Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

نود أن نشكر كل مختبر روس وأعضاء مختبر مورفي. هذا العمل معتمد من قبل "جمعية القلب الأمريكية" (14SDG17790005) للمعاهد الوطنية للصحة أ (HL115933، HL127806) وخامساً الجدارة (BX003260) إلى R.S.R.

للعمل مع الفئران حديثي الولادة، يرجى يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المحلية جامعة ومعهد الوارد ببرامج رعاية الحيوان والتمسك بأحد مؤسسية وأخرى الأنظمة المناسبة. وافق عليها "جامعة كاليفورنيا سان دييغو رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوك?...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

في هذه الدراسة، وقد أنشأنا بروتوكول بسيط لعزل واستزراع الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة. باستخدام هذه كارديوميوسيتيس، نحن أيضا الأمثل الظروف لقياس معدل استهلاك الأكسجين باستخدام نظام محلل الجريان خارج الخلية. البروتوكول يسمح لأحد استخدام الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة كنظام نموذجي ل...

للحفاظ على وظيفة الهوس القلب مستمر، كارديوميوسيتيس يجب الحفاظ على إمدادات ثابتة من الطاقة الخلوية أساسا في شكل ATP1. في القلب، وتولد حوالي 95% ATP الميتوكوندريا، أساسا من خلال الفسفرة، تبين أن الميتوكوندريا دوراً حاسما الطاقة البيولوجية في وظيفة القلب2،3. دعم هذا المفهوم أن التقلبات وظيفة المتقدرية يمكن أن يؤدي إلى اعتلال عضلة القلب وفشل القلب4،5. على العكس من ذلك، ثبت استعادة الوظيفة المتقدرية لتحسين وظيفة القلب للفشل القلب6،7. ولذلك، دراسة إليه الاستقلاب mitochondrial وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية في cardiomyocytes لن تكشف فقط عن رؤى الميكانيكية لإنتاج الطاقة القلب ولكن يمكن أن توفر أيضا فكرة أن تؤدي لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب6،8.
مقارنة بقلب كله، الذي يحتوي على خليط من ميوسيتيس وغير ميوسيتيس9، كارديوميوسيتي الثقافات الغاية الصرفة، مع الحد الأدنى من التلوث من غير ميوسيتيس من القلب، مثل الخلايا الليفية، وخلايا بطانية10. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل كارديوميوسيتيس من المواليد الجراء يمكن استزراع عدد كبير من الخلايا في كمية صغيرة من الوقت، مقارنة بعزل الخلايا من قلوب الكبار10،11. الأهم من ذلك، cardiomyocytes الماوس الكبار مثقف الأساسي البقاء قصيرة الأوقات (مثلاً 24 ساعة) وفي وقت أطول النقاط دي تفرق. كارديوميوسيتيس الماوس حديثي الولادة يمكن البقاء على قيد الحياة والتلاعب بها لما يزيد عن 7 أيام في الثقافة، ويجعلها مثالية لاختبار آثار مركبات العقاقير والتلاعب بالجينات في الوظيفة الميتوكوندريا في cardiomyocytes10. وبطبيعة الحال، هناك اختلافات بيولوجية كبيرة بين خلايا البالغين والأطفال حديثي الولادة، ولكن مدة أطول متاح لثقافة خلايا الولدان يجعلها ملائمة لأنواع مختلفة من الدراسات، بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا.
وحتى الآن، استخدمت الأولية كارديوميوسيتيس الماوس وفار الولدان مثقف كنماذج لدراسة الاستقلاب القلب12،13. في السنوات الأخيرة، استخدمت الدراسات محلل تدفق خارج الخلية لقياس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) وتقييم قدرة الأكسدة في الماوس وفار كارديوميوسيتيس حديثي الولادة14،15. بينما بالمقارنة مع الفئران، بقاء الخلية الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة أقل وزيادة تقلب16. القدرة على دراسة الخلايا من نماذج الماوس المهندسة وراثيا أيضا، يجعل نموذج الخلية الماوس هام جداً. نظراً لأن الدراسات التعرف الضوئي على الحروف حساسة جداً للخلية عدد وكثافة البذر، ثمة حاجة إلى تطوير بروتوكول استنساخه وموثوق بها، وبسيطة لتحقيق العائد خلية يتمشى وقدرتها على البقاء.
هنا، نحن تقرير بروتوكولا أمثل الذي تم تطويره الذي يستخدم الماوس مثقف cardiomyocytes الولدان جنبا إلى جنب مع محلل 96-جيدا-تنسيق الخلية التمويه تحليل التعرف الضوئي على الحروف. هذا البروتوكول يزيد كثيرا من إمكانية تكرار نتائج للمقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكول يقدم الرواية والأسلوب استنساخه لتحليل التعرف الضوئي على الحروف، بل أيضا يمكن أن تتكيف مع ثقافة حجم أكبر لأغراض تجريبية أخرى، مثل تلك التي قد تكون بحاجة إلى دراسة وظائف ميوفيبريلار وداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات.
على وجه الخصوص، وصف هذا البروتوكول إجراء يوم واحد للعزلة وثقافة cardiomyocytes الولدان الماوس في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا. وباﻹضافة إلى ذلك، فهو يصف الإجراء لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام محلل الجريان خارج الخلية. جميع الحلول المستخدمة عقيمة أو تصفيتها العقيمة. يتم تعقيم جميع الأدوات من الإيثانول 75%. نحن نقدم الجدول للمواد لأجزاء مختلفة من الإجراءات. لاستزراع cardiomyocytes، يتم تنفيذ جميع الإجراءات والخطوات في غطاء ثقافة خلية قياسية. تم تطوير هذا البروتوكول لعزل قلوب الماوس الولدان من القمامة واحد (حوالي 8-10 الجراء). بيد البروتوكول يمكن تكييفها لعزل كارديوميوسيتيس من ليتر متعددة أيضا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

الميتوكوندريا والايض الأكسدة حاسمة للحفاظ على وظيفة عضلة القلب. وقد أظهرت الأبحاث أن خلل mitochondrial عاملاً هاما في مساهمة لضعف وظيفة القلب في القلب. على النقيض من ذلك، استعادة الوظيفة المتقدرية المعيبة قد آثار مفيدة لتحسين وظيفة القلب في قلب الفشل. ولذلك، يمكن أن توفر دراسة الآليات التنظيمية وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية البصيرة التي يمكن استخدامها لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب. هنا، يتم تحليل التنفس المتقدرية ميوسيتي القلب باستخدام نظام ثقافة خلية فريدة من نوعها. أولاً، تم وضع بروتوكول الأمثل لسرعة عزل والثقافة العالية الجدوى الماوس الولدان كارديوميوسيتيس. ثم يتم استخدام محلل الجريان خارج الخلية تنسيق 96-جيدا لتقييم معدل استهلاك الأكسجين من هذه كارديوميوسيتيس. لهذا البروتوكول، نحن الأمثل البذر الظروف وأثبت يمكن تقييم أن معدل استهلاك الأكسجين cardiomyocytes الماوس الأطفال حديثي الولادة بسهولة في محلل الجريان خارج الخلية. وأخيراً، نلاحظ أن لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على حجم أكبر لثقافة والدراسات الأخرى، مثل الإشارات داخل الخلايا وتقلص وظيفة التحليل.

باستخدام بروتوكول وصف، قلوب كانت معزولة من الجراء الولدان اليوم 0. وتم الحصول على 5 × 105 خلايا/ألجرو، وكانت تبذر cardiomyocytes كثافات من 10 × 103، 20 × 103أو 30 × 103 خلايا/حسنا، في لوحات جيدا 96 (الشكل 2A). بعد الثقافة بين عشية وضحاها، وعثر على كارديو?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

تحليل معدل استهلاك الأكسجين في Cardiomyocytes الولدان الماوس مثقف الأساسي محلل تدفق خارج الخلية باستخدام

والهدف من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية استخدام الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة كنظام نموذجي لفحص عوامل مختلفة كيف يمكن أن يغير استهلاك الأكسجين في القلب.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

هذا البروتوكول يسمح لنا لعزل وثقافة عالية ثنائي BBT، والمعروف فقط إلى القلب الماوس. لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، يمكن تحليل معدل استهلاك الأكسجين من عضلة القلب من قبل محلل تدفق الفضة الفعلية. واحدة من مزايا هذه التقنية هو أن استهلاك الأكسجين من cardiomyocytes يمكن قياسها بسهولة في الدولة التي تضمها في شكل 96-جيدا، مما يتيح اختبار ظروف متعددة مع عدد كبير من النسخ المتماثلة.يوفر هذا الوعاء رؤى مهمة في مجال البحث في أمراض القلب. بالإضافة إلى استهلاك الأكسجين، يمكننا أيضا دراسة المعلمات الأيضية الأخرى، مثل الزجرية و الايبوكسيد peracid. تحقيق تباين عالية من cardiomyocytes أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة.وهذا يتطلب هضم فعال للقلوب. منذ نيو ناو الولادة cardiomyocytes هشة جدا، التعامل لطيف من cardiomyocytes مهم أيضا. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، aliquot 5ml من HBSS إلى كل بئر من لوحة ثقافة خلية 6-جيدا ووضعها على الجليد.وبالإضافة إلى ذلك، aliquot 10ml من HBSS إلى طبق ثقافة الخلية 10cm، ثم، وإعداد 20 مل من محلول Predigestion تريبسين في أنبوب مخروطي معقم 50ml. الحفاظ على جميع الحلول على الجليد. بعد ذلك، استخراج القلب ونقله على الفور إلى طبق ثقافة الخلية العقيمة التي تحتوي على HBSS.إزالة أي أنسجة الرئة المتبقية والأوعية الكبيرة. اغسل القلب في HBSS باستخدام الانفعالات اللطيفة. في وقت لاحق، وقطع القلب مع مقص غرامة إلى 8 قطع ونقل أنسجة القلب مع ملقط في بئر واحد من 6-جيدا خلية لوحة ثقافة مع HBSS.باستخدام ملعقة موريا، وغسل أنسجة القلب عن طريق نقله من جيد إلى جيد في لوحة 6-جيدا مليئة HBSS. ثم نقل أنسجة القلب إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 20ml من تريبسين واحتضان مع التحريض لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. في هذا الإجراء، قبل الدفء الحل الهضم collagenase في حمام مائي في 37 درجة مئوية.نقل أنبوب مخروطي يحتوي على أنسجة القلب وحل ما قبل عسر الهضم من 4 درجات مئوية إلى غطاء الخلية ثقافة. دع أنسجة القلب تغرق في قاع الأنبوب وأزل محلول ما قبل عسر الهضم باستخدام ماصة مصلية 10 مل. المقبل، إضافة 10ml من HBSS في أنبوب.Resuspend أنسجة القلب مع HBSS 2 إلى 3 مرات لغسل التربسين باستخدام ماصة المصلية 10ml. سبيرات HBSS وإضافة 10ml من حل الهضم الكولاجين قبل الدفء في أنبوب مع أنسجة القلب. لعملية الهضم الأولى، احتضان الأنبوب مع أنسجة القلب في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق دون تحريض.بعد ذلك، نقل أنبوب إلى غطاء الخلية ثقافة. إعادة تاليل الأنسجة عن طريق إعادة تعليقها بلطف 10 مرات باستخدام ماصة 10ml المصلية. وهذا سيسمح للقلب لتفريق والخلايا التي سيتم تحريرها من أنسجة القلب.دع الأنسجة غير المهضومة تغرق نقل الحل المهضم المخصب في cardiomyocytes إلى أنبوب مخروطي جديد وعلى الفور إضافة كمية متساوية من خلية ثقافة المتوسطة لوقف هضم الكولاجيناز. ثم إضافة 10ml من حل الهضم collagenase في أنبوب يحتوي على أنسجة القلب المتبقية غير مهضومة.للهضم الثاني، احتضان أنبوب مع أنسجة القلب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. كرر إجراءات الهضم الأول ونقل الحل المهضم المخصب في عضلة القلب إلى أنبوب مخروطي جديد قبل وقف هضم الكولاجيناز. المقبل، وضع مصفاة خلية معقمة في أنبوب مخروطي معقم جديد 50ml.قبل الرطب مصفاة الخلية مع 2 إلى 3 مل من خلية ثقافة المتوسطة وتمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية. في وقت لاحق، شطف مصفاة الخلية مع خلية ثقافة المتوسطة. ثم، الطرد المركزي أنبوب مخروطية تحتوي على cardiomyocytes لمدة 5 دقائق في 180 مرة الجاذبية.بعد 5 دقائق، الطامح من عظمى و resuspend بيليه الخلية في 10ml من خلية ثقافة المتوسطة. لوحة الخلايا على طبق ثقافة الخلية 10cm واحتضانها لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، يهيج بلطف لوحة.غسل قبالة الخلايا غير أتباع وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا متوسطة ثقافة الخلية على الطبق باستخدام ماصات المصلية 10ml. ثم، نقل الخلايا غير أتباع في طبق ثقافة خلية 10cm جديدة واحتضان لهم لمدة ساعة أخرى. بعد ساعة ، يهيج الطبق بلطف ويغسل الخلايا غير المنضمة.نقل القلبيات القلبية إلى أنبوب مخروطي جديد 50ml. المقبل، وإعداد لوحة ثقافة 96-well عن طريق الاقتباس 50 ميكرولترات من حل الطلاء في كل بئر من لوحة ثقافة الخلية 96-well. إذا كانت الفقاعات موجودة، إزالتها باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح لتجفيف طلاء المصفوفة. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. لوحة الخلايا في المصفوفة خارج الخلوية المغلفة 96 جيدا خلية لوحة ثقافة في كثافة بين 10 إلى 30 ألف خلية في البئر.ووضع الخلايا في الاحتضان. لتشخيط فحص استهلاك الأكسجين، ترطيب خرطوشة استشعار محلل تدفق لمدة 3 ساعات على الأقل، إضافة 200 ميكرولترات من حل الكاليبانت في كل بئر من لوحة فائدة. ضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى على لوحة المرافق وتحتضن في 37 درجة مئوية دون مكملات ثاني أكسيد الكربون أو O2 لمدة 3 ساعات على الأقل.ساعة واحدة قبل الفحص، وإزالة بلطف متوسطة ثقافة الخلية وغسل الخلايا مع 200 ميكرولترات من الإجهاد الميتوكوندريا قبل اختبار المتوسط مرتين. بعد الغسيل الثاني، إضافة 175 ميكرولترات من اختبار الإجهاد الميتوكوندريا قبل الإرهاق المتوسطة. ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية دون ثاني أكسيد الكربون أو مكملات الأكسجين.إعداد 3ml من كل من مركبات الاختبار في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا المتوسطة. قم بتحميل 25 ميكروليتر لكل مركب في منافذ الحقن لخراطيش الاستشعار باستخدام ماصة متعددة القنوات. حالة الخلايا وأية معالجة مسبقة يمكن أن تؤثر على أقصى قدر من استعادة التي أثارها حقن FCCP uncoupler.حساسية الخلية إلى uncoupler يمكن أيضا تغيير، وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتحسين تركيز العمل من FCCP لكل علاج معين. في وقت لاحق، قم بإعداد بروتوكول فحص التدفق الخلوي الإضافي وبدء تشغيل البرنامج. أولاً، ضع جهاز الاستشعار في آلة المعايرة.استبدال الكاليبريانت لصفيحة مُقايسة مرة واحدة يتم إجراء خطوة المعايرة. إذا رغبت، بعد الفحص، تجاهل بعناية جميع المتوسطة المقايسة باستخدام ماصة متعددة القنوات. وتخزين mircoplate ثقافة الخلية في السلبية 20 درجة مئوية لتطبيع الخلايا في المستقبل باستخدام مقايسة البروتين.باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم عزل القلوب من اليوم 0 الجراء الجديدة وذريات القلب في كثافات 10 أو 20 أو 30 ألف خلية في البئر في 96 بئر. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، تم العثور على cardiomyocytes تعلق بشكل جيد على سطح البلاستيك المغلفة، وكان هناك عدد قليل جدا من الخلايا غير المرفقة. عند هذه النقطة، التعاقد تلقائيا cardiomyocytes كانت مرئية بسهولة.وأظهرت كثافة البذر من 30،000 الخلايا في جيدا التقاء بعد يوم واحد من البذر كما تنتشر الخلايا. كانت مناعة Cardiomyocytes مع جسم مضاد ضد ساركMERIC ألفا actinin ، وهو علامة محددة cardiomyocyte. كما هو مبين هنا، أظهرت معظم الخلايا تلطيخ إيجابي من أكتينين ألفا مما يدل على نقاء عالية من عزل cardiomyocyte.يظهر مخطط واحد نموذجي اختبار الإجهاد الميتوكوندريا هنا. يبدأ اختبار الإجهاد الميتوكوندريا مع قياس خط الأساس لمعدل استهلاك الأكسجين، ويتبع ذلك حقن myosin Oligo الذي يمنع ATPA. ثم، تم حقن عامل فك الارتباط FCCP لقياس معدل استهلاك الأكسجين الأقصى.وأخيرا، مع حقن اثنين من مثبطات مجمع نقل الإلكترون، التنفس الميتوكوندريا يتوقف تماما وينخفض OCR إلى أدنى مستوى له. للحصول على نتائج متناسقة وقابلة للتكرار. من المهم للغاية تحقيق ارتفاع البقاء على قيد الحياة.لذلك، من المهم استخدام حديثي الولادة والأنسجة القلبية التعامل بلطف في خلايا القلب. باستخدام خطوط الماوس الجديدة أو الموجودة المعالجة وراثيا، يمكن ترجمة هذه الطريقة بسهولة إلى البيانات التي قد تؤدي إلى فهم آليات جديدة لتنظيم الطاقة الحيوية في القلب. الميتوكوندريا تلعب الأدوار الرئيسية في وظيفة القلب.نتوقع أن تساعد هذه الطريقة في تحديد المنظمين والممرات الجديدة التي تنظم عملية التمثيل الغذائي المؤكد وإيجاد أهداف علاجية جديدة لعلاج قصور القلب.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

التصور والتحليل من تدفق الدم واستهلاك الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي: تطبيق نموذج لالتهاب الكبد الحاد

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

في قياس الرحم من معدل ضربات القلب في الماوس بواسطة موسع M-وضع ضربات القلب

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

وحديثي الولادة ماوس الحبل الشوكي ضغط إصابة نموذج

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; أداة الفحص في أبحاث السمع

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

النهج الخلفي نصف دائري قناة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الماوس الأطفال حديثي الولادة

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

وظيفة اللاإرادي بعد ارتجاج في الرياضيين الشباب: استكشاف تقلب معدل ضربات القلب باستخدام منهجية تسجيل 24 ساعة

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

في المختبر تقييم وظيفة القلب باستخدام خلايا القلب skinned

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...