Name: handling and assessment of human primary prostate organoid culture
Uploaded: 2019-01-17T15:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Biz yanı sıra doku edinmesinin birincil hücre kültürleri kolaylaştırma için Drs. Michael Abern, Daniel Moreira ve Simone Crivallero, ürolog Dr. Klara Valyi-Nagy ve Alex Susma, UIC Biorespository üyelerini teşekkür ederim. Biz UIC Üroloji hastaların doku araştırma bağış için teşekkür ederim. Bu eser, kısmen, Bakanlığı Savunma prostat kanseri araştırma programı sağlık eşitsizliklerin fikir Ödülü PC121923 (Nonn) ve klinik UIC merkezi ve çeviri bilim Pre-doctoral eğitim için () klinik ve çevirim bilim adamları tarafından finanse edildi PECTS) programı (McCray ve Richards'ı) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nın Ulusal Kanser Enstitüsü, Grant numaraları U54CA202995, U54CA202997 ve U54CA203000 tarafından bilinen Chicago sağlık eşitlik işbirlikçi (Nonn ve Richards'ı). İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri ya da Savunma Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmiyor.

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+Modeling+Development+and+the+Stem+Cell+Niche+in+a+Dish.">Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+2.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).</li><li>Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+characteristics+of+transit+amplifying+epithelial+cells+from+human+prostate+tissue.">In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).</li><li>Sobel, R. E., Sadar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+used+in+prostate+cancer+research:+a+compendium+of+old+and+new+lines--part+1.">Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1.</a> The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).</li><li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg.">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).</li><li>Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stroma+increases+the+viability+and+maintains+the+branching+phenotype+of+human+prostate+organoids.">Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids.</a> iScience. , (2018).</li><li>Hu, W. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+stem+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+prostatic+epithelial+and+stromal+cells+in+vitro.">Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro.</a> Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Enteroid+Proliferation+Staining.">Whole-mount Enteroid Proliferation Staining.</a> Bio-Protocol. 6 (12), (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Organotypic kültür dokusu vitro ortamda kolaylığı ile recapitulating bir heyecan verici yeni yöntemdir. Şu anda, labs organoids çeşitli bitiş noktası için dokuların birçok türlerinden büyümek. Bu makalede açıklanan yöntemler yararlı bitiş noktaları özetlemek ve tam 3D birincil prostat hücre kültürleri karakterize etmek için yeni teknikler vurgulamak.
İnsan birincil prostat hücre organoids5,6,13yetiştirilmesi için medya tarifleri çeşitli vardır. Tüm geçerli ve benzer sonuçlar elde ederken, KSFM tabanlı medya13 açıklanan bu yüzden en az katkı maddeleri burada kullanır. Ayrıca, kağıtları matris jel, kültür prostat organoids5,6,13%75 %10 için birden fazla konsantrasyonları kullanarak yayınlanmıştır. Çünkü matris jel pahalı bir reaktif ve % 33 matris jel uzun vadeli (2-3 hafta), yetiştirmek için yeterli olmak gösterildiği uygun, unclumped organoids13, önerilen konsantrasyon bu. Ancak, matris jel protein konsantrasyonu lot numaraları, bu hesaba ne zaman kaplama alınması gereken bu yüzden arasında değişebilir. Ayrıca birçok tutarsızlık azaltmak için birden fazla deneyler arasında matris jel kullanım için toplu olarak satın almak için tavsiye edilir. Diğer labs bir 96-şey plaka iyi5kaplama yerine damlacıkları gibi matris jel kaplama için farklı biçimlerde yayımlanmıştır. Her iki yöntem uygun organoids formu ama burada açıklanan biçim hücreleri daha seyrek, kaplama daha büyük organoids13içine hücre genişleme tanıtmak için gösterilen sağlar. Ancak, yoğunluk kaplama hastaya özgü oluşumu verimliliği göre optimize edilmelidir. Matris jel büyüme faktörü düşük, fenol red-alerjik, yüksek konsantrasyon, vbdahil olmak üzere birçok biçimlerinde kullanılabilir. Büyüme faktörü indirgenmiş kültür koşulları tanımlanan ve fenol red ücretsiz GFP hızlı hücrelerle veya z-yığın görüntü yakalama ilgili deneylerde çalışırken önerilir tavsiye edilir. Matris jel hızla oda sıcaklığında katılaşır gibi herhangi bir matris jel kaplama adımları buz gibi kimyasalları ile yapılması önemlidir.
Parlak alan görüntüleme yaygın olarak gözlenen morfolojik fenotipleri incelemek için kullanılır böylece farklı deneysel tedaviler altında yetiştirilen Organoids şekle, değişiklikler neden olabilir. Bununla birlikte, kayıt ve alan veya şekil miktarının iki nedenden dolayı bir meydan okuma olduğunu: 1) seçim önyargı sırasında görüntü yakalama ve uygulama 2) iki boyutlu bir parametre alan gibi üç boyutlu bir örnek. Bir görüntü yakalama rastgele bir alan kayıt ve organoids bu alanda önceden belirlenmiş bir dizi ölçmek için bir stratejidir ama bu önyargı seçimi sırasında oluşturabilirsiniz ve seçili alandaki tüm organoids odakta olmayabilir. Bütün iyi görüntüleme 96-şey Mikroplaka biçimini en iyi duruma getirilmiş tüm organoid nüfus ilgi toplayarak bu örnekleme önyargı ortadan kaldırır. Ancak, el üstünde mikroskop hedefleri bağlı olarak, birden çok alanı toplanacak ve bir bütün-iyi görüntü elde etmek için döşeli gerekebilir. Bazı labs ölçüm alanı tek bir z-uçak12tarif var ancak odak tüm organoids yakalamak için toplamak ve birden çok düzlemin tek bir EDF-görüntü13yığını için önerilir. Bazı durumlarda, bir menisküs matris jel içinde görüntünün içinde vinyet neden olabilir ve arka plan düzeltme yöntemleri görüntü analiz yazılımı kullanmadan uygulanması gerekebilir. Tam ideal organoid boyutu için en uygun ölçüm birimidir; Ancak, bu bile birden çok z-yığın görüntü ile tam olarak elde etmek zordur. Döngüsellik ve maksimum/minimum oranı, gibi diğer yararlı morfolojik boyutları, Bütün iyi EDF yansıma dosyasındaki tüm organoids üzerinden kolayca hesaplanabilir. Birlikte, bu yöntemleri örnekleme önyargı zorlukları aşmak ve 3 boyutlu uzayda 3B nesneleri 2B parametrelerinin ölçüm etkinleştirin.
Formalin fiksasyon ve organoids parafin katıştırma olan Hematoksilen ve eozin (H & E), immunohistokimyasal (IHC) ve immünfloresan (Eğer) görselleştirme ve analiz6,11için, boyama almak için kullanılan genel yöntem 20. ancak, bu tekniği tarif var yayınları gömme işlemi hakkında kapsamlı bilgi eksikliği. Ayrıca, organoids parafin blok içinde bulmak zor olabilir. Bazı labs organoids trypan ile11kesit sırasında konumda yardım için gömme önce mavi önceden leke. Burada açıklanan yöntemi bir histolojik boya kullanımı için kesit verimliliği teşvik için gömme sırasında organoid/Histoloji gelplug yönünü içerir. H & E slaytlar nekroz, nükleer doku ve nükleer silahların yayılmasına karşı incelenmesi kolaylaştırmak ve böylece hücreleri küre sağlıklı olduğundan emin olmak organoid kültür için zorunlu bir bitiş noktası olmalıdır. Bir organoid kültür örnekleri daha iyi benzer vivo içinde hasta doku hücrelerinin heterojen karışımı oluşmaktadır gücüdür. Prostat, örneğin, hücrelerin bazal ve luminal prostat organoids5, 2D eksikliği luminal farklılaşma8' yetiştirilen hücreleri ise mevcut. Organoid farklılaşma değerlendirmek için araştırmacılar CK5 ve p63 gibi bazal işaretleri ve androjen reseptörleri ve CK88gibi luminal işaretleri değerlendirmek önerilir. Diğer deneysel proteinler ilgi de bu boyama teknikleri kullanarak okudu olabilir.
Her ne kadar FFPE bölümler görselleştirme iç bölme ile histolojik yöntemlerle (H & E, Eğer, IHC) ikamet eden hücrelerin olanak sağlar, görüntüleri bölümleri geçmeye sınırlıdır ve organoid şekil gömme işlemi tarafından değişmiş olabilir. Bütün Dağı boyama lekeli ve morfolojik fenotipleri koruyarak ve protein yerelleştirme görüntülerini izin in situ, gözlenen bir organoid sağlar. Bütün montaj bütün doku veya bütün hayvan numuneler, zebra balığı veya fare embriyo gibi leke için kullanılan bir araçtır ve kolayca organoids için uyarlanmıştır. Burada açıklanan tekniği yordam Mahévd tarafından güncellenmiştir Bu bilgi ilk büyüme ve boyama için doğrudan bir odası slaytta gastrointestinal organoids kültürünü ve tüm üst kültür fiksasyonu gerektirir 11. Burada özetlenen yöntem tek bir organoid (veya organoids) devri boyama sırasında odası slayt üzerine ilgi içerir. Bu üst kültür fiksasyonu olmadan devam eden bir deney bütün Dağı analiz bireysel organoids yelpazesi sağlar. Bütün Dağı boyama yaparken, permeabilization ve numune boyunca nüfuz sağlamak birincil ve ikincil antikorları için kuluçka süresi optimize etmek gereklidir (herhangi bir yerde bir veya daha fazla gün sonra önerilir). Bir kez üzerinden confocal mikroskobu görüntüsü, 3D render görselleştirme ve belirli bir protein yerelleştirmesini etkinleştirmek ve olumlu lekeli hücreleri bir örnek mevcut hesaplamak için üretilmektedir. Akış Sitometresi bazal, luminal nüfus ölçmek için yararlı bir bitiş noktası, ya da5,14kök hücreleri. Bunu yapmak için hücreleri matris jel kurtarıldı ve yavaşça boyama için ayrışmış. Kullanıcılar geçerli edebiyat göre ayrılması için uygun işaretleri dikkatle seçmeniz gerekir. İnsan birincil prostat epitel hücreleri için uygun luminal ve bazal işaretleri, sırasıyla5,21CD26 ve CD49f vardır.
Özet olarak, bu protokol insan birincil prostat organoid büyüme, koleksiyon ve deneysel bitiş noktaları ayrıntıları. Not, normalde floresan sonda tabanlı deneyler bakarak yayılması19, apoptozis ve hücre altı organel lekeleri gibi 2D hücreler için istihdam edilen diğer deneyleri çeşitli açıklanan montaj tekniği uygulanır. Ayrıca, burada açıklanan koleksiyonu ve ayrılma yöntemi tek hücreli RNA sıralama18için hazırlık yararlanılabilir. Toplu olarak, bu roman, araştırmacılar optimize etmek ve gelecekte keşfetmek yüksek sadakat bitiş noktaları çeşitli olasılığını gösterir.

Organoids çalışma organogenesis ve hastalık için değerli bir araç vardır. Onlar hayvan modelleri için daha ucuz bir alternatif sağlamak ve hasta kaynaklı organoids Kişiselleştirilmiş tıp1,2,3için bir strateji olarak gelişmektedir. Bu üç boyutlu (3D) kültür sistem (dokudan hasat veya pluripotent kök hücreler indüklenen) kök veya progenitör hücre tohum hücre dışı matriks bileşenleri (matris jel)4bir jel karıştırmak. Hücreler çoğalırlar ve ayırt etmek, hücresel hiyerarşi ve morfoloji faiz'ın işlevsel birim organ özetlemek organotypic yapılarda kaynaklanan. Organoids organlar, tükürük bezi, mide, bağırsak, karaciğer, prostat, akciğer ve beyin4de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklanan hücreleri kullanarak büyüdü. Prostat organoids5,6kurmak için adımları açıklayan çok sayıda iletişim kuralları olmakla birlikte, organoids üzerinden nicel bitiş noktaları elde etmek yeterince ayrıntılı yöntemleri bulmak zordur. Bu kağıt insan birincil Prostat hücreleri için geliştirilmiş yöntemleri özetler ve organoid fenotipleri değerlendirmek için önerilen bitiş noktaları bir dizi detayları. Bu teknikler prostat organoids için optimize ve diğer 3D hücre kültürleri için olabilir.
Değerli vitro manken sınırlamalar kullanarak monolayer kültürlerin yoksun ölümsüzleştirdi hücre hatları belirlenen prostat organoid kültürler son zamanlarda ortaya çıkmıştır. İyi huylu prostat epiteli ve prostat kanseri ölümsüzleştirdi hücre hatları kullanarak modeli vitro için zor. İyi huylu hücre satır sayısı sınırlıdır ve tüm oncogenes7ile dönüşüm geçirmiş. Monolayers birincil prostat epitel hücrelerinde luminal hücrelere ayırt etmek ve androjen reseptörleri8eksikliği. Prostat kanseri hücre hatları çoğunluğu fonksiyonel androjen reseptörleri, erken hastalık durumu ve hasta tümörleri9' bulduğu eksikliği anahtar genetik değişiklikler önemli bir aracı yok. Prostat organoid kültür kolayca iyi huylu epitel yetiştirilir ve kök hücre özellikleri, progenitör hücreler, farklılaşma ve microenvironment4,5deneysel değişikliklerin etkisini eğitimi değerlidir. Prostat kanseri organoids hassas tıp yaklaşımının bir parçası hasta hastalık ve tedaviler10yanıt modelleme için yetiştirilen olabilir.
Bu iletişim kuralını kullanan çeşitli hücre tiplerinin varolan iletişim kurallarından derlenmiş, ama burada insan birincil Prostat hücreleri kullanmak için optimize edilmiştir. Sawyers, Clevers, Shen tarafından belirlenen ve protokolleri övgü büyüme, passaging, parlak alan görüntüleme, dondurma ve prostat fare ve insan organoids RNA ve DNA izolasyonu tarif5,6 . Bütün Dağı Protokolü Mahé vd değiştirilir Kim açıklar ve gastrointestinal epitel organoids kullanılan 11, canlı görüntüleme ve donmuş ve katıştırma alkol. Borten vd. 12 meme, kolon ve kolorektal kanser organoid morfoloji parlak alan görüntüleme üzerinden analiz nitelendirdi. Ayrıca, Richards ve ark. 13 prostat organoids morfolojik değerlendirilmesi için kullanılan bir yöntem. Son olarak, Hu vd. 14 yapışan prostat organoids odası slayda immünfloresan tek hücreleri ve küreler Akış Sitometresi Analizi için dispersiyon gözlemlemek için boyama önce gecede bir yöntemi açıklanmıştır.
Bu iletişim kuralı, yeterince ayrıntılı bir biçimde bu teknik olarak zor yöntemleri hücre tohum da dahil olmak üzere, bir iletişim kuralı olarak göstermek için hedeftir; Medya ve matris bakım Jeli; Akış Sitometresi için hücreler topluluğu; RNA, DNA ve protein ayıklama; morfolojik değerlendirmesi alan parlak z-yığın çözümlemesi; Gömme, işleme ve histolojik boyama için kesit; ve bütün-montaj ayirt veya floresan sonda deneyleri için. Biyolojik alaka ve bu çeşitli bitiş noktaları yorumlanması deneysel tasarım ve analiz için antikorlar arasında değişir. Bu iletişim kuralı kullanımı, kullanıcılar bir deney bitiş noktaları toolkit ile kurmak hazır hissetmeniz gerekir.
İnsan birincil prostat epitel (PrE) hücreler laboratuarda Peehl15,16 tarafından açıklanan ve sınırlı sayıda pasajlar (en çok dört) yukarıda açıklanan17olarak tutulan protokolü tarafından kuruldu, ama onlar da ticari satıcılardan temin edilir. Hepatosit serum-özgür medya tabanlı6,13KSFM tabanlı ve R-spondin5 1 şartına medya tüm başarılı organoids üretilen olarak yayımlanır. Burada anlatılan KSFM tabanlı katkı maddeleri, en az sayıda gerektirir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-Dihydrotestosterone (DHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (matrix gel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Various</td>
			<td>Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-130, 339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (neutral protease)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>neutral protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>suggested RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>suggested protein extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10503027</td>
			<td>suggested DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope with camera capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. &#8206;EVOS FL Auto Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ex. Graphpad, Excel, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel (histology-gel)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Plunger&#34; from 1 cc insulin syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Casette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1202D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Container to hold fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin (NBF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology pen, xylene and EtOH-resistant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z648191-12EA</td>
			<td>STATMARK pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For fixation and graded dilutions during processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tissue Float Bath</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF4575E XH-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>27243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158B91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>Suggested H&#38;E staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Peroxidase Standard Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32020</td>
			<td>Suggested immunohistochemistry staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen Receptor Primary Antibody (AR)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5153S</td>
			<td>Suggested primary antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (histologic grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>dilutions should be performed using deinoized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Abcam</td>
			<td>C9999, ab93684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M905-12DGY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>IHC World</td>
			<td>M900-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219D68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1414-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S36972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td>optional adherent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehye (PFA)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>22023</td>
			<td>other fixatives such as methanol or formalin can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mM NH4Cl</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>254134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 (non-ionic detergent)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (DAPI, Hoescht)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterstain (phalloidin)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>suggested for storage but not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8)</td>
			<td>ARP American Research Products</td>
			<td>03-GP11</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-alpha antibody (p63)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4892S</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905501</td>
			<td>suggested primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21245</td>
			<td>suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-guinea pig secondary</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td>suggested secondary antibody for CK8 detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visikol HISTO-M</td>
			<td>Visikol</td>
			<td>various</td>
			<td>optional clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#956;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154534PK</td>
			<td>It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline - PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell assay of interest</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell dissociation enzymes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39;&#160;balanced salt solution&#160;(HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 5 Antibody - FITC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FCMAB291F</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab210139</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f - Alexafluor 647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313609</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26 - PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>320576</td>
			<td>Suggested flow antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and assessment of human primary prostate organoid culture

Bu kağıt üç boyutlu (3D) kültür, işleme ve insan birincil prostat organoids değerlendirilmesi için detaylı bir protokolünü açıklar. Epitel hücrelerinin seyrek bir 3D matris jel bir 96-şey Mikroplaka medya değişikliklerle organoids doğru genişleme yetiştirmek için tarihinde tohumlama işlemi içerir. Morfoloji sonra bütün iyi z-yığın görüntüleri yakalama tarafından değerlendirilir. Z-yığın sıkıştırma organoids çıkış Döngüsellik, yuvarlaklık ve alanı da dahil olmak üzere, çeşitli ölçmek için ölçülü tek bir odakta görüntü oluşturur. DNA, RNA ve protein organoids matris jel yeniden elde etmek--dan toplanabilir. Hücre popülasyonlarının ilgi organoid ayrışma tarafından değerlendirilmek ve akış sitometresi. Formalin fiksasyon-parafin-kesit tarafından takip gömme (FFPE) histolojik değerlendirme ve antikor boyama için kullanılır. Bütün Dağı immünfloresan boyama organoid morfoloji korur ve protein yerelleştirme organoids in situolarak gözlenmesi kolaylaştırır. Geleneksel 2D monolayer hücreleri için kullanılan ticari deneyleri için 3D organoids değiştirilebilir. Birlikte kullanıldığında, bu iletişim kuralını teknikleri prostat organoid büyüme, morfolojik özellikleri ve ayırt etme belirteçleri ifade ölçmek için güçlü bir araç sağlar.

İnsan birincil prostat organoids başarılı kültürü, Morfoloji ve farklılaşma alan parlak görüntü analizi ve FFPE ve bütün Dağı boyama teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir.
Şekil 1A' alan parlak görüntü yakalama işlemi gösterilmektedir. Organoids 3D dizey içinde büyüdü ve farklı odak uçaklar arasında dağınık. Organoids odak birçok uçak gözlemlemek için EDF görüntüyü (Şekil 1B, sağ) tek bir z-uçağı yerine (1B rakam, sol) kullanmak için önerilmektedir. Laboratuarda, farklı deneysel koşullar altında yetiştirilen organoids morfoloji değişiklikler neden olabilir. Alan, (ne kadar benzer organoid bir daireye tarafından tanımlanır) Döngüsellik ve max/min yarıçap (uzunluk ölçüsü) kullanılması kullanıcılar organoid boyut ve şekilde bir göstergesidir ve morfoloji ölçülebilir bir okuma sağlar. Bu önlemlerin kullanışlılığı vurgulamak için organoids ile benzer alan ama farklı morfoloji temsilcisi görüntüleri hangi uzun bir organoid daha az dairesel ve daha büyük bir maksimum/minimum oranı daha küresel bir Şekil 1 c, gösterilir organoid.
Organoids Histoloji için gömme örnekleri iç gözlemlemek ve bu nekroz bir organoid çekirdek içinde mevcut değil emin olmak için yararlı bir bitiş noktası olur. Bir iş akışı için bu işlem ve alan parlak mikroskop altında günahı, kesitli örneklerinin temsilcisi sonuçları Şekil 2AB, Ctemin edilmektedir. Şekil 3A düzgün göre (solda) mishandled bir organoid organoids Şekil 3A (sağda) ve Şekil 3Bteslim gösterir. Örnek ayırt etme durumunu belirlemek için bazal hücre işaretleri (cytokeratin 5 ve p63)8 luminal hücre işaretleri (cytokeratin 8)8ile birlikte bakmak için önerilir. Organoids leke istenirse in situ, Bütün-mount boyama uygun bir alternatiftir ve temsilcisi bu sonuçları Şekil 3 cö. sağlanır
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2.jpg"> Şekil 1: organoids 3D kültür morfoloji değerlendirme. (A) resim koleksiyonu ve sıkıştırma iş akışı insan birincil prostat organoids tarafından iletilen bir ışık elde için ters bir motorlu mikroskopla X / Y sahne ve arkadaşı yazılım tarama. (B) temsilcisi görüntüleri tek z-stack (sol) vs. EDF görüntüsünü (sağda) birden çok z yığınlarının tek bir görüntü birleştirildiğinde daha fazla organoids odakta olduğunuzu gösteren insan birincil prostat organoids bütün iyi örneği (ölçek çubuğu = 1000 µm). (C) temsilcisi görüntüler için aynı bölgede olan morfolojik birbirine benzemeyen insan birincil prostat organoids alanı, Döngüsellik ve max/min oranını (ölçek çubuğu 200 µm =). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig2.jpg"> Şekil 2: iş akışı ve sonuçları kesit temsilcisi katılmasını Organoid. (A) insan birincil prostat organoid iş akışı katıştırma. (B) temsilcisi agar (yeşil ok), Histoloji jel (siyah ok), kabarcık (mavi ok), organoids (kırmızı oklar) gösteren bir parlak alan mikroskop altında insan birincil prostat organoids içeren bir günahı, taze slayt görüntüsünü (ölçek çubuğu = 1000 µ m). (C) taze kesilmiş slayt (solda) vsgünahı. günahı kuru slayt (sağda), organoids (kırmızı oklar) saydam ne zaman kuru görünür (ölçek çubuğu = 500 µm) ve alan parlak mikroskop altında ayırt etmek zordur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59051/59051fig3.jpg"> Şekil 3: histolojik kesitli ve bütün monte organoids üzerinde boyama. (A) (agresif pipetting, yanlış işlem protokolü, sol) (sağ) iyi işlenmiş bir organoid yanında ilgilenmedikleri üzerinden bir kırık insan birincil prostat organoid, H & E boyama (ölçek çubuğu = 100 µm). (B) formalin sabit, parafin-gömülü, olmuştur insan birincil prostat organoid kesitli ve bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin ile 8 (üst) veya bazal p63 ve luminal cytokeratin 8 (alt) lekeli ve yansıma confocal mikroskop () ile ölçek çubuğu = 100 µm). (C) bir bütün monte edilmiş insan birincil prostat organoid bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin 8 ile lekeli ve phalloidin ve confocal mikroskopla görüntüsü DAPI, counterstained (ölçek çubuğu = 100 µm). (D) ile fluorescently lekeli bir insan birincil prostat hücre bütün monte organoid EdU etiketli ve karşı Hoescht, confocal mikroskopla görüntüsü ile lekeli (ölçek çubuğu 500 µm =) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59051/59051fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture at JoVE.com

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Burada, insan birincil prostat organoid kullanım kılavuzu sonra fenotip değerlendirmek için bitiş noktaları önermek için bir protokol mevcut. Tohum, kültür bakım, matris jel, kurtarma morfolojik miktar, katıştırma ve kesit, FFPE kesit, Bütün Dağı boyama ve ticari deneyleri uygulanması anlatılmaktadır.

Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Prostat organoidleri geliştirme ve hastalık eğitimi için heyecan verici bir in vitro sistemdir. Onlar ölümsüzleştirilmiş hücre hatları zorlukları aşmak ve hayvan modelleri için ucuz bir alternatif sunuyoruz. Bu protokolde de gösterdiğimiz gibi insan prostat hücrelerinden ve fare prostat hücrelerinden hastalıkla ilgili bir pre-klinik model sistemi olarak yetiştirilebilirler.Birçok laboratuvar yararlı kültür yöntemleri ve uç noktaları açıklanmıştır. Ancak bu ayrıntıları tek bir protokolde bir araya getirmeyi ve yeni kullanıcılar için özellikle zorlu adımları göstermeyi umuyoruz. Teknikler geliştikçe, prostat kanseri organoidleri model hastalık ve tedavilere yanıt hassas bir ilaç yaklaşımı olarak hasta örneklerinden yetiştirilebilir.Kültür koşulları prostat organoidlerine özgüdür, ancak uç noktaların çoğu diğer doku tiplerinden uyarlanmıştır. Bir kullanıcı bu protokolün bazı bölümlerini hücre ilgi türüne uyarlayabilir. Bu deneyi, el yazmasında açıklandığı gibi matris jel kodlu 96 kuyulu plakalarda epitel hücrelerini büyüterek başlatın.12 gün sonra plakalardan organoidleri toplamak için, matris jeli bozmadan kuyulardan orta yıkın. Sonra hemen nötr proteaz matris jel yaklaşık bir-iki oranı her kuyuya nötr proteaz yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra pipet yukarı ve aşağı mekanik karışımı ayrıştırmak için, ve 37 santigrat derece 20 dakika tekrar kuluçka. Kuluçkadan sonra nötr proteaz matris jel hücre karışımını birkaç kuyudan mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 300 kez g 3-5 dakika santrifüj ile hücreleri pelet.Supernatant çıkarın ve sonraki analizler için organoid pelet kaydedin. Gömme için kalıp oluşturmak için, 50 mikrolitre tutan bir silindir yapmak için 1.000 mikrolitrelik pipet ucu küçük bir bölümünü kesip. Sonra aynı ucun geniş kısmından, ilk kalıp etrafında uygun ikinci bir geniş kalıp yapmak.Soğuk bir blok oluşturmak için, yapışkan tarafı yukarı bant ile bir buz paketi sarın. Daha sonra kalıpları banta dik olarak yapıştırın. İşleme için bir histoloji jel fiş organoidler gömmek için, ilk Hank's Balanced Salt Solution bir mililitre ile önceden elde edilen organoid pelet yıkayın.3-5 dakika 300 kez g santrifüj sonra, supernatant çıkarın. Sonra organoid pelet sıvı histoloji jel 30 ila 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pelet resuspend için pipetting tarafından yavaşça karıştırın. Bu karışımı soğuk bloktaki bir kalıba aktarın ve numunenin soğumasını ve bir fişe katılaşmasını bekleyin.Daha sonra, küçük kalıp fişi dışarı itmek ve büyük kalıp merkezine bir piston kullanın ve fiş etrafında net% 2 agar pipetleme tarafından doldurun. Örneğin üst işaretlemek için, pipet histolojik boya renkli% 2 agar fişin üstüne. Agar soğuduktan sonra, fişi histoloji kasetine aktarmak için bir piston kullanın.Kaseti bir kalemle etiketleyin ve gece fiksasyonu için %10 nötr tamponlu formalin içine yerleştirin. Ertesi gün, kaseti %10 nötr tamponlu formalinden %70 histolojik sınıf etanobuna aktarın ve daha fazla işleyip parafine gömün. Bloğun tabanını 10 mikrometre kalınlığında kırparak başlayın.Fiş alanını içeren bir bölüm göründükten sonra, kesmeyi durdurun. Mikrotom rotoru kilitleyin ve soğuması için bloğu buza geri aktarın. Bıçağı yeni, kullanılmayan bir bölüme taşıyın.Ve bloğu kelepçeye geri aktarın. Makinenin kilidini açın ve bölüm başına beş mikrometre de kırpma başlar. Bölümü 40 derecelik su banyosuna aktarmak ve yayılmasını sağlamak için cımbız kullanın.Bölümü üzerine aktarmak için bir kaydırağı suya dikey olarak batırın. Daha sonra bir organoid bölümünde mevcut olduğundan emin olmak için parlak bir alan mikroskop altında slayt gözlemleyin. 45 ila 50 santigrat derece gece pişirin ve sonra el yazması açıklandığı gibi boyama ile devam edin.Organoidler ile 96-iyi matris jel kaplı plaka kullanılmayan kuyular ile deneyin bu bölümü başlatın. Kuyunun yan tarafına doğru boru lar atarak, ortam ve matris jeli arasında boşluk bırakarak, organoid kültürü bozmadan mümkün olduğunca çok ortamı dikkatlice çıkarın. Bir kesilmiş 1, 000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın, pbs ile önceden ıslak ilgi organoidler içeren matris jel bir damla çizmek için.Damlayı bir oda kaydırağının ortasına dağıtın. Çıplak gözle, ince uçlu pipet kullanarak oda slayt fazla ortam ve matris jel aspire. Organoid incamayı cama karşı teşvik etmek ve sonraki yıkama adımlarını takiben numune kaybını önlemek.Slaytı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 30-45 dakika yerleştirin. Çanak kopma önlemek için yavaş yavaş pipetleme, nazik sallayarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca organoidler yıkamak için 1X PBS 200 mikrolitre ekleyin. Dikkatle 1X PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ekleyin.Hafif sallayarak oda sıcaklığında 30 dakika düzeltin. PfA'da, bu protokolde açıklandığı gibi sonraki permeabilizasyon ve boyama adımlarını yıkayın ve devam edin. Montaj ve görüntü hemen.Lekesiz taze kesilmiş slayt açıkça insan birincil prostat organoidleri gösterir, lekesiz kuru slayt ise, organoidler yarı saydam görünür ve parlak bir alan mikroskop altında tespit etmek zordur. Hematoksilin ve eozin boyama, iyi işlenmiş bir organoide kıyasla agresif pipetleme, yanlış işleme protokolü gibi yanlış işlemeden kırılmış bir insan primer prostat organoidini gösterir. İnsan primer prostat organoidi formalin-sabit, parafin gömülü, kesitli, ve bazal sitokeratin 5 ve luminal sitokeratin 8, bazal p63 ve luminal sitokeratin 8 ile boyanmış ve konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir.Bir bütün monte insan birincil prostat organoid bazal sitokeratin ile boyandı 5 veya luminal sitokeratin 8, ve phalloidin ve DAPI ile karşılekeli, ve konfokal mikroskop ile görüntülendi. Bir bütün monte insan birincil prostat hücreli organoid floresan etiketli Edu ile boyanmış ve Hoescht ile counterstained, ve konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir. İşlem boyunca organoidlerinizi görselleştirmeniz önemlidir.Bölümleri topladıktan sonra, slayttaki örnekleri görselleştirdiğinden emin olun ve tüm montaj sırasında organoidleri gözlemledikten emin olun. Matris jel organoidler topladıktan sonra, onları tam monte ve ticari tahliller kullanabilirsiniz, ya da akış sitometri veya tek hücreli sıralama için tek hücrelere ayrıştırmak. 3D kültür bir laboratuvar çanak ayarında doku çalışma için yeni bir yol ile araştırmacılar sağlar.Organogeneze veya hastanın hastalığının patolojisini anlamak için uygulanabilir. Hasta örnekleri ile çalışırken, her zaman dikkatli olun ve kan yoluyla bulaşan patojen maruzkalma potansiyeli olarak malzemeleri ele.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Tüm Sigara Dumanına Organotipik 3D Bronşiyal ve Burun Doku Kültürü Modelleri Tekrarlanan Pozlama Etki Değerlendirmesi

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...