Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

ברצוננו להודות כל מעבדה רוס ואנשי המעבדה מרפי. עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקאי (14SDG17790005) NIH ווי. סי (HL115933, HL127806), VA ערך (BX003260) R.S.R.

לעבודה עם עכברים neonatal, נא להפנות קבע הנחיות האוניברסיטה המקומית/מכון הלאה על-ידי תוכניות טיפול בבעלי חיים, לדבוק מוסדיים ואחרים רגולציות אחד. כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי UC סן דייגו אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC), לדבוק הפדרלי ואת המדינה.
1. הכנת נוגדנים<...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

במחקר זה, הקמנו פרוטוקול פשוט עבור בידוד ו culturing cardiomyocytes neonatal העכבר. באמצעות cardiomyocytes האלה, אנחנו גם אופטימיזציה התנאים כדי למדוד את קצב צריכת החמצן באמצעות מערכת מנתח השטף חוץ-תאית. הפרוטוקול מאפשר להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן בתאים העבו?...

כדי לקיים את הפונקציה כויץ לב רציפה, cardiomyocytes חייב לשמור על אספקה קבועה של האנרגיה התאית בעיקר בצורת ATP1. בלב, כ- 95% של ATP נוצר על ידי המיטוכונדריה, בעיקר באמצעות זרחון חמצוני, מראה כי המיטוכונדריה תפקיד מכריע bioenergetic תפקוד הלב2,3. תמיכה מושג זה זה dysregulation של הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להוביל4,של שריר הלב, אי ספיקת לב-5. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי הוכח לשפר את תפקוד הלב של הכשל של הלב6,7. לכן, לומד את המנגנון של ביואנרגיה מיטוכונדריאלי וזיהוי הרגולטורים הרומן של פונקציית מיטוכונדריאלי cardiomyocytes יהיה לא רק לחשוף תובנות מכניסטית הפקת האנרגיה הלב אך גם יכולה לספק תובנות אשר תוביל להתפתחות של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות לב6,8.
בהשוואה ל לב שלם, אשר מכיל תערובת של השריר ואת הלא נייטרלים9, cardiomyocyte תרבויות הם מאוד טהור, עם זיהום מזערי של הלא-נייטרלים מהלב, כגון fibroblasts, תאי אנדותל10. בנוסף, בידוד cardiomyocytes מן הגורים neonatal מאפשר culturing מספר גדול של תאים בכמות קטנה של זמן, לעומת תאי בידוד מ לבבות למבוגרים10,11. והכי חשוב, cardiomyocytes העכבר למבוגרים בתרבית הראשי יש הישרדות קצר פעמים (למשל 24 שעות), זמן ארוך יותר נקודות de-להבדיל. העכבר neonatal cardiomyocytes יכול לשרוד, להיות מניפולציה על למעלה מ- 7 ימים בתרבות, הופכות אותה לאידיאלית עבור בחינת השפעת סמים תרכובות ומניפולציה הגן על הפונקציה של המיטוכונדריה cardiomyocytes10. כמובן, ישנם הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין התאים למבוגרים ו- neonatal, אך משך הזמן הארוך זמינים עבור התרבות של תאים neonatal גורם להם המתאים עבור סוגים שונים של מחקרים, כולל אלה של הפונקציה מיטוכונדריאלי.
עד כה, ראשי בתרבית neonatal עכבר ועכברוש, cardiomyocytes שימשו כמודלים ללימודי ביואנרגיה לב12,13. בשנים האחרונות, מחקרים משמש מנתח השטף חוץ-תאית למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ולהעריך קיבולת חמצוני עכבר ועכברוש, neonatal cardiomyocytes14,15. בעוד בהשוואה חולדות, הכדאיות תא של העכבר cardiomyocytes neonatal נמוכה ויש לו השתנות גדולה יותר16. היכולת ללמוד תאים מהונדסים גנטית עכבר מודלים מאפשר גם המודל תא העכבר חשוב מאוד. בהתחשב בכך OCR מחקרים הם כל כך רגיש לתא זריעה צפיפות ומספר, נדרש פיתוח פרוטוקול לשחזור אמין, פשוט כדי להשיג תשואה תא עקבי הכדאיות.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימיזציה אשר פותחה העושה שימוש בעכבר בתרבית cardiomyocytes neonatal יחד עם מאבחן 96-ובכן-עיצוב חוץ-תאית השטף לניתוח OCR. פרוטוקול זה מגדיל מאוד הפארמצבטית של וזמינותו. בנוסף, הפרוטוקול מספקת הרומן שיטה לשחזור לניתוח OCR אלא גם יכול להיות מותאם תרבות גודל גדול יותר למטרות ניסוי אחרים, כגון זו אשר עשוי להיות נחוץ ללמוד פונקציות myofibrillar, תאיים איתות המסלולים.
בפרט, פרוטוקול זה מתאר שגרה יום אחד עבור בידוד והתרבות של העכבר neonatal cardiomyocytes בצלחת תרבות תא 96-ובכן. בנוסף, הוא מתאר את ההליך כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית. כל הפתרונות בשימוש סטרילי או סינון סטרילי. כל הכלים סטריליים על ידי 75% אתנול. אנו מספקים את הטבלה של חומרים עבור חלקים שונים של ההליך. עבור culturing cardiomyocytes, כל ההליכים והשלבים מבוצעים בשכונה תרבות תא סטנדרטי. פרוטוקול זה מפותח עבור בידודו של העכבר neonatal לבבות של המלטה אחת (כ 8-10 הגורים). עם זאת, הפרוטוקול ניתן להתאים גם לבידוד cardiomyocytes של המלטות מרובות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

המיטוכונדריה, מטבוליזם חמצוני הם קריטיים לשמירה על תפקוד שריר הלב. מחקרים הראו שכי תפקוד מיטוכונדריאלי הוא גורם חשוב לתפקוד הלב לקוי נמצא באי ספיקת לב. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי פגומים ייתכן השפעות מועילות לשיפור תפקוד הלב אצל הלב נכשל. לכן, לומד את מנגנוני הרגולציה וזיהוי הרגולטורים הרומן לתפקוד מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה שניתן להשתמש בהם כדי לפתח מטרות טיפוליות חדשות לטיפול מחלת לב. כאן, myocyte לב נשימה מיטוכונדריאלי ניתוח באמצעות מערכת התרבות תאים ייחודיות. ראשית, פרוטוקול מוטבה כדי לבודד במהירות, תרבות גבוהה הכדאיות העכבר neonatal cardiomyocytes. לאחר מכן, מנתח 96-ובכן עיצוב השטף חוץ-תאית משמש כדי להעריך את קצב צריכת החמצן של אלה cardiomyocytes. עבור פרוטוקול זה, אנו ממוטב זריעה תנאים, הפגינו שקצב צריכת החמצן הזה העכבר neonatal cardiomyocytes יכול להידרש בקלות מנתח השטף חוץ-תאית. ולבסוף, נציין כי הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לגודל תרבות גדול יותר, מחקרים אחרים, כגון העברת אותות תאיים ו כויץ לתפקד ניתוח.

באמצעות פרוטוקול המתואר, לבבות הם בודדו אותנו מהמתרחש הגורים neonatal יום 0. 5 x 105 תאים/גור התקבלו, cardiomyocytes היו נזרע על צפיפות של 10 x 103, 20 x 103או 30 x 103 תאים/טוב, ב- 96 טוב צלחות (איור 2 א). לאחר לילה תרבות, נמצאו cardiomyocytes מחובר היטב אל פני השטח פלסט...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

קצב צריכת החמצן וניתוח Cardiomyocytes Neonatal העכבר בתרבית הראשי באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית

המטרה של פרוטוקול זה נועד להמחיש כיצד להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן של הלב.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לבודד ולתרבת דו-BBT גבוה, הידוע רק לקרדיומיוציטים של עכברים. כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה, ניתן לנתח את קצב צריכת החמצן של קרדיומיוציטים על ידי מנתח שטף כסף בפועל. אחד היתרונות של טכניקה זו היא כי צריכת חמצן של cardiomyocytes ניתן למדוד בקלות במצבם חסידי בפורמט 96-well, אשר מאפשר בדיקות של תנאים מרובים עם מספר רב של שכפולים.כלי זה מספק תובנות חשובות על תחום המחקר של קרדיולוגיה. בנוסף לצריכת חמצן, אנו יכולים גם ללמוד פרמטרים מטבוליים אחרים, כגון greygrices ו אפוקסידציה peracid. השגת שונות גבוהה של קרדיומיוציטים היא קריטית לניסוי זה.זה דורש עיכול יעיל של לבבות. מאז קרדיומיוציטים ניאו-נטאל הם שבירים מאוד, טיפול עדין של קרדיומיוציטים חשוב גם. במכסה המנוע של תרבות התא, aliquot 5 מ"ל של HBSS לכל באר של צלחת תרבות תא 6 באר ולה מניחים אותו על קרח.בנוסף, aliquot 10 מ"ל של HBSS לצלחת תרבות תאים 10 ס"מ, ולאחר מכן, להכין 20 מ"ל של פתרון Predigestion טריפסין בצינור חרוט סטרילי 50 מ"ל. שמור את כל הפתרונות על קרח. לאחר מכן, לחלץ את הלב ולהעביר אותו מיד לצלחת תרבות התא סטרילי המכיל HBSS.הסר כל רקמת ריאה שיורית וכלי גדולים יותר. לשטוף את הלב HBSS באמצעות תסיסה עדינה. לאחר מכן, חותכים את הלב עם מספריים עדין לתוך 8 חתיכות ולהעביר את רקמת הלב עם מדפים לתוך באר אחת של צלחת תרבות תא 6-well עם HBSS.באמצעות כף מוריה, לשטוף את רקמת הלב על ידי העברת אותו גם גם בצלחת 6-well מלא HBSS. ואז להעביר את רקמת הלב לתוך צינור חרוט המכיל 20 מ"ל של טריפסין דגירה עם תסיסה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. בהליך זה, לפני המלחמה את פתרון עיכול הקולגנס באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.מעבירים את הצינור החטטני המכיל רקמת לב ותסמת עיכול מ-4 מעלות צלזיוס למכסה המנוע של תרבות התאים. תן לרקמת הלב לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את פתרון predigestion באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של HBSS לתוך הצינור.תן שוב את רקמת הלב עם HBSS 2 עד 3 פעמים כדי לשטוף את טריפסין באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. שאפו HBSS והוסיפו 10 מ"ל של פתרון עיכול קולגנס לפני המלחמה לתוך הצינור עם רקמת לב. לעיכול הראשון, דגירה הצינור עם רקמת לב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ללא תסיסה.לאחר מכן, להעביר את הצינור למכסה המנוע של תרבות התא. טריטוראט הרקמה על ידי resuspending אותו בעדינות 10 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. זה יאפשר ללב להתפזר ואת התאים להשתחרר מרקמה הלב.תן לרקמה הלא מעוכלת לשקוע. מעבירים את הפתרון המתעכל המועשר בקרדיומיוציטים לצינור חרוט חדש ומיד מוסיפים כמות שווה של מדיום תרבות תאים כדי לעצור את עיכול הקולגנס. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של פתרון עיכול קולגן לתוך הצינור המכיל את רקמת הלב מעוכל הנותרים.לעיכול השני, דגירה הצינור עם רקמת לב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חזור על ההליכים של העיכול הראשון ולהעביר את הפתרון מתעכל מועשר cardiomyocytes לצינור חרוט חדש לפני עצירת עיכול קולגן. לאחר מכן, מניחים מסננת תאים סטריליים בצינור חרוט סטרילי חדש של 50 מ"ל.הרטב מראש את מסננת התאים עם 2 עד 3 מ"ל של מדיום תרבות התא ולהעביר את התאים דרך מסננת התא. לאחר מכן, לשטוף את מסננת התא עם מדיום תרבות התא. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור חרוט המכיל קרדיומיוציטים במשך 5 דקות ב 180 פעמים כוח הכבידה.לאחר 5 דקות, שאף את supernatant ו resuspend גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיום תאים. צלחת התאים על צלחת תברית תאים 10 ס"מ להחגירה אותם במשך שעה אחת. לאחר מכן, להתסיס בעדינות את הצלחת.לשטוף את התאים שאינם חסידים resuspend התאים על ידי צינורות שוב ושוב את מדיום תרבות התא מעל המנה באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. לאחר מכן, להעביר את התאים שאינם חסידים לתוך צלחת חדשה 10 ס"מ תאים תרבות הדגירה אותם במשך שעה נוספת. לאחר שעה, להתסיס בעדינות את הצלחת ולשטוף את התאים שאינם חסידים.מעבירים את הקרדיומיוציטים לצינור חרוט חדש של 50 מ"ל. לאחר מכן, הכינו צלחת תרבות של 96 בארות על ידי ציטוט 50 מיקרוליטרים של פתרון ציפוי בכל באר של צלחת תרבות התאים בת 96 הבאר. אם קיימות בועות, הסר אותן באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר.הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת כדי לאפשר ייבוש של ציפוי מטריצה. לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. צלחת התאים לתוך מטריצה תיסים מצופה 96 באר צלחת תאים בצפיפות בין 10 ל 30 אלף תאים ל הבאר.ושים את התאים באינקובטר. כדי ליצור מראש את בדיקת צריכת החמצן, לחות מחסנית חיישן מנתח שטף לפחות 3 שעות, להוסיף 200 microliters של פתרון כיול לתוך כל באר של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה על צלחת השירות ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO2 או O2 תוספי לפחות 3 שעות.שעה אחת לפני הבדיקה, להסיר בעדינות את מדיום תרבות התא ולשטוף את התאים עם 200 microliters של מבחן מתח מיטוכונדריאלי טרום המלחמה מדיום פעמיים. לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו 175 מיקרוליטרים של מדיום בדיקת מתח מיטוכונדריאלי לפני המלחמה. ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני או תוספי חמצן.הכינו 3 מ"ל של כל אחת מתרכובות הבדיקה במדיום בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי. טען 25 מיקרוליטרים של כל תרכובת לתוך יציאות המזרק של מחסנית החיישן באמצעות פיפטה רב ערוצית. מצב התאים וכל טיפול מקדים יכול להשפיע על שיקום מרבי עורר על ידי הזרקה של FCCP uncoupler.רגישות התא uncoupler יכול גם להשתנות, ולכן, זה קריטי כדי לייעל את ריכוז העבודה של FCCP עבור כל טיפול מסוים. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול מים של שטף חוץ-תאי והתחל את התוכנית. ראשית, שים את קרטיג' החיישן במכונה לכיול.החלף את הכיול עבור לוחית ההתנסויות לאחר שצעד הכיול נעשה. אם תרצה, לאחר ההתמדה, יש להשליך בזהירות את כל המדיום באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ולאחסן את mircoplate תרבות התא ב שלילי 20 מעלות צלזיוס לנורמליזציה התא בעתיד באמצעות מראי חלבון.על ידי שימוש בפרוטוקול המתואר, לבבות בודדו מהיום 0 גורים ניאו-לידתיים וקרדיומיוציטים נזרעו בציפויות של 10, 20 או 30 אלף תאים ל באר בצלחות 96 בארות. לאחר תרבות הלילה, קרדיומיוציטים נמצאו מחוברים היטב למשטח הפלסטיק הצפוי, היו מעט מאוד תאים לא מחוברים. בשלב זה, באופן ספונטני נדבק קרדיומיוציטים נראו בקלות.צפיפות זריעה של 30,000 תאים לגם הראתה קונפלונס יום אחד לאחר הזריעה כשהתאים מתפשטים. קרדיומיוציטים היו immunostained עם נוגדן נגד אקטין אלפא סרקומרי, סמן ספציפי cardiomyocyte. כפי שמוצג כאן, רוב התאים הראו כתמים חיוביים של אלפא actinin המציין את הטוהר הגבוה של בידוד cardiomyocyte.תוכנית של מבחן מתח מיטוכונדריאלי טיפוסי אחד מוצגת כאן. מבחן הלחץ המיטוכונדריאלי מתחיל במדידת קו בסיס של שיעור צריכת החמצן, ואחריו הזריקה של מיוסין אוליגו אשר מעכב ATPA של. לאחר מכן, הסוכן הלא מפריד FCCP הוזרק כדי למדוד את שיעור צריכת החמצן המרבי.לבסוף, עם הזרקה של שני מעכבי תחבורה אלקטרונים מורכבים, הנשימה המיטוכונדרית מפסיקה לחלוטין OCR יורד לרמתו הנמוכה ביותר. כדי להשיג תוצאות עקביות ותשוחזרות. זה קריטי כדי להשיג שרידות גבוהה.לכן, חשוב להשתמש ביילודים שזה עתה נולדו וטופלו בעדינות ברקמות הלב בקרדיומיוציטים. באמצעות קווי עכבר חדשים או קיימים מניפולציה גנטית, שיטה זו יכולה להיות מתורגמת בקלות לנתונים שעלולים להוביל להבנת מנגנונים חדשים לוויסות ביו-אנרגטי בלב. מיטוכונדריה לשחק תפקידי מפתח בתפקוד הלב.אנו מצפים כי שיטה זו תסייע בזיהוי רגולטורים ומסלולים חדשניים המסדירים את חילוף החומרים המחמצן ומציאת יעדים טיפוליים חדשים לטיפול באי ספיקת לב.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

במדידת רחם של קצב לב בעכבר על ידי אקו M-המצב פולשנית

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

גישה תעלת Semicircular אחורי האוזן הפנימית המסירה הגן עכבר Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

תפקוד אוטונומי בעקבות הזעזוע בני נוער ספורטאים: חקירה של השתנות קצב הלב באמצעות מתודולוגיה 24 שעות הקלטה

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...