Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbejde støttes af American Heart Association (14SDG17790005) til YC NIH (HL115933, HL127806) og VA Merit (BX003260) til R.S.R.

For arbejde med neonatal mus, henvises til lokale Universitetsinstitut retningslinjer sæt frem af dyrs pleje programmer og overholde ens institutionelle og andre relevante bestemmelser. Alle metoder, der beskrives i denne protokol er blevet godkendt af UC San Diego institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og overholde føderale og statslige regulativer.
1. forberedelse af reagenser
<ol><li>Forberede 25 mL før fordøjelsen løsning: HBSS (uden Ca2 + og ...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

I denne undersøgelse, har vi etableret en enkel protokol til isolering og dyrkning mus neonatal cardiomyocytes. Ved hjælp af disse cardiomyocytes, optimeret vi også betingelser at måle ilt forbrugshastigheden ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gør det muligt at bruge musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i de vigtigste arbejde celler i hjertet, beslægtet med hvad vil blive målt i intakt organ. Vores pr...

For at opretholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunktion, skal cardiomyocytes opretholde et konstant tilførsel af cellulære energi primært i form af ATP1. I hjertet, er ca. 95% af ATP genereret af mitokondrier, hovedsagelig gennem oxidativ fosforylering, viser, at mitokondrier spiller en afgørende bioenergetic rolle i hjertefunktion2,3. Støtte til dette begreb er der dysregulering af mitokondrie-funktionen kan føre til kardiomyopati og hjertesvigt4,5. Omvendt, genoprette mitokondrie funktion har vist at forbedre hjertefunktion af svigtende hjerte6,7. Derfor, at studere mekanismen af mitokondrie bioenergetik og identificere roman regulatorer af mitokondrie-funktionen i cardiomyocytes vil ikke kun afsløre mekanistiske indblik i hjertets energiproduktion men også kunne give indsigt, der vil føre til udvikling af nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme6,8.
I forhold til hele hjertet, som indeholder en blanding af myocytes og ikke-myocytes9, cardiomyocyte kulturer er meget ren, med minimal forurening af ikke-myocytes fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. Desuden isolerer cardiomyocytes fra neonatal pups muliggør dyrkning af et stort antal celler i en lille mængde af tid, sammenlignet med isolerende celler fra voksne hjerter10,11. Vigtigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse tid (f.eks. 24 h) og på længere tid punkter at differentiere. Neonatal mus cardiomyocytes kan overleve og manipuleres til op til 7 dage i kultur, hvilket gør dem ideelle til afprøvning af virkningerne af narkotika forbindelser og genmanipulation på funktionen af mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, der er væsentlige biologiske forskelle mellem de voksne og neonatal celler, men den længere varighed for kultur af neonatal celler gør dem velegnet til mange forskellige typer af undersøgelser, herunder de af mitokondrie funktion.
Til dato, har primære kulturperler neonatal mus og rotter cardiomyocytes været brugt som modeller til at undersøge hjertets bioenergetik12,13. I de seneste år brugt undersøgelser en ekstracellulære flux analyzer til at måle ilt forbrugssats (OCR) og evaluere oxidative kapacitet i mus og rotter neonatal cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, mus neonatal cardiomyocytes celle levedygtighed er lavere og har større variabilitet16. Også gør mulighed for at studere celler fra genetisk modificerede musemodeller musen celle model meget vigtigt. OCR undersøgelser er så følsomme over for celle nummer og såning tæthed, er udvikling af en reproducerbar, pålidelig og enkel protokol til at opnå ensartede celle udbytte og levedygtighed nødvendig.
Her rapporterer vi en optimeret protokol, der er blevet udviklet som bruger kulturperler mus neonatal cardiomyocytes sammen med en 96-brønd-format ekstracellulære flux analyzer for OCR analyse. Denne protokol øger reproducerbarhed af analysen. Derudover protokollen ikke kun giver en roman og reproducerbar metode til OCR analyse, men også kunne blive tilpasset til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, som den, der kan være behov for at undersøge myofibrillar funktioner og intracellulære signalering veje.
Især beskriver denne protokol en endags-procedure for isolation og kultur af neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønd celle kultur plade. Derudover beskriver det procedure for at måle iltforbrug ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer. Alle løsninger bruges er sterile eller sterile filtreret. Alle værktøjer er steriliseret ved 75% ethanol. Vi leverer en Tabel af materialer til forskellige dele af proceduren. Til dyrkning af cardiomyocytes, udføres alle procedurer og trin i en standard celle kultur hætte. Denne protokol er udviklet til isolering af neonatal mus hjerter fra et kuld (ca 8-10 unger). Protokollen kan dog også være tilpasset til at isolere cardiomyocytes fra flere kuld.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitokondrier og oxidative metabolisme er afgørende for at opretholde hjerte muskelfunktion. Forskning har vist, at mitokondriel dysfunktion er en vigtig medvirkende faktor til nedsat hjertefunktion fundet i hjertesvigt. Derimod kan genoprette defekte mitokondrie funktion have gavnlige effekter til at forbedre hjertefunktion i svigtende hjerte. Derfor, at studere de reguleringsmekanismer og identificere roman regulatorer til mitokondrie funktion kunne give indsigt, som kunne bruges til at udvikle nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme. Her, er hjerte myocyte mitokondrie respiration analyseret ved hjælp af en unik celle kultur system. Først, en protokol er optimeret, så hurtigt isolere og kultur høj rentabilitet neonatal mus cardiomyocytes. Derefter, en 96-brønds format ekstracellulære flux analyzer bruges til at vurdere ilt forbrug på disse cardiomyocytes. For denne protokol, vi optimeret såning betingelser og demonstreret at neonatal mus cardiomyocytes ilt forbrugssats kan vurderes let i en ekstracellulære flux analyzer. Endelig, vi konstatere, at vores protokol kan anvendes til en større størrelse, kultur og andre undersøgelser, såsom intracellulær signalering og kontraktile fungere analyse.

Ved hjælp af protokollen beskrevet, blev hjerter isoleret fra dag 0 neonatal unger. 5 x 105 celler/hvalp blev indhentet, og cardiomyocytes var seedet ved tætheder af 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/brønd, i 96 godt plader (figur 2A). Efter overnatning kultur, cardiomyocytes blev fundet godt vedlagte belagt plastic overflade, og der var meget få ikke-tilknyttede celler (løstliggende cellerne vises stadig...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analysere ilt forbrugssats i primære kulturperler mus Neonatal Cardiomyocytes ved hjælp af en ekstracellulære Flux Analyzer

Målet med denne protokol er at illustrere, hvordan du bruger musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i hjertet.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Denne protokol giver os mulighed for at isolere og kultur høj bi-BBT, kun kendt for at mus kardiomyocytter. At vurdere mitokondriel funktion, iltforbrug sats af kardiomyocytter kan analyseres af en egentlig sølv flux analysator. En af fordelene ved denne teknik er, at iltforbrug af kardiomyocytter let kan måles i deres klæbende tilstand i 96-godt format, som gør det muligt at teste flere betingelser med et stort antal replikater.Dette fartøj giver vigtig indsigt i forskningsområdet for kardiologi. Ud over iltforbrug, Vi kan også studere andre metaboliske parametre, såsom greygrices og peracid epoxidation. Opnåelse af høj variation af kardiomyocytter er afgørende for dette eksperiment.Dette kræver effektiv fordøjelse af hjerter. Da neo-natal kardiomyocytter er meget skrøbelige, er skånsom håndtering af kardiomyocytter også vigtig. I cellekulturhætten, aliquot 5ml af HBSS til hver brønd af en 6-godt cellekultur plade og læg den på is.Derudover, aliquot 10ml af HBSS til en 10cm celle kultur fad, derefter forberede 20 ml Trypsin Predigestion opløsning i en 50ml steril konisk rør. Hold alle løsningerne på is. Dernæst udtrække hjertet og overføre det straks til den sterile celle kultur skål, der indeholder HBSS.Fjern eventuelle resterende lungevæv og større fartøjer. Vask hjertet i HBSS ved hjælp af let omrøring. Derefter skæres hjertet med en fin saks i 8 stykker og overfør hjertevævet med scelinter i en brønd af en 6-brøndcellekulturplade med HBSS.Ved hjælp af en moriaske skal hjertevævet vaskes ved at overføre det fra brønd til brønd i den 6-brøndsplade fyldt med HBSS. Derefter overføres hjertevævet til et konisk rør, der indeholder 20 ml Trypsin, og inkuberes med blid omrøring ved 4 grader celsius i 4 timer. I denne procedure, prewarm kollagenase fordøjelsesopløsning i et vandbad ved 37 grader celsius.Overfør det koniske rør, der indeholder hjertevæv og prædigestionsopløsning, fra 4 grader celsius til en cellekulturhætte. Lad hjertevævet synke til bunden af røret og fjern prædigestionsopløsningen ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Dernæst tilsættes 10 ml HBSS i røret.Resuspend hjertevævet med HBSS 2 til 3 gange for at vaske Trypsin ud ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Aspirere HBSS og tilsæt 10 ml forvarmet kollagen fordøjelsesopløsning i røret med hjertevæv. For den første fordøjelse, inkubere røret med hjertevæv i et vandbad ved 37 grader celsius i 10 minutter uden omrøring.Derefter overføres røret til cellekulturhætten. Triturate vævet ved at resuspending det forsigtigt 10 gange ved hjælp af en 10ml serologisk pipette. Dette vil gøre det muligt for hjertet at sprede og cellerne, der skal frigives fra hjertevævet.Lad det ufordøjede væv synke. Overfør den fordøjede opløsning beriget med kardiomyocytter til et nyt konisk rør, og tilsæt straks en tilsvarende mængde cellekulturmedium for at stoppe kollagenasefordøjelsen. Derefter tilsættes 10 ml kollagen fordøjelsesopløsning i røret, der indeholder de resterende ufordøjede hjertevæv.For den anden fordøjelse, inkubere røret med hjertevæv i en 37 grader celsius vandbad i 10 minutter. Gentag procedurerne for den første fordøjelse og overfør den fordøjede opløsning beriget med kardiomyocytter til et nyt konisk rør, før kollagen fordøjelsen stoppes. Dernæst placere en steril celle si i en ny steril 50ml konisk rør.Fortæt cellestingen med 2 til 3 ml cellekulturmedium og før cellerne gennem cellestingen. Skyl efterfølgende cellestingen med cellekulturmedium. Derefter centrifuge det koniske rør, der indeholder kardiomyocytter i 5 minutter ved 180 gange tyngdekraften.Efter 5 minutter, aspirere supernatant og resuspend cell pellet i 10ml af cellekultur medium. Plade cellerne på en 10cm cellekultur fad og inkuber dem i en time. Derefter skal pladen forsigtigt omrøres.Vask de ikke-klæbende celler og resuspend cellerne ved gentagne gange pipettering af cellekulturmediet over skålen ved hjælp af en 10ml serologisk pipette. Derefter overføres de ikke-klæbende celler til en ny 10 cm cellekulturskål og inkuberes dem i endnu en time. Efter en time, forsigtigt ophidse pladen og vaske de ikke-klæbende celler.Overfør kardiomyocytterne til et nyt 50 ml konisk rør. Dernæst forberede en 96-brønd kultur plade ved at aliquoting 50 mikroliter af belægning løsning i hver brønd af 96-godt celle kultur plade. Hvis der er bobler til stede, skal du fjerne dem ved hjælp af en 20 mikroliterpipette.Inkuber pladen ved 37 grader celsius i mindst en time for at tillade tørring af matrixbelægningen. Derefter tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Plade cellerne ind i den ekstra-cellulære matrix belagt 96-godt cellekultur plade på en tæthed mellem 10 til 30 tusind celler pr brønd.Og læg cellerne i inkubationen. For at præforme iltforbrug assay, fugte en flux analysator sensor patron i mindst 3 timer, tilsættes 200 mikroliter af kalibrerant opløsning i hver brønd af utility plade. Ansk af sensorpatronen på brugspladen og inkuber i 37 grader celsius uden CO2- eller O2-tilskud i mindst 3 timer.En time før analysen fjernes cellekulturmediet forsigtigt og cellerne vaskes med 200 mikroliter af det forvarmede mitokondrielle stresstestmedium medium to gange. Efter den anden vask, tilsæt 175 mikroliter af prewarmed mitokondrielle stresstest medium. Derefter kultur cellerne ved 37 grader celsius uden kuldioxid eller ilt tilskud.Forbered 3 ml af hver af testforbindelserne i mitokondrielt stresstestmedium. Indlæs 25 mikroliter af hver forbindelse i sensorpatronens injektorporte ved hjælp af en flerkanalspipette. Cellernes tilstand og eventuelle forbehandlinger kan påvirke den maksimale restaurering, der fremkaldes ved injektion af uncoupler FCCP.Cellefølsomhed over for uncoupler kan også ændre sig, derfor er det afgørende at optimere arbejdskoncentrationen af FCCP for hver enkelt behandling. Efterfølgende oprette ekstra-cellulære flux assay protokol og starte programmet. Først sætte sensoren cartiridge i maskinen til kalibrering.Udskift kalibrering til analysepladen, når kalibreringstrinnet er udført. Hvis det ønskes, efter analysen, omhyggeligt kassere alle analyse medium ved hjælp af en multi-kanal pipette. Og gemme cellekultur mircoplate på negative 20 grader celsius for fremtidig celle normalisering ved hjælp af protein assay.Ved hjælp af den beskrevne protokol blev hjerter isoleret fra dag 0 neonatal unger, og kardiomyocytter blev seedet ved tætheden på 10, 20 eller 30 tusind celler pr. brønd i 96-brøndsplader. Efter natten kultur, kardiomyocytter blev fundet godt knyttet til den belagte plastoverflade, og der var meget få løsgængere celler. På dette tidspunkt, spontant ordregivende kardiomyocytter var let synlige.En såningstæthed på 30.000 celler pr. brønd viste sammenløb en dag efter såning, da cellerne spredte sig. Kardiomyocytter blev immunostained med et antistof mod sarkomerisk alfa actinin, en kardiomyocyt specifik markør. Som vist her, de fleste af cellerne viste positiv farvning af alpha actinin angiver den høje renhed af cardiomyocyte isolation.En ordning med en typisk mitokondriel stresstest er vist her. Mitokondriel stresstest starter med en base linje måling af iltforbruget sats, dette efterfølges af injektion af Oligo myosin, som hæmmer ATPA's. Derefter blev frakoblingsmidlet FCCP injiceret for at måle den maksimale iltforbrugshastighed.Endelig, med injektion af to elektron transport komplekse hæmmere, mitokondrielle respiration helt stopper og OCR falder til sit laveste niveau. For at opnå ensartede og reproducerbare resultater. Det er afgørende at opnå høj overlevelsesgrad.Derfor er det vigtigt at bruge nyfødte nyfødte og forsigtigt håndteres hjertevæv i kardiomyocytter. Ved at bruge nye eller eksisterende genetisk manipulerede muselinjer kan denne metode let oversættes til data, der kan føre til forståelse af nye mekanismer for bioenergitisk regulering i hjertet. Mitokondrielle spille centrale roller i hjertefunktion.Vi forventer, at denne metode til at hjælpe med at identificere nye regulatorer og veje regulere oxiderende stofskifte og finde nye terapeutiske mål for behandling af hjertesvigt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse af blodgennemstrømning og iltforbruget i Nedsat mikrocirkulation: Ansøgning til en akut hepatitis model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I livmoderen Måling af Puls i mus ved Noninvasiv M-mode Ekkokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool i Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Bageste halvrunde kanalen tilgang til indre øre gen levering i Neonatal mus

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Autonom funktion efter hjernerystelse i unge atleter: en udforskning af pulsvariationen 24-timers optagelse metode

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetik undersøgelse af Candida albicans ved hjælp af Real-time ekstracellulære Flux analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...