Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

We zouden graag bedanken alle Ross lab en Murphy lab leden. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) en VA verdienste (BX003260) aan R.S.R.

Voor werk met neonatale muizen, verwijzen naar lokale universiteit/Instituut richtsnoeren set weer door de dierenverzorgers programma's en zich houden aan iemands institutionele en andere verordeningen. Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de UC San Diego institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de federale en nationale regelgeving.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>Bereiden van 25 mL pre vergisting oplossing:...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

In deze studie hebben we een eenvoudig protocol om te isoleren en kweken van muis neonatale cardiomyocytes opgericht. Met behulp van deze cardiomyocytes, we ook de voorwaarden voor het meten van zuurstof verbruik tarief met behulp van een systeem van extracellulaire flux analyzer geoptimaliseerd. Het protocol maakt het mogelijk om het gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe verschillende factoren zuurstofverbruik in de belangrijkste werkende cellen van het hart, verwant aan wa...

Om een continue contractiele hartfunctie, moeten cardiomyocytes behouden een constante aanvoer van cellulaire energie voornamelijk in de vorm van ATP1. In het hart, wordt ongeveer 95% van ATP gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk door middel van oxidatieve fosforylatie, waaruit blijkt dat de mitochondria een sleutelrol in de bio-energetische in hartfunctie2,3 spelen. Het ondersteunen van dit begrip is dat disregulatie van mitochondriale functie kan leiden tot cardiomyopathie en hartfalen4,5. Omgekeerd, herstel van mitochondriale functie is aangetoond dat verbetering van de hartfunctie van het falende hart6,7. Daarom, bestuderen van het mechanisme van de mitochondriale Bioenergetica en het identificeren van nieuwe toezichthouders van mitochondriale functie in cardiomyocytes mechanistische inzichten van cardiale energieproductie alleen niet zal onthullen maar ook kunnen inzicht geven die zal leiden aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten6,8.
Vergeleken met het hele hart, waarin een mengsel van myocytes en niet-myocytes9, cardiomyocyte culturen zijn uiterst zuiver, met minimale besmetting van niet-myocytes vanuit het hart, zoals fibroblasten en endotheliale cellen10. Bovendien, isoleren van cardiomyocytes van neonatale pups kan kweken een groot aantal cellen in een kleine hoeveelheid tijd, in vergelijking met isolerende cellen van volwassen harten10,11. Bovenal primaire gekweekte volwassen muis cardiomyocytes hebben korte overleving tijden (bijv. 24 uur) en bij langere tijd punten-onderscheid maken. Neonatale muis cardiomyocytes kunnen overleven en voor meer dan 7 dagen in de cultuur, waardoor ze ideaal zijn voor het testen van de effecten van de drug compounds en genetische manipulatie op de functie van mitochondriën in cardiomyocytes10worden gemanipuleerd. Natuurlijk, er zijn aanzienlijke biologische verschillen tussen de volwassen en neonatale cellen, maar de langere duur die beschikbaar zijn voor cultuur van neonatale cellen maakt ze geschikt voor vele verschillende types van studies, met inbegrip van die van mitochondriale functie.
Tot op heden, zijn primaire gekweekte neonatale muis en rat cardiomyocytes gebruikt als modellen om te studeren cardiale Bioenergetica12,13. In de afgelopen jaren gebruikt studies een extracellulaire flux analyzer meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) en evalueren van oxidatieve capaciteit in muis en rat neonatale cardiomyocytes14,15. Terwijl in vergelijking met ratten, de levensvatbaarheid van de cellen van de neonatale cardiomyocytes muis is lager en heeft grotere variabiliteit16. De mogelijkheid te bestuderen van cellen uit genetisch gemodificeerde Muismodellen maakt de mobiele muismodel ook, heel belangrijk. Gezien het feit dat OCR studies zo gevoelig zijn voor cel nummer en dichtheid te zaaien, is de ontwikkeling van een protocol reproduceerbaar, betrouwbare en eenvoudig te bereiken consistente cel opbrengst en levensvatbaarheid nodig.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde protocol dat is ontwikkeld die gebruik maakt van de neonatale cardiomyocytes gekweekte muis samen met een 96-goed-formaat extracellulaire flux analyzer voor OCR analyse. Dit protocol verhoogt de reproduceerbaarheid van de test. Bovendien, het protocol biedt niet alleen een roman en reproduceerbare methode voor de analyse van de OCR, maar ook tot een grotere grootte cultuur zou kunnen worden aangepast voor andere experimentele doeleinden, zoals die die wellicht nodig zijn om te studeren van myofibrillar functies en intracellulaire Signaalroutes.
Met name beschrijft dit protocol een eendaagse procedure voor isolatie en cultuur van neonatale muis cardiomyocytes in een 96-Wells cel cultuur plaat. Bovendien, het wordt de procedure beschreven voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Alle oplossingen gebruikt worden steriel of steriele gefilterd. Alle tools zijn gesteriliseerd door 75% ethanol. Wij bieden een Tabel van materialen voor diverse onderdelen van de procedure. Voor het kweken van cardiomyocytes, worden alle procedures en stappen uitgevoerd in een standaard cel cultuur kap. Dit protocol is ontwikkeld voor de isolatie van neonatale muis harten uit één nest (ongeveer 8-10 pups). Het protocol kan echter ook worden aangepast voor het isoleren van cardiomyocytes uit meerdere nesten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitochondriën en oxidatieve metabolisme zijn kritisch voor de handhaving van de functie van de hartspier. Onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriale dysfunctie is een belangrijke factor die bijdraagt aan verminderde hartfunctie bij hartfalen gevonden. Daarentegen, kan herstel van defecte mitochondriale functie hebben gunstige effecten ter verbetering van de hartfunctie in het falende hart. Dus, de regulerende mechanismen te bestuderen en het identificeren van nieuwe regelgevende instanties voor mitochondriale functie kunnen inzicht geven die kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Hier, wordt cardiale myocyte mitochondriale ademhaling geanalyseerd met behulp van een unieke celcultuur. Ten eerste, een protocol is geoptimaliseerd om snel isoleren en hoge levensvatbaarheid neonatale muis cardiomyocytes cultuur. Vervolgens wordt een 96-Wells-indeling extracellulaire flux analyzer gebruikt ter beoordeling van de zuurstof verbruik tarief van deze cardiomyocytes. Voor dit protocol, we geoptimaliseerd zaaien voorwaarden en aangetoond dat pasgeborenen muis cardiomyocytes zuurstof verbruik tarief kan gemakkelijk worden beoordeeld in een extracellulaire flux-analysator. Tot slot, wij stellen vast dat ons protocol kan worden toegepast op een groter formaat van de cultuur en andere studies, zoals de intracellulaire signalering en contractiele functie analyse.

Met behulp van het protocol beschreven, werden harten geïsoleerd van de neonatale pups dag 0. 5 x 105 cellen/pup zijn verkregen, en cardiomyocytes waren agarvoedingsbodem op dichtheid van 10 x 10,3, 20 x 103of 30 x 103 cellen/well, in 96 goed platen (figuur 2A). Na overnachting cultuur, cardiomyocytes bleken goed verbonden met het plastic gecoate oppervlak en er waren weinig niet-vastgemaakte cellen (de niet-vastge...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Dit protocol stelt ons in staat om te isoleren en cultuur hoge bi-BBT, alleen bekend om de muis cardiomyocyten. Om de mitochondriale functie te evalueren, kan het zuurstofverbruik van cardiomyocyten worden geanalyseerd door een echte zilverfluxanalyzer. Een van de voordelen van deze techniek is dat het zuurstofverbruik van cardiomyocyten gemakkelijk kan worden gemeten in hun aanhangende toestand in 96-well formaat, waardoor het testen van meerdere omstandigheden met een groot aantal replicaties mogelijk is.Dit vat geeft belangrijke inzichten in het onderzoeksgebied van cardiologie. Naast het zuurstofverbruik kunnen we ook andere metabole parameters bestuderen, zoals grijsgrices en uitgezuurde epoxidatie. Het bereiken van een hoge variabiliteit van cardiomyocyten is van cruciaal belang voor dit experiment.Dit vereist een efficiënte vertering van harten. Aangezien neonatale cardiomyocyten zeer kwetsbaar zijn, is een zachte behandeling van cardiomyocyten ook belangrijk. In de cel cultuur kap, aliquot 5ml hbss aan elke put van een 6-goed cel cultuur plaat en plaats het op ijs.Bovendien, aliquot 10ml HBSS aan een 10cm cel kweekschotel, dan, bereid 20 ml Trypsin Predigesttion oplossing in een 50ml steriele conische buis. Houd alle oplossingen op ijs. Haal vervolgens het hart eruit en breng het onmiddellijk over naar het steriele celkweekgerecht met HBSS.Verwijder eventueel resterende longweefsel en grotere bloedvaten. Was het hart in HBSS met behulp van zachte agitatie. Snijd vervolgens het hart met een fijne schaar in 8 stukken en breng het hartweefsel met tangen over in één put van een 6-put celkweekplaat met HBSS.Met behulp van een moria lepel, was het hartweefsel door het overbrengen van goed naar goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS. Breng vervolgens het hartweefsel over in een conische buis met 20 ml Trypsin en incbaat met zachte agitatie bij 4 graden Celsius gedurende 4 uur. In deze procedure, prewarm de collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad op 37 graden celsius.Breng de conische buis met hartweefsel en predigestie oplossing van 4 graden Celsius naar een cel cultuur kap. Laat het hartweefsel zinken naar de bodem van de buis en verwijder de predigestie oplossing met behulp van een 10ml serologische pipet. Voeg vervolgens 10 ml HBSS toe aan de buis.Resuspend het hartweefsel met HBSS 2 tot 3 keer uit te wassen Trypsin met behulp van een 10ml serologische pipet. Aspirate HBSS en voeg 10ml van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hartweefsel. Voor de eerste spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een waterbad op 37 graden celsius gedurende 10 minuten zonder agitatie.Breng de buis daarna over naar de celkweekkap. Triturate het weefsel door het voorzichtig 10 keer te herhalen met behulp van een 10ml serologische pipet. Dit zal het mogelijk maken het hart te verspreiden en de cellen worden vrijgegeven uit het hartweefsel.Laat het onverteerd weefsel zinken. Breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis en voeg onmiddellijk een gelijke hoeveelheid celkweekmedium toe om de collagenasevertering te stoppen. Voeg vervolgens 10 ml collagenase spijsverteringsoplossing toe aan de buis met het resterende onverteerd hartweefsel.Voor de tweede spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten. Herhaal de procedures van de eerste spijsvertering en breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis voordat u de collagenase-spijsvertering stopt. Plaats vervolgens een steriele celzeef in een nieuwe steriele 50ml conische buis.Maak de celzeef voor aan met 2 tot 3 ml celkweekmedium en geef de cellen door de celzeef. Spoel vervolgens de celzeef af met celkweekmedium. Vervolgens, centrifugeren de conische buis met cardiomyocyten gedurende 5 minuten op 180 keer de zwaartekracht.Na 5 minuten, aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in 10ml van de cel cultuur medium. Plaats de cellen op een 10cm celkweekschaal en broed ze een uur lang uit. Daarna, zachtjes roeren de plaat.Was de niet-aanhangende cellen af en verhoog de cellen door herhaaldelijk het celkweekmedium over de schotel te pipetten met behulp van een 10ml serologische pipet. Breng vervolgens de niet-aanhangende cellen over in een nieuwe 10cm celkweekschaal en ontcubeer ze nog een uur. Na een uur, voorzichtig roeren de plaat en afwassen van de niet-aanhangende cellen.Breng de cardiomyocyten over in een nieuwe 50ml conische buis. Bereid vervolgens een 96-well cultuurplaat door 50 microliter coatingoplossing in elke put van de 96-put celkweekplaat te aliquoting. Als er bellen aanwezig zijn, verwijder ze dan met een pipet van 20 microliter.Incubeer de plaat op 37 graden celsius gedurende ten minste een uur om het drogen van de matrix coating mogelijk te maken. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen in de extra cellulaire matrix gecoate 96-well cel kweekplaat bij een dichtheid tussen 10 tot 30 duizend cellen per put.En plaats de cellen in de opbroeder. Om de zuurstofverbruikstest vooraf te vormen, hydrateer u een flux analyzer sensor cartridge voor ten minste 3 uur, voeg 200 microliter van calibrant oplossing in elke put van de utility plate. Plaats de sensorcartridge terug op de nutsplaat en broed gedurende ten minste 3 uur in 37 graden celsius zonder CO2- of O2-suppletie.Een uur voor de test, verwijder voorzichtig de cel cultuur medium en was de cellen met 200 microliter van prewarmed mitochondriale stress test medium tweemaal. Voeg na de tweede wasbeurt 175 microliter voorverwarmd mitochondriaal stresstestmedium toe. Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius zonder kooldioxide of zuurstof suppletie.Bereid 3 ml van elk van de testverbindingen in mitochondriale stress test medium. Laad 25 microliter van elke verbinding in de injectorpoorten van de sensorcartridge met behulp van een multikanaalpipet. Toestand van de cellen en eventuele voorbehandelingen kunnen van invloed zijn op de maximale restauratie die wordt opgewekt door injectie van ontkoppelde FCCP.Celgevoeligheid voor de ontkoppelaar kan ook veranderen, daarom is het van cruciaal belang om de werkconcentratie van FCCP voor elke specifieke behandeling te optimaliseren. Vervolgens, het opzetten van extra cellulaire flux test protocol en start het programma. Plaats eerst de sensor cartiridge in de machine voor kalibratie.Vervang de remklauw voor de testplaat zodra de kalibratiestap is uitgevoerd. Gooi indien gewenst, na de test, zorgvuldig alle testmedium weg met behulp van een multi-channel pipet. En bewaar de celkweek mircoplate op negatieve 20 graden Celsius voor toekomstige celnormalisatie met behulp van eiwittest.Door het beschreven protocol te gebruiken, werden harten geïsoleerd vanaf dag 0 neonatale pups en werden cardiomyocyten gezaaid bij dichtheden van 10, 20 of 30 duizend cellen per put in 96-well platen. Na de nachtelijke cultuur, cardiomyocyten werden gevonden goed gehecht aan de gecoate plastic oppervlak en er waren zeer weinig niet-verbonden cellen. Op dit punt, spontaan aanbestedende cardiomyocyten waren gemakkelijk zichtbaar.Een zaaidichtheid van 30.000 cellen per put toonde samenvloeiing een dag na het zaaien als de cellen zich verspreiden. Cardiomyocyten werden immunostained met een antilichaam tegen sarcomeric alpha actinine, een cardiomyocyte specifieke marker. Zoals hier getoond, vertoonden de meeste cellen een positieve kleuring van alfa-actinine die de hoge zuiverheid van de cardiomyocyte-isolatie aangeeft.Een schema van een typische mitochondriale stresstest wordt hier getoond. De mitochondriale stresstest begint met een basislijnmeting van het zuurstofverbruik, dit wordt gevolgd door de injectie van Oligo myosine die ATPA's remt. Vervolgens werd het ontkoppelingsmiddel FCCP geïnjecteerd om het maximale zuurstofverbruik te meten.Ten slotte stopt mitochondriale ademhaling met de injectie van twee elektronentransporten volledig en daalt OCR tot het laagste niveau. Om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Het is van cruciaal belang om een hoge overlevingskansen te bereiken.Daarom is het belangrijk om pasgeboren neonaten te gebruiken en zorgvuldig behandeld hartweefsels in cardiomyocyten. Door het gebruik van nieuwe of bestaande genetisch gemanipuleerde muislijnen, kan deze methode gemakkelijk worden vertaald naar gegevens die kunnen leiden tot het begrijpen van nieuwe mechanismen voor bio-energetische regelgeving in het hart. Mitochondriaal spelen belangrijke rollen in hartfunctie.We verwachten dat deze methode zal helpen bij het identificeren van nieuwe regelgevers en trajecten die het oxiderende metabolisme reguleren en het vinden van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hartfalen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Meting van de hartslag in de Muis door invasieve M-mode echocardiografie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Een Neonatale Mouse Spinal Cord Injury Compressie Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Autonome functie na hersenschudding in jeugd atleten: een verkenning van de hartfrequentie-variabiliteit met behulp van 24-uurs opname methodologie

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...