпителия (PrE) были созданы в лаборатории протоколом описан Peehl15,16 и поддерживается ограниченное количество ходов (до четырех) как описано17, но они также являются имеющиеся у коммерческих поставщиков. Гепатоцит сыворотки бесплатный медиа основанный6, на основе KSFM13и R-spondin 1-кондиционером5 СМИ публикуются как успешно произведя organoids. На основе KSFM требуется наименьшее количество добавок, поэтому это описано здесь.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Этот документ описывает подробный протокол для трехмерных (3D) культивирование, обработки и оценки человека первичной простаты organoids. Процесс включает в себя заполнение клеток эпителия негусто в 3D матрицы геля на 96-луночных микропланшетов с изменениями СМИ культивировать экспансию organoids. Морфология затем оценивается в целом ну захвата z стека изображений. Сжатие z стеки создает единый образ в фокусе, из которого organoids измеряются для количественного определения различных мероприятий, включая округлости, округлость и области. ДНК, РНК и белка могут быть собраны из organoids оправился от матрицы геля. Клеточных популяций интерес может оцениваться органоид диссоциации и проточная цитометрия. Формалин фиксации парафин внедрение (FFPE) следуют секционирование используется для гистологической оценки и Пятнать антитела. Целом гора immunofluorescent окрашивание сохраняет органоид морфологии и облегчает наблюдение локализации протеина в organoids в situ. Коммерческих анализов, которые традиционно используются для 2D монослоя клеток могут быть изменены для 3D organoids. Используются вместе, методам в этом протоколе обеспечивают надежный инструментарий для количественной оценки роста простаты органоид, морфологические характеристики и выражение дифференциации маркеров.

После успешной культуры человека первичной простаты organoids морфология и дифференциация может быть оценена с помощью анализа светлые области изображения и FFPE и целом гора пятная методов.
Процесс захвата светлые области изображения иллюстрируется на рисунке 1A. Organoids выращиваются в матрице 3D и рассредоточены по разные фокальной плоскости. Соблюдать organoids в фокусе во многих плоскостях, предлагается использовать изображение EDF (рис. 1B, право) вместо одной плоскости z (Рисунок 1B, слева). В лаборатории organoids, выращиваемые в различных экспериментальных условиях может привести к изменениям в морфологии. С помощью области, цикличность (определяется как аналогичные органоид является круг) и Макс/мин радиус (мера длины) дать пользователям представление о органоид размер и форму и количественной индикации морфологии. Чтобы подчеркнуть полезность этих мер, представитель изображения organoids с похожей области но различной морфологии указаны в Рисунок 1 c, в котором долго органоид будет меньше круговой и соотношении больше Максимальная/минимальная чем сферической органоид.
Встраивание organoids для гистологии является полезным конечной наблюдать интерьер образцов и убедиться что некроза не присутствует в ядро органоид. Рабочий процесс для этого процесса и представительных результатов безупречная, секционного образцов под микроскопом ярко поля приведены в рисунке 2AB, C. На рисунке 3A показывает, засланный органоид (слева) по сравнению с правильно передал organoids в рисунке 3A (справа) и на рисунке 3B. Чтобы определить состояние дифференциация образца, рекомендуется смотреть на базальных клеток маркеры (Цитокератины 5 и Р63)8 вместе с Люминал ячейки маркеры (Цитокератины 8)8. Если желательно, чтобы пятно organoids в situ, всего Маунт окрашивание является удобной альтернативой, и эти представительные результаты предоставляются в рисунке 3 cD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Рисунок 1: оценки морфологии organoids в 3D культуры. (A) изображения коллекции и сжатия рабочего процесса для человека первичной простаты organoids приобретена пропускаемого света инвертированный микроскоп с моторизованным X / Y, стадии и компаньон программное обеспечение для сканирования. (B) представитель образы одного z стека (слева) против. EDF изображение (справа) целом ну образец человека первичной простаты organoids, показаны, что больше organoids находятся в центре внимания, когда несколько z стеки объединяются в единый проецируемого изображения (шкала бар = 1000 мкм). (C) представитель изображений для области, цикличность и Макс/мин соотношение морфологически разнородных человека первичной organoids простаты, которые имеют одинаковую площадь (шкала бар = 200 мкм). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Рисунок 2: органоид встраивание рабочего процесса и представитель секционирование результаты. (A) человека первичной простаты органоид, встраивание рабочего процесса. (B) представитель изображение безупречная, свежие слайд, содержащий человека первичной простаты organoids под микроскопом светлые области, изображающие агар (зеленая стрелка), гистология гель (черная стрелка), пузырь (синяя стрелка), organoids (красные стрелки) (шкалы бар = 1000 мкг m). (C) незапятнанное свежесрезанных слайд (слева) против. Безупречная сухой слайд (справа), organoids (красные стрелки) появляются полупрозрачные, когда сухой (шкалы бар = 500 мкм) и труднее различить под микроскопом ярко поле. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Рисунок 3: гистологические окрашивания на секционного и смонтированы целом organoids. (A) H & E окрашивание сломанной человека первичной простаты органоид от неправильного (агрессивный закупорить, неправильно обработки протокола, слева) рядом с хорошо обрабатываются органоид (справа) (шкалы бар = 100 мкм). (B) человека первичной простаты органоид, которая была исправлена формалин, парафин врезанных, секционного и витражи с базальной Цитокератины 5 или Люминал Цитокератины 8 (вверху) или базальный p63 и просветный Цитокератины 8 (внизу) и образы с (Конфокальный микроскоп шкалы бар = 100 мкм). (C) целом монтируется человека первичной простаты органоид витражи с базальной Цитокератины 5 или Люминал Цитокератины 8 и counterstained с Фаллоидин и DAPI, отображаемого с конфокального микроскопа (шкала бар = 100 мкм). (D) целом монтируется первичной простаты клеток человека органоид, окрашенных с дневно помечены Эду и Счетчик витражи с Hoescht, отображаемого с конфокального микроскопа (шкала бар = 500 мкм) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Здесь мы представляем протокол руководство человека первичной простаты органоид обработки, а затем предложить конечные точки для оценки фенотип. Посева, культура обслуживания, восстановления от матрицы геля, описаны морфологической количественной оценки, внедрения и секционирование, FFPE секционирование, целом гора окрашивание и применение коммерческих анализов.

Обработка и оценка человека первичной простаты органоид культуры

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Органоиды простаты являются захватывающей системой in vitro для изучения развития и болезней. Они преодолевают трудности увековеченных клеточных линий и предлагают недорогую альтернативу моделям животных. Они могут быть выращены из клеток простаты человека, как мы показали в этом протоколе, а также клетки предстательной железы мыши, как болезнепролевая доклиническая модель системы.Многие лаборатории описали полезные методы культуры и конечные точки. Но мы надеемся объединить эти детали в один протокол и продемонстрировать особенно сложные шаги для новых пользователей. По мере того как методы улучшают, органоиды рака простаты можно вырасти от образцов пациента как подход микстуры точности к заболеванию модели и реакции к терапии.Культурные условия специфичны для органоидов простаты, однако многие из конечных точек были адаптированы из других типов тканей. Пользователь может адаптировать часть этого протокола к своему типу ячейки. Начните этот эксперимент с выращивания эпителиальных клеток в матричных гелях, закодированных 96-колодец пластин, как описано в рукописи.Для сбора органоидов из пластин через 12 дней, удалить средний из скважин, не нарушая матричного геля. Затем сразу же добавить около 200 микролитров нейтральной протеазы к каждому хорошо примерно один-два соотношения матричного геля к нейтральной протеазы. Инкубировать пластину в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию.Затем пипетка вверх и вниз, чтобы механически разобщить смесь, и инкубировать снова в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. После инкубации перенесите нейтральную матричную гель-клеточную смесь протеазы из нескольких скважин в микроцентрифугную трубку. Пеллет клетки центрифугации в 300 раз г в течение трех-пяти минут.Удалите супернатант и сохраните органоидные гранулы для последующего анализа. Чтобы создать формы для встраивания, вырежьте небольшой участок 1000-микролитровый наконечник пипетки, чтобы сделать цилиндр, который вмещает 50 микролитров. Затем из более широкой части того же кончика, сделать второй более широкой формы, которая подходит вокруг первой формы.Чтобы создать холодный блок, оберните ледяной пакет лентой с клейкой стороной вверх. Затем придерживаться формы перпендикулярно ленты. Чтобы встроить органоиды в гистологический гель для обработки, сначала вымойте ранее полученные органоидные гранулы одним миллилитром сбалансированного соленого раствора Хэнка.После центрифугирования при 300 раз г в течение трех-пяти минут, удалить супернатант. Затем добавьте от 30 до 50 микролитров жидкого гистологического геля в органоидные гранулы и аккуратно перемешайте, медленно трубя вверх и вниз, чтобы повторно использовать гранулы. Перенесите эту смесь в форму на холодный блок, и дайте образцу остыть и затвердеть в вилку.Далее, используйте поршень, чтобы нажать вилку из небольшой формы и в центре большей плесени, и заполнить его путем трубопроводов ясно 2%agar вокруг вилки. Чтобы отметить в верхней части образца, пипетка гистологических красителей тонированные 2%agar на верхней части вилки. После того, как агар остынет, используйте поршень для передачи вилки в гистологическую кассету.Этикетка кассеты с карандашом и поместите его в 10%neutral буферных формалин для ночной фиксации. На следующий день перенесите кассету с 10%нейтрального буферного формалина на 70% гистологического этанола, и обработать его дальше и встроить в парафин. Начните с обрезки основания блока толщиной 10 микрометров.Как только появится раздел, содержащий область вилки, прекратите обрезку. Заблокировыв ротор микротома, и перенесите блок обратно на лед, чтобы охладиться. Перемести лезвие на новую, неиспользованную часть.И перенесите блок обратно на зажим. Разблокировка машины и начать обрезку на пять микрометров на секцию. Используйте пинцет, чтобы перенести секцию на 40-градусную ванну с водой по Цельсию и дать ей разложиться.Опустите слайд вертикально в воду, чтобы перенести раздел на него. Затем наблюдайте за слайдом под ярким полевым микроскопом, чтобы убедиться, что органоид присутствует в разделе. Выпекать на ночь при температуре от 45 до 50 градусов по Цельсию, а затем приступить к окрашивания, как описано в рукописи.Начните эту часть эксперимента с неиспользованных колодцев 96-хорошо матричной гелеобразной пластины с органоидами. Путем pipetting против стороны хорошо, оставляя пространство между средствами массовой информации и матричного геля, тщательно удалить как можно больше средств массовой информации, как это возможно, не нарушая органоидной культуры. Используйте обрезанный 1000-микролитровый наконечник пипетки, предварительно мокрый с PBS, чтобы составить одну каплю матричного геля, который содержит органоиды, представляющие интерес.Выпредельте падение на середину камерного слайда. Невооруженным глазом, аспирировать избыток средств массовой информации и матричного геля из камеры слайд с помощью тонкой наконечником пипетки. Поощрять присоединение органоидов к стеклу и предотвращать потерю образцов во время последующих шагов стирки.Поместите горку в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 30-45 минут. Трубопровод медленно, чтобы предотвратить отслоение от блюда, добавить 200 микролитров 1X PBS для мытья органоидов в течение пяти минут при комнатной температуре с нежной тряской. Аккуратно удалите 1X PBS и добавьте 200 микролитров 4%paraformaldehyde.Исправить в течение 30 минут при комнатной температуре с нежной тряской. В PFA, мыть и приступить к последующей протеабилизации и окрашивания шаги, как описано в этом протоколе. Гора и изображение немедленно.Неокрашенные свежесрезанные слайды ясно показывают человека первичных органоидов простаты, в то время как в неокрашенных сухой слайд, органоиды появляются полупрозрачные и труднее обнаружить под ярким полевым микроскопом. Гематоксилин и эозин окрашивание показывает сломанной человеческой первичной простаты органоид от неправильного обращения, такие как агрессивные пипетки, неправильный протокол обработки по сравнению с хорошо обработанной органоид. Первичный органоид предстательной железы человека был формалин-фиксированный, парафин-встроенный, секционные, и окрашенные базальным цитокератин 5 и светящийся цитокератин 8, базальный p63 и светящийся цитокератин 8, и изображены с конфокальным микроскопом.Цельно-установленный первичный органоид простаты человека был окрашен базальным цитокератином 5 или люминесцентным цитокератином 8, и противояльцем фаллоидином и ДАПИ, и изображен конфокальным микроскопом. Цельно-установленный человеческий первичный органоид клеток простаты был окрашен флуоресцентно помечены Эду и противоядие с Hoescht, и изображены с конфокального микроскопа. Важно визуализировать органоиды на протяжении всей процедуры.После сбора разделов, убедитесь, что визуализировать образцы на слайде, и убедитесь, что вы наблюдаете органоидов во время цельного монтажа. После сбора органоидов из матричного геля, вы можете цельно-монтировать их и использовать коммерческие анализы, или отмежеваться от одиночных клеток для цитометрии потока или одноклеточного секвенирования. 3D культура предоставляет исследователям новый способ изучения тканей в условиях лабораторного блюда.Он может быть применен к органогенезу, или к пониманию патологии болезни пациента. При работе с образцами пациента, всегда проявлять осторожность и обрабатывать материалы, как потенциал для воздействия патогенов, передающихся через кровь.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Оценка воздействия многократного воздействия Органотипической 3D бронхов и тканей носа культуры модели для всей сигаретного дыма

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Гормон проблематику 3D Культура модель человеческого эпителия молочной железы

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Автоматизированных роботов жидкой обработке Ассамблеи устройств модульной ДНК

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Микрожидком Flow камера Модель тромбоцитами трансфузиологии и гемостаза меры тромбоцитов Отложение и фибрина Формирование в режиме реального времени

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Доклиническая кардиологическая электрофизиология по двойному напряжению и оптическому картированию кальция органов человеческого сердца

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Технологическая платформа с открытым исходным кодом для производства 3D-моделей культур на основе гидрогеля автоматизированным и стандартизированным способом

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Метод культуры для поддержания тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...