Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Nous tenons à remercier tous les membres de laboratoire de Murphy et laboratoire de Ross. Ce travail est soutenu par les American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) et VA du mérite (BX003260) à R.S.R.

Pour travail avec souris néonatales, veuillez vous référer à l’ensemble de lignes directrices locales / l’Institut de l’Université de suite par les programmes de soins aux animaux et adhérer à son établissement ou des règlements appropriés. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par l’UC San Diego institutionnels et animalier utilisation Comité (IACUC) et se conformer aux règlements fédéraux et d’état.
1. préparation des réactifs...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

Dans cette étude, nous avons établi un protocole simple pour isoler et à cultiver des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris. En utilisant ces cardiomyocytes, nous avons également optimisé les conditions pour mesurer le taux de consommation d’oxygène à l’aide d’un système d’analyseur de flux extracellulaire. Le protocole permet d’utiliser des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris comme système modèle pour examiner la façon dont les différents facteurs peuvent modifier la consommation ...

Pour maintenir une fonction contractile cardiaque continue, cardiomyocytes doit maintenir un apport constant d’énergie cellulaire principalement sous la forme d’ATP1. Dans le coeur, environ 95 % de l’ATP est généré par les mitochondries, principalement par le biais de la phosphorylation oxydative, montrant que les mitochondries jouent un rôle de bioénergétique crucial dans la fonction cardiaque2,3. Soutenant cette notion est que le dérèglement de la fonction mitochondriale peut conduire à une cardiomyopathie et une insuffisance cardiaque4,5. À l’inverse, restaurer la fonction mitochondriale a été établi afin d’améliorer la fonction cardiaque de la défaillance cardiaque6,7. Par conséquent, étudier le mécanisme de bioénergétique mitochondriale et identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale dans les cardiomyocytes ne révéleront pas seulement les perspicacités mécanistes de la production énergétique cardiaque mais également pourraient fournir un aperçu qui mèneront au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies cardiaques,6,8.
Par rapport au coeur entier, qui contient un mélange de myocytes et non-myocytes9, cultures cardiomyocyte sont extrêmement pure, avec une contamination minimale des non-myocytes du cœur, comme les fibroblastes et les cellules endothéliales10. En outre, isolant les cardiomyocytes des chiots nouveau-nés permet de cultiver un grand nombre de cellules dans un peu de temps, par rapport à l’isolement de cellules coeurs adultes10,11. Plus important encore, cardiomyocytes adultes cultivés primaires de souris ont la survie à court temps (p. ex. 24 h) et en des temps plus longs points de différencient. La souris néonatales cardiomyocytes peut survivre et être manipulés pendant plus de 7 jours de culture, ce qui les rend idéaux pour tester les effets des médicaments composés et des manipulations génétiques sur la fonction des mitochondries dans les cardiomyocytes10. Bien sûr, il y a des différences biologiques importantes entre les cellules adultes et néonatales, mais la durée plus longue disponible pour la culture de cellules néonatales qui les rend appropriés pour différents types d’études, y compris ceux de la fonction mitochondriale.
A ce jour, primaire néonatale souris et rat cardiomyocytes cultivés ont servi comme modèles d’études cardiaques bioénergétique12,13. Ces dernières années, des études a utilisé un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) et évaluer la capacité oxydative dans souris et rat néonatal cardiomyocytes14,15. Alors que comparativement à des rats, la viabilité des cellules de souris néonatales cardiomyocytes est plus faible et a une plus grande variabilité16. Aussi, la possibilité d’étudier des cellules à partir des modèles de souris génétiquement modifiées rend le modèle de cellule de souris très important. Étant donné que les études de l’OCR sont tellement sensibles à la cellule le nombre et la densité de semis, élaboration d’un protocole simple, fiable et reproductible pour atteindre la viabilité et le rendement cellulaire compatible est nécessaire.
Nous rapportons ici un protocole optimisé qui a été développé qui utilise des cardiomyocytes néonatals cultivés de souris avec un analyseur de flux extracellulaire 96-puits-format pour l’analyse de l’OCR. Ce protocole augmente considérablement la reproductibilité du dosage. En outre, le protocole non seulement fournit un procédé nouveau et reproductible pour l’analyse de l’OCR, mais également pourrait être adapté à une culture de taille plus grande et à d’autres fins expérimentales, telles que celle qui peut être nécessaire d’étudier les fonctions myofibrillaires et intracellulaire voies de signalisation.
En particulier, ce protocole décrit une procédure d’une journée pour l’isolement et culture des cardiomyocytes de souris néonatales dans une plaque de culture de cellules de 96 puits. En outre, il décrit la procédure pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Toutes les solutions utilisées sont stériles ou filtré stérile. Tous les outils sont stérilisés à 75 % d’éthanol. Nous fournissons une Table des matières pour les différentes parties de la procédure. Pour la culture des cardiomyocytes, toutes les procédures et les mesures sont effectuées dans une hotte de culture cellulaire standard. Ce protocole est développé pour l’isolement des coeurs de souris néonatales d’une portée (environ 8-10 chiots). Toutefois, le protocole peut être également adapté pour isoler les cardiomyocytes provenant de plusieurs portées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitochondries et métabolisme oxydatif sont essentiels pour maintenir la fonction du muscle cardiaque. Les recherches démontrent que le dysfonctionnement mitochondrial est un facteur important contribuant à la fonction cardiaque altérée trouvé dans l’insuffisance cardiaque. En revanche, restaurer la fonction mitochondriale défectueuse peut-être avoir des effets bénéfiques pour améliorer la fonction cardiaque au cœur défaillant. Par conséquent, étudier les mécanismes de régulation et d’identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale pourraient fournir insight qui pourrait servir à développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiaques. Ici, la respiration mitochondriale de myocytes cardiaques est analysée à l’aide d’un système de culture cellulaire unique. Tout d’abord, un protocole a été optimisé pour isoler rapidement et culture viabilité haute souris néonatales cardiomyocytes. Ensuite, un analyseur de flux extracellulaire format 96 puits sert à évaluer le taux de consommation d’oxygène de ces cardiomyocytes. Pour ce protocole, nous avons optimisé seeding conditions et démontré que taux de consommation de l’oxygène de cardiomyocytes souris néonatales peut être facilement évalué dans un analyseur de flux extracellulaire. Enfin, nous constatons que notre protocole peut être appliqué à une plus grande taille de culture et d’autres études, telles que la signalisation intracellulaire et contractiles fonctionnent analyse.

En utilisant le protocole décrit, les coeurs ont été isolées de chiots nouveau-nés jour 0. 5 x 105 cellules/pup ont été obtenues, et les cardiomyocytes ont été injectées à des densités de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 cellules/puits, en plaques bien 96 (Figure 2 a). Après une culture, les cardiomyocytes trouvées bien attaché à la surface recouverte de plastique et il y avait très peu de cellules seu...

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Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analyse des taux de consommation d’oxygène dans les Cardiomyocytes néonatals cultivés primaires de souris à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire

Le but du présent protocole est d’illustrer l’utilisation de souris néonatales cardiomyocytes comme système modèle pour examiner comment divers facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène au coeur.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Ce protocole nous permet d’isoler et de culture le bi-BBT élevé, connu seulement aux cardiomyocytes de souris. Pour évaluer la fonction mitochondriale, le taux de consommation d’oxygène des cardiomyocytes peut être analysé par un analyseur réel de flux d’argent. Un des avantages de cette technique est que la consommation d’oxygène des cardiomyocytes peut être facilement mesurée dans leur état d’adhérent en format 96-puits, ce qui permet de tester de multiples conditions avec un grand nombre de répliques.Ce navire fournit un aperçu important du domaine de recherche en cardiologie. En plus de la consommation d’oxygène, nous pouvons également étudier d’autres paramètres métaboliques, tels que les grisgrices et l’epoxidation peracid. La réalisation d’une grande variabilité des cardiomyocytes est essentielle pour cette expérience.Cela nécessite une digestion efficace des cœurs. Puisque les cardiomyocytes néonatals sont très fragiles, la manipulation douce des cardiomyocytes est également importante. Dans le capot de culture cellulaire, aliquot 5ml de HBSS à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits et le placer sur la glace.En outre, aliquot 10ml de HBSS à un plat de culture cellulaire de 10cm, puis, préparer 20 ml de trypsine solution de prédigestion dans un tube conique stérile de 50ml. Gardez toutes les solutions sur la glace. Ensuite, extraire le cœur et le transférer immédiatement dans le plat stérile de culture cellulaire contenant HBSS.Enlevez tout tissu pulmonaire résiduel et les vaisseaux plus gros. Lavez le cœur dans HBSS à l’aide d’agitation douce. Par la suite, couper le cœur avec des ciseaux fins en 8 morceaux et transférer le tissu cardiaque avec des forceps dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits avec HBSS.À l’aide d’une cuillère moria, laver le tissu cardiaque en le transférant du puits au puits dans la plaque de 6 puits remplie de HBSS. Ensuite, transférez le tissu cardiaque dans un tube conique contenant 20ml de trypsine et couvez avec une agitation douce à 4 degrés Celsius pendant 4 heures. Dans cette procédure, préchamez la solution de digestion de collagène dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.Transférer le tube conique contenant du tissu cardiaque et la solution de prédigestion de 4 degrés Celsius à une hotte de culture cellulaire. Laissez couler le tissu cardiaque au fond du tube et retirez la solution de prédigestion à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Ensuite, ajouter 10ml de HBSS dans le tube.Resuspendez le tissu cardiaque avec HBSS 2 à 3 fois pour laver trypsine à l’aide d’une pipette sérologique de 10ml. Aspirez HBSS et ajoutez 10ml de solution préchaurée de digestion de collagène dans le tube avec le tissu cardiaque. Pour la première digestion, incuber le tube avec du tissu cardiaque dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes sans agitation.Ensuite, transférez le tube sur le capot de culture cellulaire. Triturer le tissu en le réutilisant doucement 10 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Cela permettra au cœur de se disperser et aux cellules d’être libérées du tissu cardiaque.Laissez couler le tissu non digéré. Transférer la solution digérée enrichie en cardiomyocytes dans un nouveau tube conique et ajouter immédiatement une quantité égale de milieu de culture cellulaire pour arrêter la digestion collagène. Ajoutez ensuite 10ml de solution de digestion de collagène dans le tube contenant le reste du tissu cardiaque non digéré.Pour la deuxième digestion, incuber le tube avec du tissu cardiaque dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Répétez les procédures de la première digestion et transférez la solution digérée enrichie en cardiomyocytes dans un nouveau tube conique avant d’arrêter la digestion des collagènes. Ensuite, placez une passoire cellulaire stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml.Pré-mouiller la passoire cellulaire avec 2 à 3 ml de milieu de culture cellulaire et passer les cellules à travers la passoire cellulaire. Par la suite, rincer la passoire cellulaire avec le milieu de culture cellulaire. Puis, centrifugeuse le tube conique contenant des cardiomyocytes pendant 5 minutes à 180 fois la gravité.Après 5 minutes, aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire dans 10ml de milieu de culture cellulaire. Plaquez les cellules sur un plat de culture cellulaire de 10 cm et incubez-les pendant une heure. Ensuite, agitez doucement la plaque.Lavez les cellules non adhérentes et résuspendez les cellules en pipetant à plusieurs reprises le milieu de culture cellulaire sur le plat à l’aide d’une pipette sérologique de 10ml. Ensuite, transférez les cellules non adhérentes dans un nouveau plat de culture cellulaire de 10 cm et incubez-les pendant une autre heure. Après une heure, agiter doucement la plaque et laver les cellules non adhérentes.Transférer les cardiomyocytes dans un nouveau tube conique de 50ml. Ensuite, préparez une plaque de culture de 96 puits en incitant 50 microlitres de solution de revêtement dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits. Si des bulles sont présentes, retirez-les à l’aide d’une pipette de 20 microlitres.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure pour permettre le séchage du revêtement matricielle. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Plaquez les cellules dans la matrice extracellulaire enduite de plaque de culture cellulaire de 96 puits à une densité comprise entre 10 et 30 mille cellules par puits.Et placez les cellules dans l’incubater. Pour préformer l’analyse de consommation d’oxygène, hydratez une cartouche de capteur d’analyseur de flux pendant au moins 3 heures, ajoutez 200 microlitres de solution calibrée dans chaque puits de la plaque d’utilité. Remettre la cartouche du capteur sur la plaque d’utilité et incuber à 37 degrés Celsius sans supplément de CO2 ou d’O2 pendant au moins 3 heures.Une heure avant l’essai, retirez doucement le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec 200 microlitres de milieu de test de stress mitochondrial préchauré deux fois. Après le deuxième lavage, ajouter 175 microlitres de milieu de test de stress mitochondrial préchauré. Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone ou supplémentation en oxygène.Préparer 3ml de chacun des composés d’essai dans le milieu de test de stress mitochondrial. Chargez 25 microlitres de chaque composé dans les ports d’injection de la cartouche de capteur à l’aide d’une pipette multicanal. L’état des cellules et les prétraitements peuvent affecter la restauration maximale obtenue par injection de FCCP découpler.La sensibilité cellulaire au découpler peut également changer, par conséquent, il est essentiel d’optimiser la concentration de travail de FCCP pour chaque traitement particulier. Par la suite, configurez le protocole d’analyse de flux extracellulaire et démarrez le programme. Tout d’abord, mettre le capteur cartiridge dans la machine pour étalonnage.Remplacez le calibreur pour la plaque d’essai une fois que l’étape d’étalonnage est faite. Si désiré, après l’essai, jetez soigneusement tous les médiums d’analyse à l’aide d’une pipette multicanal. Et stocker la culture cellulaire mircoplate à négatif 20 degrés Celsius pour la normalisation cellulaire future en utilisant l’analyse des protéines.En utilisant le protocole décrit, les coeurs ont été isolés du jour 0 les chiots et les cardiomyocytes néonatals ont été ensemencés à des densités de 10, 20 ou 30 mille cellules par puits dans les plaques de 96 puits. Après la culture du jour au lendemain, les cardiomyocytes ont été trouvés bien attachés à la surface en plastique enduit et il y avait très peu de cellules non attachées. À ce stade, les cardiomyocytes spontanément contractants étaient facilement visibles.Une densité d’ensemencement de 30 000 cellules par puits a montré une confluence un jour après l’ensemencement à mesure que les cellules se propageaient. Des cardiomyocytes ont été immunotachés avec un anticorps contre l’actinine d’alpha sarcomeric, un marqueur spécifique de cardiomyocyte. Comme indiqué ici, la plupart des cellules ont montré la coloration positive de l’actinine alpha indiquant la pureté élevée de l’isolement cardiomyocyte.Un schéma d’un test de stress mitochondrial typique est montré ici. Le test de stress mitochondrial commence par une mesure de base du taux de consommation d’oxygène, ceci est suivi par l’injection de myosine d’Oligo qui inhibe atpa. Puis, l’agent de découplage FCCP a été injecté pour mesurer le taux maximum de consommation d’oxygène.Enfin, avec l’injection de deux inhibiteurs complexes de transport d’électrons, la respiration mitochondriale s’arrête complètement et ocr diminue à son niveau le plus bas. Pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Il est essentiel d’atteindre une survie élevée.Par conséquent, il est important d’utiliser des nouveau-nés nouveau-nés et des tissus cardiaques manipulés en douceur dans les cardiomyocytes. En utilisant des lignes de souris manipulées génétiquement nouvelles ou existantes, cette méthode peut être facilement traduite en données qui peuvent conduire à la compréhension de nouveaux mécanismes de régulation bioénergétique dans le cœur. Les mitochondriaux jouent un rôle clé dans la fonction cardiaque.Nous nous attendons à ce que cette méthode aide à identifier de nouveaux régulateurs et voies régulant le métabolisme oxydant et trouvant de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’insuffisance cardiaque.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d&#39;oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l&#39;hépatite aiguë

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Recherche

Médecine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero mesure de la fréquence cardiaque chez la souris par M mode non invasive échocardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que<em&gt; In Vitro</em&gt; Outil de dépistage dans la recherche auditive

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

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Fonction autonome suite à une commotion cérébrale chez les jeunes athlètes : une Exploration de la variabilité de fréquence cardiaque à l’aide de la méthode d’enregistrement de 24 heures

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Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Enquête bio-énergétique en temps réel à l’aide de Candida albicans analyse extracellulaire de Flux

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In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...