Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Vi tackar UIC Biorespository medlemmar, Dr. Klara Valyi-Nagy och Alex Susma, liksom urologerna, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira och Simone Crivallero, för underlättande av vävnad förvärv för de primära cellkulturerna. Vi tackar UIC urologi patienterna för att donera sin vävnad till forskning. Detta arbete var delvis finansieras av den avdelning av försvar prostata Cancer forskning Program hälsa skillnader idé Award PC121923 (Nonn) och UIC centrum för klinisk och översättning Science Pre-doctoral utbildning för klinisk och translationell forskare ( NAR) Program (McCray och Richards) och av National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant nummer U54CA202995, U54CA202997 och U54CA203000, känd som den Chicago Health Equity Collaborative (Nonn och Richards). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health eller försvarsdepartementet.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Organotypic kultur är en spännande ny metod för går igenom vävnad med bekvämligheten av en in vitro- miljö. För närvarande växer labs organoids från många typer av vävnader för olika endpoints. De metoder som beskrivs i detta dokument sammanfattar användbar slutpunkter och lyfta fram nya tekniker för att karakterisera fullt 3D primära prostata cellkulturer.
Det finns en mängd olika media recept för odla humana primära prostata cell organoids5,6,13. Medan alla uppnå livskraftiga och jämförbara resultat, använder KSFM-baserat median13 minimala tillsatser så är det beskrivs här. Dessutom, har papper publicerats med flera koncentrationer för matrix gel, från 10% till 75% till kultur prostata organoids5,6,13. Eftersom matrisen gel är ett dyrt reagens, och 33% matrix gel har visat sig vara tillräckligt för att odla långsiktiga (2-3 veckor), livskraftig, unclumped organoids13, detta är den rekommendera koncentrationen. Matrix gel kan emellertid variera i proteinkoncentration mellan partinummer, så detta bör beaktas när plätering. Det rekommenderas också att köpa matrix gel i bulk för användning över flera experiment att minska inkonsekvens mellan massor. Andra laboratorier har publicerat olika format för plätering matrix gel, såsom droppar istället för beläggning en plattan med 96 brunnar väl5. Båda metoderna bilda livskraftiga organoids, men det format som beskrivs här kan för celler att beläggas mer glest, vilket har visat sig främja utbyggnaden av celler in i större organoids13. Dock bör plätering densitet optimeras baserat off patientspecifika bildandet effektivitet. Matrix gel finns i många format inklusive tillväxtfaktor-reducerad, fenolrött-fri, hög koncentration, etc. Tillväxtfaktor-reducerad rekommenderas för definierade kultur förhållanden och fenolrött-fri rekommenderas när du arbetar med celler som uttrycker GFP eller i experiment som involverar z-stack Bildinsamling. Det är viktigt att någon matris gel plätering steg utföras med iskall reagenser, som matris gelen stelnar snabbt i rumstemperatur.
Organoids odlas under olika experimentella behandlingar kan resultera i förändringar till formen, så ljusa-området imaging ofta används för att studera iakttagna morfologiska fenotyper. Inspelning och kvantifiera område eller form är dock en utmaning av två skäl: 1) urval bias under Bildinsamling och 2) tillämpa en tvådimensionell parameter såsom område på en tredimensionell provet. En strategi av Bildinsamling är att en slumpmässig postens och mäta ett förutbestämt antal organoids i fältet, men detta kan skapa bias under urval och alla organoids i det markerade fältet får inte vara i fokus. Hela-väl imaging optimerad för formatet 96 brunnar mikroplattan eliminerar denna provtagning partiskhet genom att samla hela organoid befolkningen av intresse. Dock kan flera fält beroende på mikroskopet målen å behöva samlas in och klinkergolv för att få en helhet-bra bild. Vissa labs har beskrivit mätområdet från en enda z-plan12, men för att fånga alla organoids i fokus, det rekommenderas att samla och stapla flera plan i en enda EUF-bild13. I vissa fall en menisk i matrix gel kan orsaka vinjettering i bilden, och bakgrunden korrigering metoder kan behöva tillämpas med hjälp av bild analys programvara. Exakta volymen är idealiskt det mest lämpliga måttet för organoid storlek; Detta är dock svårt att just få, även med flera z-stack bilder. Andra användbara morfologiska dimensioner, till exempel loopkontroll och högsta/lägsta förhållandet, kan enkelt beräknas från alla organoids i en hela-väl EUF bild. Tillsammans, dessa metoder övervinna provtagning bias utmaningar och möjliggöra mätning av 2D parametrar från 3D-objekt i en 3D-rymden.
Formalin fixering och paraffin inbäddning av organoids är en vanlig metod att få hematoxylin och eosin (H & E), immunhistokemisk (IHC) och Immunofluorescerande (om) färgning för visualisering och analys6,11, 20. dock publikationer som har beskrivit denna teknik saknar heltäckande Detaljer på inbäddning process. Dessutom kan det vara svårt att lokalisera organoids inom kvarteret paraffin. Vissa labs fläcken före organoids med trypan blå före inbäddning stöd i läge vid snittning11. Den metod som beskrivs här omfattar användning av en histologisk färgämne för orientering av den organoid/histologi gelplug under inbäddning för att främja effektiviteten i snittning. H & E diabilder underlätta prövningen av nekros, nukleära textur och spridning, och det bör alltså vara en obligatorisk slutpunkt för organoid kultur så att cellerna är friska hela sfären. En styrka med organoid kultur är att prover utgörs av en heterogen blandning av celler som bättre liknar i vivo patientens vävnad. I prostatan, till exempel är både basal och luminala celler närvarande i prostata organoids5, medan celler odlade i 2D brist luminal differentiering8. För att bedöma organoid differentiering, är det rekommenderat att forskare bedöma basala markörer såsom CK5 och p63 och luminala markörer såsom androgenreceptorer och CK88. Några andra experimentella proteiner av intresse kan också studeras med hjälp av dessa färgning tekniker.
Även om FFPE sektioner kan visualisering av celler som är bosatta i innerfack via histologisk metoderna (H & E, IF, IHC), bilder är begränsade till tvärsnitt och organoid form kan ändras av inbäddning process. Hela-mount färgning kan en organoid färgas och observerats i situ, bevara morfologiska fenotyper och tillåter bilder av protein lokalisering. Hela-montering är ett verktyg som används för att färga hela-vävnad eller hela djur prover, såsom zebrafisk eller mus embryot, och enkelt anpassas för organoids. Den teknik som beskrivs här ändrades från förfarandet av Mahéo.a. 11, som information om initial tillväxt och kultur av gastrointestinala organoids direkt på en kammare bild för färgning och kräver fixering av hela överordnad kultur. Den metod som beskrivs här innebär överföring av en enda organoid (eller organoids) av intresse i en kammare bild vid tidpunkten för färgning. Detta gör valet av enskilda organoids för hela-mount analys i ett pågående experiment utan fixering av överordnad kultur. När du utför hela-mount färgning, är det nödvändigt att optimera permeabilisering och inkubationstiden för primära och sekundära antikroppar att säkerställa penetration i hela preparatet (någonstans från en eller flera dagar rekommenderas). När avbildas via konfokalmikroskopi, kan 3D-renderingar produceras för att aktivera visualisering och lokalisering av ett specifikt protein och beräkna antalet positivt färgade celler i en provet. Flödescytometri är en användbar slutpunkt att kvantifiera populationer av basal, luminala eller stamceller5,14. Detta gör celler återhämtat sig från matrix gelen och försiktigt isär för färgning. Användare bör noga välja lämpliga markörer för separation utifrån den aktuella litteraturen. För humana primära prostata epitelceller är CD26 och CD49f passande luminala och basala markörer, respektive5,21.
Sammanfattningsvis Detaljer detta protokoll människans primära prostata organoid tillväxt, insamling och experimentella slutpunkter. Notera kan den montering teknik som beskrivs tillämpas på en mängd andra analyser som normalt är anställd för 2D celler, till exempel fluorescerande sond-baserade experiment tittar på spridningen19, apoptos och subcellulär organell fläckar. Dessutom kunde den insamling och dissociation metod som beskrivs här utnyttjas inför encelliga RNA-sekvensering18. Sammantaget visar detta möjligheten för en mängd roman, HiFi-slutpunkter som forskare kan optimera och utforska i framtiden.

Organoids är ett värdefullt verktyg att studera organogenes och sjukdom. De ger ett billigare alternativ till djurmodeller, och patientderiverade organoids utvecklas som en strategi för personlig medicin1,2,3. Detta tredimensionella (3D) kultur system innebär sådd stamceller eller stamceller celler (skördas från vävnad eller inducerade pluripotenta stamceller) i en gel av extracellulär matrix komponenter (matrix gel)4. Cellerna föröka sig och differentiera, vilket resulterar i organotypic strukturer som recapitulate cellulära hierarkin och morfologi av organ av intresses funktionell enhet. Organoids har odlats med celler som härrör från en mängd olika organ, inklusive Saliv-körtel, mage, tarm, lever, prostata, lung och hjärnan4. Det finns många protokoll som beskriver stegen för att etablera prostata organoids5,6, är det utmanande att hitta tillräckligt detaljerade metoder om hur man uppnår kvantitativa slutpunkter från organoids. Detta dokument sammanfattar metoder utvecklats för människans primära prostata celler och en rad föreslagna slutpunkter att bedöma de organoid fenotyperna. Dessa tekniker var optimerad för prostata organoids och kan tillämpas på andra 3D cellkulturer.
Prostata organoid kulturer har nyligen dykt upp som en värdefull i vitro -modell som saknar begränsningar i enskiktslager kulturer med etablerade cellinjer som förevigade. Godartad prostata epitel och prostatacancer är utmanande att modellen i vitro som använder förevigade cellinjer. Antalet godartade cellinjer är begränsad, och alla har genomgått omvandling med onkgener7. Primära prostata epitelceller i enskiktslager inte differentieras till luminala celler och saknar androgen receptorer8. Majoriteten av prostata cancer cellinjer har inte funktionella androgenreceptorer, en betydande medlare av tidiga sjukdomstillstånd och brist på viktiga genetiska förändringar som har hittats i patientens tumörer9. Prostata organoid kulturer kan odlas enkelt från godartade epitel och är värdefulla i studerar stamceller boenden, stamceller, differentiering och effekterna av experimentella förändringar i närmiljön4,5. Prostatacancer organoids kan odlas som en del av en precisionsinflygning medicin till modellering patientens sjukdom och svar till terapier10.
Detta protokoll har sammanställts utifrån befintliga protokoll som använder olika celltyper, men det här har optimerats för användning i människans primära prostata celler. Den komplimanger protokoll som beskrivs av Sawyers, Clevers och Shen5,6 som beskriver tillväxt, passaging, ljusa-området imaging, frysförvaring och RNA och DNA isolering av prostata mus och mänskliga organoids. Hela-mount protokollet ändras från Mahé o.a. 11, som används för gastrointestinala epitelceller organoids och beskriver levande imaging och frysta och paraffin inbäddning. Borten o.a. 12 beskrivs analysen av bröst-, kolon och kolorektal cancer organoid morfologi från ljusa-området imaging. Dessutom Richards et al. 13 används en metod för morphologic bedömning av prostata organoids. Slutligen, Hu et al. 14 beskrivs en metod för att följa prostata organoids till en kammare bild över natten före Immunofluorescerande färgningen för att observera enstaka celler och spridning av sfärer för flödescytometri Flödesanalys.
Målet med detta protokoll är att demonstrera i tillräcklig detalj dessa tekniskt krävande metoder som protokoll, inklusive cell sådd; Media och matrix gel underhåll; samling av celler för flödescytometri; RNA, DNA och protein utvinning; morphologic bedömning från ljusa fält z-stack analys; inbäddning, bearbetning och snittning för histologiska färgning; och hela-montering för immunofluorescens eller fluorescerande sonden analyser. Den biologiska relevansen och tolkningen av dessa olika slutpunkter varierar bland experimentell design och antikroppar som används för analys. Genom utnyttjande av detta protokoll, bör användare känna beredda att utforma ett experiment med en verktygslåda av slutpunkter.
Humana primära prostata (PrE) epitelceller fastställdes i labbet av protokollet beskrivs av Peehl15,16 och underhålls på ett begränsat antal passager (upp till fyra) som tidigare beskrivna17, men de är också tillgängliga från kommersiella leverantörer. Hepatocyte serumfritt mediebaserad6, KSFM-baserade13och R-spondin 1-villkorade5 media publiceras alla som har framgångsrikt producerat organoids. KSFM-baserade kräver minst antal tillsatser, så den beskrivs här.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för tredimensionella (3D) odling, hantering och utvärdering av människans primära prostata organoids. Processen omfattar sådd av epitelceller glest i en 3D matrix gel på en 96 brunnar mikroplattan med media ändringar att odla expansion i organoids. Morfologi bedöms sedan av hela-väl fånga av z-stack bilder. Komprimering av z-stackar skapar en enda i-fokus bild från vilka organoids mäts för att kvantifiera en mängd utgångar, inklusive loopkontroll, rundhet och område. DNA, RNA och protein kan hämtas från organoids återhämtat sig från matrix gelen. Cellpopulationer av intresse kan bedömas av organoid dissociation och flödescytometri. Formalin-fixering-paraffin-inbäddning (FFPE) följt av snittning används för histologisk bedömning och antikropp färgning. Hela-mount Immunofluorescerande färgning bevarar organoid morfologi och underlättar observation av protein lokalisering i organoids i situ. Kommersiella analyser som traditionellt används för 2D enskiktslager celler kan ändras för 3D organoids. Tekniker i detta protokoll används tillsammans, och ger en robust verktygslåda för att kvantifiera prostata organoid tillväxt, morphologic kännetecken och uttryck av differentiering markörer.

Vid framgångsrik kultur av mänskliga primära prostata organoids, kan morfologi och differentiering bedömas med ljusa fält bildanalys- och FFPE- och hela-mount färgning teknik.
Processen med ljusa fält Bildinsamling illustreras i figur 1A. Organoids odlas i en 3D matrix och spridda över olika focal plan. För att observera organoids i fokus på många plan, föreslås det för att använda bildens EUF (figur 1B, höger) istället för en enda z-plan (figur 1B, vänster). I labbet, kan organoids odlas under olika experimentella förhållanden resultera i förändringar i morfologi. Använda området, loopkontroll (definieras av hur lika organoid är att en cirkel) och max/min radie (längdmått) ger användare en indikation på organoid storlek och form och ger en kvantifierbar avläsning av morfologi. För att betona nyttan av dessa åtgärder, visas representativa bilder av organoids med liknande område men varierande morfologi i figur 1 c, där en lång organoid kommer att vara mindre rund och har en större största/minsta förhållande än en sfärisk Organoid.
Det är en användbar slutpunkt att iaktta inre av prover och se till att nekros inte är närvarande i kärnan av en organoid att bädda in organoids för histologi. Ett arbetsflöde för denna process och representativa resultat av de ofärgade, sektionerad proverna i ljusa fält Mikroskop tillhandahålls i figur 2AB, C. Figur 3A visar en misskött organoid (vänster) jämfört med korrekt räckte organoids i figur 3A (höger) och figur 3B. För att avgöra differentiering-tillstånd för provet, rekommenderas det att titta på basalcellscancer markörer (cytokeratin 5 och p63)8 tillsammans med luminala cell markörer (cytokeratin 8)8. Om det önskas att färga organoids i situ, hela-mount färgning är ett bekvämt alternativ, och dessa representativa resultat tillhandahålls i figur 3 cD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Figur 1: morfologi bedömning av organoids i 3D kultur. (A) bild insamling och komprimering arbetsflöde för människans primära prostata organoids förvärvat en genomlysning inverterade Mikroskop med en motoriserad X / Y scenen och följeslagare programvara för skanning. (B) representativa bilder av en enda z-stack (vänster) vs. en EDF bild (höger) av ett hela-bra urval av människans primära prostata organoids, visar att mer organoids är i fokus när flera z-stackar kombineras till en enda projicerade bilden (skalstapeln = 1000 µm). (C) representativa bilder för området, loopkontroll och max/min förhållande av morfologiskt olika människors primära prostata organoids som har samma område (skalstapeln = 200 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Figur 2: Organoid inbäddning arbetsflöde och representant snittning resultat. (A) människans primära prostata organoid inbäddning arbetsflöde. (B) representativ bild av en ofärgade, fräsch bild som innehåller mänskliga primära prostata organoids i ljusa fält Mikroskop föreställande agar (grön pil), histologi gel (svart pil), bubbla (blå pil), organoids (röda pilar) (skalstapeln = 1000 µ (m). (C) ofärgade nyklippt bilden (vänster) vs. ofärgade torr bild (höger), organoids (röda pilar) visas genomskinligt när det torkar (skalstapeln = 500 µm) och är svårare att urskilja i ljusa fält Mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Figur 3: histologiska färgning på sektionerad och hela monterade organoids. (A) H & E färgning av en trasig människa primära prostata organoid från misskötsel (aggressiv pipettering, fel behandling protokoll, vänster) bredvid en väl hanterat organoid (höger) (skalstapeln = 100 µm). (B) människans primära prostata organoid som varit formalin-fast, paraffin-inbäddat, sektioneras, och färgas med basala cytokeratin 5 eller luminala cytokeratin 8 (överst) eller basal p63 och luminala cytokeratin 8 (nederst) och avbildas med confocal Mikroskop ( skalstapeln = 100 µm). (C) en hela-monterad människans primära prostata organoid färgas med basala cytokeratin 5 eller luminala cytokeratin 8 och counterstained med phalloidin och DAPI, avbildas med confocal Mikroskop (skalstapeln = 100 µm). (D) en hela-monterad humana primära prostata cell organoid färgas med fluorescently märkt EdU och counter färgas med Hoescht, avbildas med confocal Mikroskop (skalstapeln = 500 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Här presenterar vi ett protokoll för att vägleda människans primära prostata organoid hantering då föreslå slutpunkter för att bedöma fenotyp. Sådd, kultur underhåll, återhämtning från matrix gel, beskrivs morphologic kvantifiering, inbäddning och snittning, FFPE snittning, hela-mount färgning och tillämpning av kommersiella analyser.

Hantering och bedömning av människans primära prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostataorganoider är ett spännande in vitro-system för att studera utveckling och sjukdom. De övervinna utmaningar förevigade cellinjer och erbjuder ett billigt alternativ till djurmodeller. De kan odlas från mänskliga prostataceller, som vi har visat i detta protokoll, liksom mus prostataceller, som en sjukdom-relevant prekliniska modellsystem.Många labb har beskrivit användbara odlingsmetoder och slutpunkter. Men vi hoppas kunna föra samman dessa detaljer i ett protokoll och visa särskilt utmanande steg för nya användare. När teknikerna förbättras, prostatacancer organoider kan odlas från patientprover som en precision medicin strategi för modell sjukdom och svar på terapier.Odlingsförhållandena är specifika för prostataorganoider, men många av ändpunkterna har anpassats från andra vävnadstyper. En användare kan anpassa delar av detta protokoll till sin celltyp av intresse. Starta detta experiment genom att odla epitelceller i matrixgelkodade 96-brunnsplåtar som beskrivs i manuskriptet.För att samla organoider från plattorna efter 12 dagar, ta bort medium från brunnarna utan att störa matrisgelen. Tillsätt sedan omedelbart cirka 200 mikroliter av neutralt proteas till varje brunn vid ungefär ett-till-två-förhållande mellan matrisgelen och neutralt proteas. Inkubera plattan i 20 minuter vid 37 grader Celsius.Sedan pipetter upp och ner för att mekaniskt separera blandningen, och inkubera igen i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubationen överför du den neutrala proteasmatrisen gel-cellblandning från några brunnar till ett mikrocentrifugrör. Pellet cellerna genom centrifugering vid 300 gånger g i tre till fem minuter.Ta bort supernatanten och spara organoidpelleten för efterföljande analyser. För att skapa formar för inbäddning, skär ut en liten del av en 1, 000-microliter pipett spets för att göra en cylinder som rymmer 50 mikroliter. Sedan från den bredare delen av samma spets, gör en andra bredare mögel som passar runt den första formen.För att skapa ett kallt block, linda en icepack med tejp med den självhäftande sidan uppåt. Sedan följa formar vinkelrätt mot bandet. För att bädda in organoiderna i en histologi gel plugg för bearbetning, först tvätta den tidigare erhållna organoid pellet med en milliliter av Hanks Balanserad Salt Solution.Efter centrifugering vid 300 gånger g i tre till fem minuter, ta bort supernatanten. Tillsätt sedan 30 till 50 mikroliter av flytande histologi gel till organoid pelleten, och blanda försiktigt genom att långsamt pipettering upp och ner till resuspend pelleten. Överför denna blandning i en form på kallblocket, och låt exemplaret svalna och stelna till en plugg.Därefter använder en kolv för att driva kontakten ur den lilla formen och in i mitten av den större mögel, och fylla den genom pipettering klart 2% agar runt kontakten. För att markera toppen av provet, pipettera histologic färgämne-tonade 2%agar ovanpå kontakten. När agaren har svalnat använder du en kolv för att överföra kontakten till en histologikassett.Märk kassetten med en penna och placera den i 10%neutral buffrad formalin för över natten fixering. På följande dag, överför kassetten från 10%neutral buffrad formalin till 70%histologisk grad etanol, och bearbeta den vidare och bädda in i paraffin. Börja med att trimma blockets bas vid en 10-mikrometers tjocklek.När ett avsnitt som innehåller kontaktområdet visas, slutar du putsa. Lås mikrotomrotorn och överför blocket tillbaka till isen för att kyla. Flytta bladet till en ny, oanvänd del.Och för över blocket tillbaka till klämman. Lås upp maskinen och börja putsa vid fem mikrometer per sektion. Använd pincett för att överföra sektionen till 40-graders Celsius vattenbad, och låt den sprida ut.Doppa en rutschkana vertikalt i vattnet för att överföra sektionen på den. Observera sedan bilden under ett ljust fältmikroskop för att säkerställa att en organoid finns i avsnittet. Grädda över natten vid 45 till 50 grader Celsius, och fortsätt sedan med färgning som beskrivs i manuskriptet.Starta denna del av experimentet med oanvända brunnar av 96-brunnsmatrisen gelbelagd platta med organoider. Genom pipettering mot sidan av brunnen, lämnar utrymme mellan media och matris gel, försiktigt bort så mycket media som möjligt utan att störa organoid kultur. Använd en trimmad 1, 000-mikroliter pipett spets, pre-våt med PBS att utarbeta en droppe matris gel som innehåller de organoider av intresse.Fördela droppen på mitten av en kammarrutschbana. Med blotta ögat, aspirera överskottet media och matris gel från kammaren glida med hjälp av en fin-tippade pipett. För att främja organoid följsamhet till glaset och förhindra förlust av prover under efterföljande tvättsteg.Placera bilden i en 37-graders-Celsius inkubator i 30 till 45 minuter. Pipettering långsamt för att förhindra lossnar från skålen, tillsätt 200 mikroliter av 1X PBS att tvätta organoiderna i fem minuter vid rumstemperatur med mild skakning. Ta försiktigt bort 1X PBS och tillsätt 200 mikroliter av 4%paraformaldehyd.Fixera i 30 minuter vid rumstemperatur med varsam skakning. Vid PFA, tvätta och fortsätta med efterföljande permeabilisering och färgning steg som beskrivs av detta protokoll. Montera och bild omedelbart.Obefläckade nyklippta bild visar tydligt mänskliga primära prostataorganoider, medan i obefläckade torra slide, organoider verkar genomskinliga och är svårare att upptäcka under ett ljust fältmikroskop. Hematoxylin och eosin färgning visar en bruten mänskliga primära prostata organoid från misskötsel, såsom aggressiva pipettering, fel bearbetning protokoll jämfört med en väl hanterad organoid. Mänskliga primära prostata organoid var formalin-fast, paraffin-inbäddade, avsnitts, och färgas med basala cytokeratin 5 och luminal cytokeratin 8, basala p63 och luminal cytokeratin 8 och avbildas med confocal mikroskop.En hela monterade mänskliga primära prostata organoid var färgas med basala cytokeratin 5 eller luminal cytokeratin 8, och counterstained med phalloidin och DAPI, och avbildas med confocal mikroskop. En hela monterade mänskliga primära prostata cell organoid var färgas med fluorescently-märkt Edu och counterstained med Hoescht, och avbildas med confocal mikroskop. Det är viktigt att visualisera dina organoider under hela proceduren.När du har samlat ihop avsnitten, se till att visualisera proverna på bilden och se till att du observerar organoider under helmontering. Efter att samla organoiderna från matrisen gel, kan du hel-montera dem och använda kommersiella analyser, eller separera till enstaka celler för flödescytometri eller encellig sekvensering. 3D-kultur ger forskare ett nytt sätt att studera vävnad i inställningen av en lab maträtt.Det kan appliceras på organogenes, eller för att förstå patologin hos en patients sjukdom. Vid arbete med patientprover, iaktta alltid försiktighet och hantera materialen som potential för blodburen patogenexponering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterande Cell Culture System för mänskliga Cell Culture: Mänskliga trofoblasten Celler som modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensanalys av upprepad exponering av Organotypiska 3D bronkial och Nasal Tissue Kultur Modeller till Whole cigarett rök

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Ett hormon känslig 3D Kultur av humana bröstkörteln epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiserad robot vätskehantering montering av modulära DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjärtelektrofysiologisk bedömning av dubbel spänning och kalciumoptisk kartläggning av mänskliga organotypiska hjärtskivor

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärt förtydligande av CHO skördad cellodlingsvätska med hjälp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En öppen källkodsteknikplattform för tillverkning av hydrogelbaserade 3D-kulturmodeller på ett automatiserat och standardiserat sätt

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetod för att upprätthålla quiescenta mänskliga hematopoetiska stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...