Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Wir möchten alle Ross Lab und Murphy Lab Mitgliedern danken. Diese Arbeit wird unterstützt durch die American Heart Association (14SDG17790005), Y.C NIH (HL115933, HL127806) und VA Verdienst (BX003260), R.S.R.

Für die Arbeit mit Neugeborenen Mäusen Bitte verweisen auf lokale Hochschulinstitut Leitlinien Satz her durch die Pflege der Tiere-Programme und die institutionellen und anderen einschlägigen Bestimmungen einhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von der UC San Diego institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften einhalten.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>25 mL Pre Aufschlusslösung</...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, wa...

Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP1pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Funktion der Mitochondrien hat gezeigt, dass das Versagen der Herzfunktion verbessern Herz-6,7. Daher konnte studieren des Mechanismus der mitochondrialen Bioenergetik und Identifizierung neuartige Regulatoren der mitochondrialen Funktion in Kardiomyozyten verraten nicht nur mechanistische Einblicke der kardialen Energieerzeugung aber auch Einblick, der führt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von Herz-Kreislauferkrankungen6,8.
Im Vergleich zu das ganze Herz, die enthält einer Mischungaus von Myozyten und nicht Myozyten9, Cardiomyocyte Kulturen sind hochrein, mit minimalen Kontamination von nicht-Myozyten aus dem Herzen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen10. Darüber hinaus ermöglicht isolieren Herzzellen von neugeborenen Welpen züchten eine große Anzahl von Zellen in einer kleinen Menge der Zeit, im Vergleich zu isolierenden Zellen von Erwachsenen Herzen10,11. Vor allem primäre kultivierten erwachsenen Maus Herzzellen haben kurze überleben Zeiten (z.B. 24 h) und auf längere Zeit de-Punkte unterscheiden. Neugeborenen Maus Herzzellen können überleben und für mehr als 7 Tage in der Kultur, wodurch sie ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Wirkstoffe und Genmanipulation auf die Funktion der Mitochondrien in Kardiomyozyten10manipuliert werden. Natürlich gibt es biologische Unterschiede zwischen den Erwachsenen und Neugeborenen Zellen, aber die längere Dauer, die für Kultur neonatale Zellen macht sie geeignet für viele verschiedene Arten von Studien, einschließlich der Funktion der Mitochondrien.
Bisher wurden primäre kultivierte Neugeborene Maus und Ratte Kardiomyozyten als Modelle zur kardialen Bioenergetik12,13zu studieren. In den letzten Jahren verwendet Studien einen extrazelluläre Flux-Analysator Sauerstoff-Verbrauch (OCR) messen und auswerten oxidative Kapazität bei Maus und Ratte neonatale Kardiomyozyten14,15. Während mit Ratten verglichen, die Zellviabilität des Neugeborenen Maus Herzzellen ist niedriger und hat größere Variabilität16. Außerdem macht die Fähigkeit, Zellen aus gentechnisch veränderter Mausmodelle im Mausmodell Zelle sehr wichtig. Da die OCR-Studien so empfindlich auf Zell-Zahl und Dichte Aussaat sind, braucht man Entwicklung eines reproduzierbaren, zuverlässig und einfach Protokolls, konsequente Zellausbeute und Rentabilität zu erzielen.
Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das entwickelt worden ist die kultivierte Maus neonatale Herzzellen zusammen mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flux-Analysator für OCR-Analyse verwendet. Dieses Protokoll wird die Reproduzierbarkeit des Assays stark erhöht. Darüber hinaus das Protokoll nicht nur bietet eine neuartige und reproduzierbare Methode für OCR-Analyse, sondern könnte auch zu einer größeren Größe Kultur für andere experimentelle Zwecke, wie die möglicherweise notwendigen myofibrillären Funktionen zu studieren und intrazellulären angepasst werden Signalwege.
Dieses Protokoll beschreibt insbesondere eine eintägige Verfahren zur Isolierung und Kultur des Neugeborenen Maus Herzzellen in eine 96-Well Zellplatte Kultur. Darüber hinaus beschreibt es die Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Alle Lösungen sind steril oder steril filtriert. Alle Werkzeuge werden mit 75 % igem Ethanol sterilisiert. Wir bieten eine Tabelle von Materialien für verschiedene Teile des Verfahrens. Für die Kultivierung von Kardiomyozyten, erfolgen alle Abläufe und Schritte in eine Standardzelle Kultur Kapuze. Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Neugeborenen Mäuseherzen aus einem Wurf (ca. 8-10 Welpen) entwickelt. Das Protokoll kann jedoch auch zur Isolierung von Herzzellen aus mehreren Würfen angepasst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.

Mithilfe des Protokolls beschrieben, waren die Herzen von Tag 0 neugeborenen Welpen isoliert. 5 x 105 Zellen/Pup stammen, und Herzmuskelzellen bei dichten von 10 x 103, 20 x 103oder 30 x 103 Zellen/Brunnen, in 96-well-Platten (Abbildung 2A) ausgesät wurden. Nach Übernachtung Kultur fanden sich Kardiomyozyten Kunststoff beschichteten Oberfläche gut an und es gab sehr wenige ungebundene Zellen (ungebunden Zellen we...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, hohe Bi-BBT zu isolieren und zu kulturieren, die nur Maus-Kardiomyozyten bekannt sind. Um die mitochondriale Funktion zu bewerten, kann die Sauerstoffverbrauchsrate von Kardiomyozyten mit einem tatsächlichen Silberflussanalysator analysiert werden. Einer der Vorteile dieser Technik ist, dass der Sauerstoffverbrauch von Kardiomyozyten leicht in ihrem Haftenzustand im 96-Well-Format gemessen werden kann, was das Testen mehrerer Bedingungen mit einer großen Anzahl von Replikationen ermöglicht.Dieses Schiff bietet wichtige Einblicke in den Forschungsbereich der Kardiologie. Neben dem Sauerstoffverbrauch können wir auch andere metabolische Parameter wie Graugrizen und Peracid-Epoxidation untersuchen. Die Erreichung einer hohen Variabilität von Kardiomyozyten ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung.Dies erfordert eine effiziente Verdauung der Herzen. Da neonatale Kardiomyozyten sehr zerbrechlich sind, ist auch der schonende Umgang mit Kardiomyozyten wichtig. In der Zellkulturhaube, aliquot 5ml von HBSS zu jedem Brunnen einer 6-Well-Zell-Kulturplatte und legen Sie es auf Eis.Darüber hinaus aliquot 10ml HBSS zu einer 10cm Zellkulturschale, dann bereiten 20 ml Trypsin Predigestion Lösung in einem 50ml sterilen konischen Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Als nächstes extrahieren Sie das Herz und übertragen Sie es sofort auf die sterile Zellkulturschale, die HBSS enthält.Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe und größere Gefäße. Waschen Sie das Herz in HBSS mit sanfter Rührung. Anschließend das Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke schneiden und das Herzgewebe mit Zangen in einen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte mit HBSS übertragen.Mit einem Moria-Löffel, waschen Sie das Herzgewebe, indem Sie es von gut zu gut in der 6-Well-Platte mit HBSS gefüllt übertragen. Dann das Herzgewebe in eine konische Röhre mit 20ml Trypsin übertragen und mit sanfter Rührung bei 4 Grad Celsius für 4 Stunden brüten. Bei diesem Verfahren die Kollagenase-Verdauungslösung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorwärmen.Übertragen Sie die konische Röhre mit Herzgewebe und Präkondonsionslösung von 4 Grad Celsius auf eine Zellkulturhaube. Lassen Sie das Herzgewebe auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Prädigestionslösung mit einer 10ml serologischen Pipette. Als nächstes fügen Sie 10ml HBSS in die Tube.Setzen Sie das Herzgewebe mit HBSS 2 bis 3 Mal aus, um Trypsin mit einer 10ml serologischen Pipette auszuwaschen. ASpirieren Sie HBSS und fügen Sie 10ml vorgewärmte Kollagennase-Verdauungslösung in die Röhre mit Herzgewebe. Für die erste Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten ohne Rührung.Anschließend übertragen Sie die Röhre auf die Zellkulturhaube. Trituieren Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer 10ml serologischen Pipette 10ml sanft wieder aufhängen. Dies wird es dem Herzen ermöglichen, sich zu zerstreuen und die Zellen aus dem Herzgewebe zu lösen.Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken. Übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre und fügen Sie sofort eine gleiche Menge an Zellkulturmedium hinzu, um die Kollagenaseverdauung zu stoppen. Dann fügen Sie 10ml Kollagenase Verdauungslösung in die Röhre mit dem verbleibenden unverdautem Herzgewebe.Für die zweite Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Verfahren der ersten Verdauung und übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre, bevor Sie die Kollagenaseverdauung stoppen. Als nächstes legen Sie ein steriles Zellsieb in eine neue sterile 50ml konische Röhre.Das Zellsieb mit 2 bis 3 ml Zellkulturmedium vorbefeuchten und die Zellen durch das Zellsieb leiten. Anschließend spülen Sie das Zellsieb mit Zellkulturmedium. Zentrifugieren Sie dann das konische Rohr, das Kardiomyozyten enthält, für 5 Minuten bei 180-facher Schwerkraft.Nach 5 Minuten den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 10ml Zellkulturmedium wieder aufsetzen. Die Zellen auf eine 10cm Zellkulturschale aufstellen und eine Stunde lang bebrüten. Danach rühren Sie die Platte sanft auf.Die nicht haftenden Zellen abwaschen und die Zellen wieder aufhängen, indem sie das Zellkulturmedium mit einer 10ml serologischen Pipette wiederholt über die Schale pfeifen. Dann übertragen Sie die nicht haftenden Zellen in eine neue 10cm Zellkulturschale und inkubieren Sie sie für eine weitere Stunde. Nach einer Stunde die Platte sanft aufrühren und die nicht haftenden Zellen abwaschen.Übertragen Sie die Kardiomyozyten in eine neue 50ml konische Röhre. Als nächstes bereiten Sie eine 96-Well-Kulturplatte vor, indem Sie 50 Mikroliter Beschichtungslösung in jedem Brunnen der 96-Well-Zellkulturplatte aliquotieren. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, um das Trocknen der Matrixbeschichtung zu ermöglichen. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen in die extrazelluläre Matrix beschichtet 96-Well-Zellkulturplatte mit einer Dichte zwischen 10 bis 30 Tausend Zellen pro Brunnen.Und legen Sie die Zellen in den Inkubater. Um den Sauerstoffverbrauch assay vorzuformen, hydratisieren Sie eine Flussanalysator-Sensorpatrone für mindestens 3 Stunden, fügen Sie 200 Mikroliter Kalibrant-Lösung in jeden Brunnen der Versorgungsplatte. Legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Nutzplatte und brüten Sie in 37 Grad Celsius ohne CO2- oder O2-Supplementierung für mindestens 3 Stunden.Eine Stunde vor dem Test, entfernen Sie vorsichtig die Zellkultur Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikroliter von vorgewärmten mitochondrialen Stresstest Medium zweimal. Nach der zweiten Wäsche 175 Mikroliter vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmedium hinzufügen. Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid oder Sauerstoff-Supplementierung.Bereiten Sie 3ml jeder der Testverbindungen in mitochondrialen Stresstestmedium. Laden Sie 25 Mikroliter jeder Verbindung mit einer Mehrkanalpipette in die Injektoranschlüsse der Sensorpatrone. Zustand der Zellen und alle Vorbehandlungen können die maximale Restauration durch Injektion von Entkoppler FCCP entsteht beeinflussen.Die Zellempfindlichkeit gegenüber dem Entkoppler kann sich ebenfalls ändern, daher ist es wichtig, die Arbeitskonzentration von FCCP für jede einzelne Behandlung zu optimieren. Anschließend richten Sie das extrazelluläre Fluss-Assay-Protokoll ein und starten Sie das Programm. Legen Sie zunächst den Sensorknortrat zur Kalibrierung in die Maschine.Ersetzen Sie das Kalibrant für die Assayplatte, sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Falls gewünscht, nach dem Test, sorgfältig alle Assay-Medium mit einer Mehrkanal-Pipette zu entsorgen. Und speichern Sie die Zellkultur Mircoplate bei negativen 20 Grad Celsius für die zukünftige Zellnormalisierung mit Protein-Assay.Durch die Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden Die Herzen vom Tag 0 neonatale Welpen isoliert und Kardiomyozyten wurden bei Dichten von 10, 20 oder 30 Tausend Zellen pro Brunnen in 96-Well-Platten ausgesät. Nach der Nachtkultur wurden Kardiomyozyten gefunden, die gut an der beschichteten Kunststoffoberfläche befestigt waren, und es gab nur sehr wenige ungebundene Zellen. Zu diesem Zeitpunkt waren spontan kontranomyozyten leicht sichtbar.Eine Saatdichte von 30.000 Zellen pro Brunnen zeigte einen Tag nach der Aussaat einen Zusammenfluss, während sich die Zellen ausbreiteten. Kardiomyozyten wurden mit einem Antikörper gegen sarcomeric alpha actinin, einem Kardiomyozyten-spezifischen Marker, immungefärbt. Wie hier gezeigt, zeigten die meisten Zellen eine positive Färbung von Alpha-Actinin, was auf die hohe Reinheit der Kardiomyozytenisolation hindeutet.Hier wird ein Schema eines typischen mitochondrialen Stresstests gezeigt. Der mitochondriale Stresstest beginnt mit einer Basislinienmessung der Sauerstoffverbrauchsrate, gefolgt von der Injektion von Oligo-Myosin, die ATPas hemmt. Anschließend wurde das Entkopplungsmittel FCCP injiziert, um den maximalen Sauerstoffverbrauch zu messen.Schließlich stoppt mit der Injektion von zwei Elektronentransport-Komplex-Inhibitoren die mitochondriale Atmung vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand. Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Es ist entscheidend, eine hohe Überlebensfähigkeit zu erreichen.Daher ist es wichtig, neugeborene Neugeborene Neugeborene und sanft behandeltherzes Gewebe in Kardiomyozyten zu verwenden. Durch die Verwendung neuer oder vorhandener genetisch manipulierter Mauslinien kann diese Methode leicht in Daten übersetzt werden, die zum Verständnis neuer Mechanismen für die bioenergetische Regulierung im Herzen führen können. Mitochondrial spielen Schlüsselrollen in der Herzfunktion.Wir erwarten, dass diese Methode dazu beiträgt, neue Regulatoren und Wege zu identifizieren, die den oxidierenden Stoffwechsel regulieren und neue therapeutische Ziele für die Behandlung von Herzinsuffizienz finden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Forschung

Medizin

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Autonome Funktion nach Gehirnerschütterung bei Jugendlichen Sportlern: eine Erforschung der Herzfrequenz-Variabilität mit 24-Stunden-Aufnahme Methodik

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-Energetik-Untersuchung von Candida Albicans mittels Real-Time extrazelluläre Flux Analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...