Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Agradecemos a los miembros de la UIC Biorespository, Dr. Klara Valyi-Nagy y Alex Susma, así como los urólogos, los Drs. Michael Abern, Daniel Moreira y Simone Crivallero, para la facilitación de la adquisición de tejido para las culturas de célula primaria. Agradecemos a los pacientes de Urología de la UIC para donar sus tejidos para investigación. Este trabajo fue financiado, en parte, por el Departamento de defensa de la próstata cáncer de investigación programa salud disparidades Idea Premio PC121923 (Nonn) y UIC centro clínico y traducción recibió educación para (clínicos y científicos traslacionales PECTS) programa (McCray y Richards) y por los institutos nacionales de Salud Instituto Nacional del cáncer, Grant números U54CA202995, U54CA202997 y U54CA203000, conocida como la Chicago salud equidad colaborativo (Nonn y Richards). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o el Departamento de defensa.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cultura Organotypic es un emocionante nuevo método para recapitular el tejido con la comodidad de un ambiente en vitro . Actualmente, laboratorios crecen organoides de muchos tipos de tejidos para diferentes extremos. Los métodos descritos en este artículo Resumen extremos útiles y destacan nuevas técnicas para caracterizar totalmente los cultivos celulares de próstata primario 3D.
Hay una gran variedad de recetas de medios de cultivo de células humanas de próstata primario organitas5,6,13. Mientras todos obtener resultados viables y comparables, KSFM-medios de comunicación13 utiliza aditivos mínima por lo que se describe aquí. Además, se han publicado documentos utilizando varias concentraciones para el gel de la matriz, desde 10% hasta un 75% a cultura organitas próstata5,6,13. Porque el gel de matriz es un reactivo caro, y gel de matriz 33% ha demostrado ser suficiente para cultivar a largo plazo (2-3 semanas), viable, las organitas13, esto es la concentración recomendada. Sin embargo, gel de la matriz puede variar en la concentración de proteínas entre los números de lote, para que esto debe tenerse en cuenta cuando de la galjanoplastia. Se recomienda también comprar gel de la matriz a granel para uso a través de múltiples experimentos para reducir la incongruencia entre lotes. Otros laboratorios han publicado diferentes formatos de gel de la matriz, como gotas en lugar de una placa de 96 pocillos bien5la capa de la galjanoplastia. Ambos métodos forman organitas viable, pero el formato aquí descrito permite células a ser plateado más escaso, que se ha demostrado para promover la expansión de las células en mayor organitas13. Sin embargo, galjanoplastia densidad debe ser optimizada basada en eficiencia de formación específico para cada paciente. Gel de matriz está disponible en varios formatos incluyendo el factor de crecimiento reducido, sin rojo de fenol, alta concentración, etcetera. Reducido factor de crecimiento se recomienda definir las condiciones de cultivo y sin rojo fenol se recomienda cuando se trabaja con las células que expresan GFP o en experimentos que involucran la captura de imágenes z-pila. Es fundamental que cualquier pasos de galjanoplastia de gel de matriz sea realizado con reactivos helados, como gel de la matriz se solidifica rápidamente a temperatura ambiente.
Organoides bajo diferentes tratamientos experimentales pueden resultar en cambios a la forma, así la proyección de imagen de campo claro es ampliamente utilizada para el estudio de fenotipos morfológicos observados. Sin embargo, registro y cuantificación de área o forma es un reto por dos razones: 1) selección sesgada durante la captura de la imagen y 2) aplicando un parámetro bidimensional como tridimensional muestra. Una estrategia de captura de la imagen es registrar un campo al azar y medir un número predeterminado de organoides en ese campo, pero esto puede crear sesgo durante la selección y organitas todos en el campo seleccionado pueden no estar en foco. Proyección de imagen de todo bien optimizado para el formato de microplacas de 96 pocillos elimina este sesgo de muestreo recolectando el organoide toda población de interés. Sin embargo, dependiendo de los objetivos de microscopio en mano, múltiples campos deba recogerse y azulejos con el fin de obtener una imagen de todo bien. Algunos laboratorios han descrito área medición de un solo plano z12, pero para capturar todos los organoides en foco, se recomienda recoger y apilar varios planos en una sola imagen FED13. En algunos casos, un menisco en el gel de la matriz puede provocar viñeteo en la imagen, y métodos de corrección de fondo deba aplicarse mediante software de análisis de imagen. Volumen exacto ideal es la medición más adecuada para tamaño de organoides; sin embargo, esto es difícil de obtener precisión, incluso con múltiples imágenes z-stack. Otras dimensiones morfológicas útiles, tales como la circularidad y la relación de máximos y mínimos, pueden calcularse fácilmente de todos los organoides en una imagen de la Fed de todo bien. Juntos, estos métodos superar retos sesgos de muestreo y permitan la medición de parámetros 2D de objetos 3D en un espacio 3D.
Fijación de formalina y de inclusión en parafina de organoides es un método común para obtener la hematoxilina y eosina (H & E), inmunohistoquímica (IHC) y coloración inmunofluorescente (IF) para visualización y análisis6,11, 20. sin embargo, publicaciones que han descrito esta técnica carecen de información completa sobre el proceso de inclusión. Además, puede ser difícil localizar organitas dentro del bloque de parafina. Algunos laboratorios la manchan organoides con trypan azul antes de incrustar para ayudar en la ubicación en la sección11. El método descrito aquí incorpora el uso de un colorante histológico para la orientación de la gelplug de organoide/histología durante la incrustación para promover la eficiencia de seccionamiento. Diapositivas de H & E facilitan examen de necrosis, textura nuclear y proliferación, y así debe ser un punto final obligatorio de organoide cultura para asegurarse de que las células estén sanas a lo largo de la esfera. Una fuerza de la cultura de organoide es que las muestras se componen de una mezcla heterogénea de células que parecen mejor en vivo paciente tejido. En la próstata, por ejemplo, las células basals y luminales están presentes en la próstata organitas5, mientras que las células cultivadas en 2D falta diferenciación luminal8. Para evaluar la diferenciación organoide, es aconsejable que los investigadores evaluación marcadores basales como CK5 y p63 y luminal como receptores de andrógenos y CK88. Cualquier otras proteínas experimentales de interés también pueden ser estudiadas usando estas técnicas de tinción.
Aunque las secciones FFPE permiten la visualización de las células que residen en el compartimiento interno vía histologic métodos (H & E, si, IHC), imágenes se limitan a los cortes transversales, y forma de organoides puede ser alterado por el proceso de inclusión. Conjunto montaje coloración permite un organoide teñidas y observadas en situ, conservación de fenotipos morfológicos y permitiendo imágenes de localización de la proteína. Montaje de conjunto es una herramienta utilizada para teñir a muestras todo tejido o animal entero, como el embrión de pez cebra o el ratón y se adapta fácilmente para el organitas. La técnica descrita aquí fue modificada al procedimiento por Mahéet al. 11, que detalla el crecimiento inicial y la cultura de organoides gastrointestinal directamente en un portaobjetos de la cámara para la tinción y requiere la fijación de la cultura de todo padre. El método descrito aquí consiste en la transferencia de un organoide único (u organoides) de interés en un portaobjetos de la cámara en el momento de la coloración. Esto permite la selección de organoides individuales para el análisis conjunto de montaje en un experimento continuo sin la fijación de la cultura de los padres. Al realizar montaje en conjunto la coloración, es necesario optimizar la permeabilización y el tiempo de incubación para los anticuerpos primarios y secundarios asegurar penetración a lo largo de la muestra (en cualquier parte de uno o más días es recomendado). Una vez fotografiado mediante microscopía confocal, se pueden producir renders 3D para activar la visualización y localización de una proteína específica y calcular el número de células teñidas positivamente presentes en una muestra. Citometría de flujo es un extremo útil para cuantificar poblaciones de basal, luminal, o células madre5,14. Para hacer esto, las células son recuperadas del gel de la matriz y ligeramente disociadas para tinción. Los usuarios deben seleccionar cuidadosamente marcadores apropiados para la separación basada en la literatura actual. Para humanas primarias próstata las células epiteliales, CD26 y CD49f son convenientes marcadores luminales y basals, respectivamente de5,21.
En Resumen, este protocolo detalla crecimiento organoide de próstata primario humano, recolección y variables principales de evaluación experimental. De la nota, la técnica de montaje descrita puede aplicarse a una variedad de otros ensayos que se emplean normalmente para células 2D, como los experimentos basados en la punta de prueba fluorescentes mirando manchas de organelo subcelular, apoptosis y proliferación19. Además, el método de colección y disociación descrito aquí podría utilizarse en la preparación de unicelular de la secuencia de RNA18. Colectivamente, esto demuestra la posibilidad de una variedad de la novela, los extremos de alta fidelidad que los investigadores pueden optimizar y explorar en el futuro.

Organoides son una valiosa herramienta para el estudio de la organogénesis y la enfermedad. Ofrecen una alternativa menos costosa a modelos animales y organoides derivados del paciente están evolucionando como estrategia de medicina personalizada1,2,3. Este sistema de cultivo (3D) tridimensional implica la siembra de células madre o progenitoras (extraídas del tejido o inducida de células madre pluripotentes) en un gel de matriz extracelular componentes (gel de la matriz)4. Las células proliferan y diferencian, dando lugar a estructuras organotypic que recapitulan la jerarquía celular y morfología de los órganos de la unidad funcional de interés. Organoides se han cultivado con células procedentes de una variedad de órganos, incluyendo glándulas salivales, estómago, intestino, hígado, próstata, pulmón y cerebro4. Aunque existen numerosos protocolos que describen los pasos para establecer organitas próstata5,6, es difícil encontrar métodos suficientemente detallados sobre cómo lograr criterios de valoración cuantitativas de organoides. Este artículo resume los métodos desarrollados para las células humanas de próstata primarias y detalla una serie de puntos finales sugeridos para determinar los fenotipos de organoide. Estas técnicas fueron optimizadas para próstata organoides y pueden ser aplicables a otros cultivos celulares 3D.
Organoide próstata culturas han surgido recientemente como un modelo valioso en vitro que carece de las limitaciones de las culturas de monocapa utilizando estableció líneas celulares inmortalizadas. Epitelio benigno de próstata y cáncer de próstata es un desafío al modelo en vitro con líneas celulares inmortalizadas. El número de líneas celulares benignos es limitado, y todos han experimentado transformación con oncogenes7. Células epiteliales próstata primarias en monocapas no se diferencian en las células luminales y carecen de receptores de andrógeno8. La mayoría de líneas celulares de cáncer de próstata no tienen receptores androgénicos funcionales, un importante mediador de estado temprano de la enfermedad y falta clave los cambios genéticos que se han encontrado en tumores de pacientes9. Organoide próstata culturas pueden cultivarse fácilmente de epitelio benigno y son valiosas en el estudio de propiedades de células madre, células progenitoras, la diferenciación y efectos de los cambios experimentales en el microambiente4,5. Cáncer de próstata organitas pueden cultivarse como parte de un enfoque de la medicina de precisión para modelado de enfermedad del paciente y la respuesta a terapias10.
Este protocolo ha sido recopilada de los protocolos que utilizan diversos tipos celulares, pero se ha optimizado aquí para su uso en células humanas de próstata primarias. Complementa los protocolos descritos por aserradores, Clevers y Shen5,6 que describen el crecimiento, pases, proyección de imagen de campo claro, criopreservación y aislamiento de ARN y ADN de próstata mouse y organitas humano. Se modifica el protocolo conjunto de montaje de Mahé et al. 11, organitas epitelial gastrointestinal que describe en vivo imagen y congelados e inclusión en parafina. Borten et al. 12 se describe el análisis de mama, colon y cáncer colorrectal organoide morfología de proyección de imagen de campo claro. Además, Richards et al. 13 utiliza un método para la evaluación morfológica de próstata organitas. Finalmente, Hu et al. 14 describe un método de adhesión próstata organitas en una diapositiva de la cámara durante la noche antes de la tinción inmunofluorescente para observar las células y la dispersión de las esferas para el análisis de citometría de flujo.
El objetivo de este protocolo es demostrar detalladamente estos métodos técnicamente desafiantes como un protocolo, incluyendo la siembra de la célula; los medios de comunicación y de la matriz del gel mantenimiento; colección de células por citometría de flujo; ARN, ADN y extracción de proteínas; evaluación morfológica de análisis de campo brillante z-stack; inclusión, de transformación y seccionamiento para tinción histológica; y todo por inmunofluorescencia o análisis de la sonda fluorescente. La importancia biológica y la interpretación de estos diferentes criterios de valoración variarán entre anticuerpos utilizados para análisis y diseño experimental. A través de la utilización de este protocolo, los usuarios deben sentirse preparados para establecer un experimento con un conjunto de puntos finales.
Células epiteliales prostáticas primarias humanas (PrE) se establecieron en el laboratorio por el protocolo descrito por Peehl15,16 y mantiene a un número limitado de pasajes (hasta cuatro) como se describió anteriormente17, pero también son disponibles de proveedores comerciales. Hepatocitos libre de suero basado en los medios de comunicación6, KSFM-base13y R-spondin acondicionado 15 medios de comunicación se publican como haber elaborado con éxito organitas. KSFM-basado requiere la menor cantidad de aditivos, por lo que se describe aquí.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Este papel describe un protocolo detallado para tridimensional (3D) de cultivo, manejo y evaluación de organoides de próstata primario humano. El proceso implica la siembra de células epiteliales escasamente en un gel de matriz 3D en una microplaca de 96 pocillos con los cambios de los medios de comunicación para cultivar expansión en organoides. Morfología se evalúa entonces todo bien capturando imágenes z-stack. Compresión de pilas de z crea una imagen en foco que organoides se miden para cuantificar una gran variedad de productos, incluyendo la circularidad, la redondez y la zona. DNA, RNA y proteínas se pueden recoger en organoides recuperado del gel de la matriz. Poblaciones celulares de interés pueden evaluarse por la disociación de organoides y citometría de flujo. Formol-fijación--inclusión en parafina (FFPE) seguido de seccionamiento se utiliza para la evaluación histológica y anticuerpos. Conjunto montaje coloración inmunofluorescente conserva morfología organoide y facilita la observación de la localización de la proteína en organoides en situ. Ensayos comerciales que tradicionalmente se utilizan para las células de la monocapa 2D pueden modificarse para 3D organitas. Utilizan juntos, las técnicas en este protocolo proporcionan una robusta caja de herramientas para cuantificar la expresión de marcadores de diferenciación, crecimiento organoide próstata y características morfológicas.

Sobre cultura exitosa de organoides de próstata primario humano, morfología y diferenciación pueden evaluarse mediante análisis de imágenes de campo claro y FFPE y técnicas de tinción montaje en conjunto.
El proceso de captura de imágenes de campo claro se ilustra en la figura 1A. Organoides son cultivados en una matriz 3D y dispersos a través de diferentes planos focales. Para observar organitas en foco a través de muchos aviones, se sugiere utilizar una imagen de la Fed (figura 1B, derecha) en lugar de un solo plano de z (figura 1B, izquierda). En el laboratorio, organitas cultivadas bajo diferentes condiciones experimentales pueden resultar en cambios en la morfología. Usando el área, circularidad (definido por lo parecido del organoide es un círculo) y radio max/min (medida de longitud) indicar a los usuarios de forma y tamaño de organoides y proporcionan una lectura cuantificable de morfología. Para enfatizar la utilidad de estas medidas, imágenes representativas de organoides con área similar pero diferentes morfología se muestran en la figura 1, en el cual un organoide largo será menos circular y tienen una mayor relación de máximos y mínimos que un esférico organoide.
Incrustación de organoides para la histología es un extremo útil para observar el interior de las muestras y asegurar que la necrosis no está presente dentro de la base de un organoide. Disponen de un flujo de trabajo para este proceso y los resultados representativos de las muestras bajo un microscopio de campo brillante sin manchas, seccionadas en la figura 2AB, C. Figura 3A muestra un organoide maltratado (izquierda) comparado con el bien entregado organitas en Figura 3A (derecha) y la figura 3B. Para determinar el estado de diferenciación de la muestra, se recomienda mirar basocelular marcadores (citoqueratina 5 y p63)8 junto con luminal de la célula marcadores (citoqueratina 8)8. Si se desea teñir organitas en situ, tinción de montaje en conjunto es una alternativa conveniente, y estos resultados representativos se proporcionan en la figura 3D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figura 1: evaluación de la morfología de organoides en cultura 3D. (A) imagen colección y compresión de flujo de trabajo para humanos organitas próstata primaria adquirida por una luz transmitida invertido microscopio con un motorizado X / Y etapa y compañero software de escaneo. (B) imágenes representativas de una sola z-pila (izquierda) vs. una imagen de la Fed (derecha) de una muestra de bien conjunto de organoides próstata primario humano, mostrando que más organitas están enfocadas al z-pilas múltiples se combinan en una sola imagen proyectada (barra de escala = 1000 μm). (C) imágenes representativas para el área, circularidad y max/min relación de organoides de próstata primario humano morfológicamente disímiles que tienen la misma área (barra de escala = 200 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figura 2: organoide incrustar representante secciones de resultados y flujo de trabajo. (A) organoide de próstata primario humano incrustar el flujo de trabajo. (B) imagen representativa de una diapositiva sin mancha, fresca que contiene organitas próstata primario humano bajo el microscopio de campo brillante con agar (flecha verde), gel de histología (flecha negra), burbuja (flecha azul), organoides (flechas rojas) (barra de escala = 1000 μ m). (C) mancha diapositiva recién cortada (izquierda) vs. diapositiva seca sin manchas (derecha), organoides (flechas rojas) aparecen transparente cuando se seca (barra de escala = 500 μm) y son más difíciles de distinguir bajo el microscopio de campo brillante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figura 3: tinción histológica en organoides seccionado y todo montado. (A) H & E tinción de un organoide de próstata primario humano roto por mal uso (uso agresivo, protocolo de procesamiento incorrecto, izquierda) junto a un organoide bien manejado (derecha) (barra de escala = 100 μm). (B) humano organoide de próstata primario que ha sido formalina-fijos, parafina-encajado, seccionadas y teñidas con citoqueratina basal 5 o luminal cytokeratin 8 (arriba) o basal p63 y citoqueratina luminal 8 (abajo) y fotografiada con microscopio confocal ( barra de escala = 100 μm). (C) un organoide próstata primario a largo humano montado en conjunto a teñidos con citoqueratina basal 5 o luminal citoqueratina 8 y contratinción con phalloidin y DAPI, fotografiada con microscopio confocal (barra de escala = 100 μm). (D) un organoide celular próstata primario humano montado todo manchado con fluorescencia etiquetada EdU y contador teñidas con Hoescht, fotografiada con microscopio confocal (barra de escala = 500 μm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Aquí, presentamos un protocolo guía de manejo de organoide de próstata primario humano y sugerir criterios de valoración para evaluar el fenotipo. Siembra, mantenimiento de la cultura, recuperación de gel de la matriz, cuantificación morfológica, incrustar y seccionamiento, FFPE seccionamiento, todo Monte tinción y aplicación de ensayos comerciales se describen.

Manejo y evaluación de la cultura humana organoide de próstata primario

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Los organoides de próstata son un sistema in vitro emocionante para estudiar el desarrollo y la enfermedad. Superan los desafíos de las líneas celulares inmortalizadas y ofrecen una alternativa económica a los modelos animales. Pueden cultivarse a partir de células de próstata humanas, como hemos demostrado en este protocolo, así como de células de próstata de ratón, como un sistema modelo preclínica relevante para la enfermedad.Muchos laboratorios han descrito métodos de referencia cultural y puntos de conexión útiles. Pero esperamos reunir esos detalles en un solo protocolo y demostrar los pasos particularmente desafiantes para los nuevos usuarios. A medida que las técnicas mejoran, los organoides del cáncer de próstata se pueden cultivar a partir de muestras de pacientes como un enfoque de medicina de precisión para la enfermedad modelo y la respuesta a las terapias.Las condiciones de cultivo son específicas de los organoides de próstata, sin embargo muchos de los puntos finales se han adaptado de otros tipos de tejido. Un usuario podría adaptar partes de este protocolo a su tipo de celda de interés. Comience este experimento mediante el crecimiento de células epiteliales en placas de 96 pozos codificadas en gel de matriz como se describe en el manuscrito.Para recoger organoides de las placas después de 12 días, retire el medio de los pozos sin alterar el gel de matriz. A continuación, añadir inmediatamente aproximadamente 200 microlitros de proteasa neutra a cada pozo en aproximadamente una relación de uno a dos de gel de matriz a proteasa neutra. Incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados.A continuación, pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar mecánicamente la mezcla, e incubar de nuevo durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, transfiera la mezcla de gel-célula de matriz de proteasa neutra de unos pocos pozos a un tubo de microcentrífuga. Pele las células por centrifugación a 300 veces g durante tres a cinco minutos.Retire el sobrenadante y guarde el pellet organoide para análisis posteriores. Para crear moldes para incrustar, corte una pequeña sección de una punta de pipeta de 1.000 microlitros para hacer un cilindro que contenga 50 microlitros. A continuación, desde la parte más ancha de la misma punta, hacer un segundo molde más ancho que se ajusta alrededor del primer molde.Para crear un bloque frío, envuelva una bolsa de hielo con cinta adhesiva con el lado adhesivo hacia arriba. A continuación, adhiera los moldes perpendicularmente a la cinta. Para incrustar los organoides en un tapón de gel histológico para su procesamiento, primero lave el pellet organoide previamente obtenido con un mililitro de la solución de sal equilibrada de Hank.Después de centrifugar a 300 veces g durante tres a cinco minutos, retire el sobrenadante. A continuación, agregue de 30 a 50 microlitros de gel de histología líquida al pellet organoide, y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet. Transfiera esta mezcla a un molde en el bloque frío, y deje que la muestra se enfríe y se solidifique en un tapón.A continuación, utilice un émbolo para empujar el enchufe fuera del molde pequeño y en el centro del molde más grande, y llénelo pipeteando claro 2%agar alrededor del enchufe. Para marcar la parte superior de la muestra, pipetee el 2% de agar teñido con tinte histológico en la parte superior del tapón. Una vez que el agar se haya enfriado, utilice un émbolo para transferir el enchufe a un casete histológico.Etiquete el cassette con un lápiz y colóquelo en una formalina tamponada 10% neutra para una fijación durante la noche. Al día siguiente, transfiera el casete de formalina tamponada 10% neutral a etanol de grado histológico al 70%, y proceselo más e instálelo en parafina. Comience recortando la base del bloque con un grosor de 10 micrómetros.Una vez que aparezca una sección que contenga el área del enchufe, deje de recortar. Bloquee el rotor del microtomo y transfiera el bloque de nuevo al hielo para enfriar. Mueva la hoja a una porción nueva y no utilizada.Y transfiera el bloque de vuelta a la abrazadera. Desbloquee la máquina y comience a recortar a cinco micrómetros por sección. Use pinzas para transferir la sección al baño de agua Celsius de 40 grados, y permita que se extienda.Sumerja un tobogán verticalmente en el agua para transferir la sección a ella. A continuación, observe la diapositiva bajo un microscopio de campo brillante para asegurarse de que un organoide está presente en la sección. Hornee durante la noche a 45 a 50 grados centígrados, y luego proceda con la tinción como se describe en el manuscrito.Comience esta parte del experimento con pozos no utilizados de la placa recubierta de gel de matriz de 96 pozos con organoides. Al pipetear contra el lado del pozo, dejando espacio entre los medios y el gel de matriz, retire cuidadosamente tantos medios como sea posible sin interrumpir el cultivo organoide. Utilice una punta de pipeta recortada de 1.000 microlitros, pre-mojada con PBS para extraer una gota de gel de matriz que contenga los organoides de interés.Dispensar la caída en el centro de un portaobjetos de la cámara. A simple vista, aspira el exceso de medios y el gel de matriz de la diapositiva de la cámara con una pipeta de punta fina. Promover la adherencia organoide al vidrio y evitar la pérdida de muestras durante los siguientes pasos de lavado.Coloque el portaobjetos en una incubadora de 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos. Pipeteando lentamente para evitar el desprendimiento del plato, agregue 200 microlitros de 1X PBS para lavar los organoides durante cinco minutos a temperatura ambiente con un suave temblor. Retire cuidadosamente el 1X PBS y agregue 200 microlitros de 4%paraformaldehído.Fijar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. En PFA, lave y proceda con los siguientes pasos de permeabilización y tinción según lo descrito por este protocolo. Monte e imagen inmediatamente.La diapositiva recién cortada sin mancha muestra claramente los organoides primarios de próstata humanos, mientras que en la diapositiva seca sin mancha, los organoides parecen translúcidos y son más difíciles de detectar bajo un microscopio de campo brillante. La tinción de hematoxilina y eosina muestra un organoide de próstata primario humano roto por un mal manejo, como pipeteo agresivo, protocolo de procesamiento incorrecto en comparación con un organoide bien manejado. El organoide prostático primario humano estaba fijado en formalina, incrustado en parafina, seccionado y teñido con citoqueratina basal 5 y citoqueratina luminal 8, p63 basal y citoqueratina luminal 8, e imágenes con microscopio confocal.Un organoide prostático primario humano de montaje completo se tiñó con citoqueratina basal 5 o citoqueratina luminal 8, y se contratuvieron con faloideina y DAPI, y se obtuvo una imagen con microscopio confocal. Un organoide de células prostáticas primarias de próstata de montaje completo fue manchado con Edu con etiqueta fluorescente y contrarrestado con Hoescht, e imágenes con microscopio confocal. Es importante visualizar los organoides a lo largo del procedimiento.Después de recoger las secciones, asegúrese de visualizar las muestras en la diapositiva y asegúrese de observar organoides durante el montaje completo. Después de recoger los organoides del gel de matriz, puede montarlos a todo el tamaño y utilizar ensayos comerciales, o disociar a células individuales para la citometría de flujo o secuenciación de una sola célula. El cultivo 3D proporciona a los investigadores una forma novedosa de estudiar el tejido en el entorno de un plato de laboratorio.Se puede aplicar a la organogénesis, o a la comprensión de la patología de la enfermedad de un paciente. Cuando trabaje con muestras de pacientes, tenga siempre cuidado y maneje los materiales como potencial para la exposición de patógenos transmitidos por la sangre.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Investigación

Bioingeniería

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...