Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Vorremmo ringraziare tutti i lab di Ross e membri del laboratorio di Murphy. Questo lavoro è supportato da American Heart Association (14SDG17790005) per Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e VA al merito (BX003260) a R.S.R.

Per il lavoro con topi neonatali, fare riferimento al set di linee guida locale Università/Istituto indietro dai programmi di cura degli animali e aderire a di uno istituzionali e altri regolamenti appropriati. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal UC San Diego istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e rispettano i regolamenti federali e statali.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare 25 mL della soluzione di pre-digestione...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo semplice per isolamento e la coltura del mouse cardiomiociti neonatali. Utilizzando questi cardiomiociti, abbiamo ottimizzato anche le condizioni per misurare il tasso di consumo di ossigeno utilizzando un sistema di analisi di flusso extracellulare. Il protocollo permette di utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nelle cellule del lavoro principale del cuore, simile a que...

Per sostenere una continua funzione contrattile cardiaca, cardiomiociti devono mantenere una fornitura costante di energia cellulare principalmente sotto forma di ATP1. Nel cuore, circa il 95% del trifosfato di adenosina è generato dai mitocondri, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa, mostrando che i mitocondri svolgono un ruolo cruciale di bioenergetico nella funzione cardiaca2,3. Sostenere questa nozione è che disregolazione della funzione mitocondriale può condurre a cardiomiopatia e insufficienza cardiaca4,5. Al contrario, ripristinare la funzione mitocondriale è stato indicato per migliorare la funzione cardiaca di failover cuore6,7. Pertanto, studiando il meccanismo della bioenergetica mitocondriale e identificando nuovi regolatori della funzione mitocondriale in cardiomiociti non rivelerà solo intuizioni meccanicistiche della produzione di energia cardiaca ma anche potrebbe fornire la comprensione che porterà allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie di cuore6,8.
Rispetto a tutto il cuore, che contiene una miscela di miociti e non miociti9, culture dei cardiomiociti sono estremamente puro, con contaminazione minima del non-miociti dal cuore, come fibroblasti e cellule endoteliali10. Inoltre, isolando cardiomiociti da cuccioli neonatali consente la coltura di un gran numero di cellule in una piccola quantità di tempo, rispetto alle celle d'isolamento dal cuore adulto10,11. La cosa più importante, cardiomiociti coltivati primari del topo adulto hanno breve sopravvivenza volte (es. 24 ore) e a più lungo tempo punti de-differenziano. Cardiomiociti neonatali del mouse possono sopravvivere ed essere manipolati per più di 7 giorni nella cultura, che li rende ideali per testare gli effetti della droga composti e manipolazione del gene sulla funzione dei mitocondri in cardiomiociti10. Naturalmente, ci sono significative differenze biologiche tra le cellule adulte e neonatali, ma la durata più lunga disponibile per la coltura di cellule neonatali li rende adatti a diversi tipi di studi, compresi quelli della funzione mitocondriale.
Ad oggi, cardiomyocytes neonatali coltivati primario di topo e di ratto sono stati utilizzati come modelli per lo studio cardiaco bioenergetica12,13. Negli ultimi anni, studi utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e valutare la capacità ossidativa nel topo e nel ratto cardiomiociti neonatali14,15. Mentre rispetto ai ratti, l'attuabilità delle cellule di cardiomiociti neonatali del mouse è più basso e ha una maggiore variabilità16. Inoltre, la possibilità di studiare le cellule da modelli murini geneticamente rende il modello di cella del mouse molto importante. Dato che gli studi OCR sono così sensibili alla cella numero e densità di semina, è necessario lo sviluppo di un protocollo riproducibile, affidabile e semplice per raggiungere la redditività e il rendimento delle celle coerente.
Qui, segnaliamo un protocollo ottimizzato che è stato sviluppato che utilizza cardiomyocytes neonatali coltivati del topo con un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti per analisi OCR. Questo protocollo aumenta notevolmente la riproducibilità del test. Inoltre, il protocollo non solo fornisce un romanzo e un metodo riproducibile per analisi OCR, ma anche può essere adattato ad una cultura di dimensioni più grande per altri scopi sperimentali, come quello che potrebbe essere necessario per studiare funzioni miofibrillare e intracellulare vie di segnalazione.
In particolare, il presente protocollo descrive una procedura di un giorno di isolamento e coltura dei cardiomiociti neonatali del mouse in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti. Inoltre, descrive la procedura per misurare il consumo di ossigeno utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tutte le soluzioni utilizzate sono sterili o filtrato sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati con etanolo al 75%. Forniamo una Tabella materiali per le varie parti della procedura. Per la coltura di cardiomiociti, tutte le procedure e i passaggi vengono eseguiti in una cappa di cultura cellulare standard. Questo protocollo è sviluppato per l'isolamento dei cuori neonatali del mouse da una cucciolata (circa 8-10 cuccioli). Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per isolare i cardiomiociti da cucciolate più.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitocondri e metabolismo ossidativo sono fondamentali per mantenere la funzione del muscolo cardiaco. La ricerca ha dimostrato che la disfunzione mitocondriale è un fattore importante che contribuisce alla funzione cardiaca alterata trovato nello scompenso cardiaco. Al contrario, ristabilimento della funzione mitocondriale difettosa può avere effetti benefici per migliorare la funzione cardiaca nel cuore di venire a mancare. Pertanto, lo studio dei meccanismi di regolamentazione e identificando nuovi regolatori per la funzione mitocondriale potrebbe fornire insight che potrebbero essere usate per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie cardiache. Qui, la respirazione mitocondriale cardiaca del miocita è analizzata utilizzando un sistema di coltura cellulare unico. In primo luogo, un protocollo è stato ottimizzato per isolare rapidamente e cardiomiociti neonatali del mouse ad alta redditività della coltura. Quindi, un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti viene utilizzato per valutare il tasso di consumo di ossigeno di questi cardiomiociti. Per questo protocollo, abbiamo ottimizzato le condizioni di semina ed abbiamo dimostrato che tasso di consumo ossigeno cardiomiociti neonatali del mouse può essere facilmente valutata in un analizzatore di flusso extracellulare. Infine, notiamo che il nostro protocollo può essere applicato a una dimensione maggiore di cultura e altri studi, come ad esempio la segnalazione intracellulare e contrattile funzionano analisi.

Utilizzando il protocollo descritto, i cuori sono stati isolati da cuccioli neonatale giorno 0. 5 x 105 cellule/pup sono stati ottenuti, e cardiomiociti sono stati seminati a densità di 10 x 103, 20 x 103o 30 x 103 cellule/pozzetto, a 96 pozzetti (Figura 2A). Dopo una notte cultura, cardiomiociti sono stati trovati ben attaccati alla superficie rivestita in plastica e c'erano pochissime cellule non collegate (le ce...

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Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analizzando il tasso di consumo di ossigeno nei Cardiomyocytes neonatali coltivati primari del topo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

L'obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Questo protocollo ci consente di isolare e culturare il bi-BBT alto, noto solo ai cardiomiociti del topo. Per valutare la funzione mitocondriale, il tasso di consumo di ossigeno dei cardiomiociti può essere analizzato da un analizzatore di flusso d'argento effettivo. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che il consumo di ossigeno dei cardiomiociti può essere facilmente misurato nel loro stato aderente in formato 96-well, che consente il test di più condizioni con un gran numero di repliche.Questa nave fornisce importanti approfondimenti sull'area di ricerca della cardiologia. Oltre al consumo di ossigeno, possiamo anche studiare altri parametri metabolici, come igrici grigi e l'epossidazione peracidica. Raggiungere un'elevata variabilità dei cardiomiociti è fondamentale per questo esperimento.Ciò richiede un'efficiente digestione dei cuori. Poiché i cardiomiociti neo-natali sono molto fragili, è importante anche una manipolazione delicata dei cardiomiociti. Nella cappa di coltura cellulare, aliquota 5ml di HBSS ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 potte e posizionarla sul ghiaccio.Inoltre, aliquote 10ml di HBSS a un piatto di coltura cellulare da 10 cm, quindi preparare 20 ml di soluzione di predigestione di tripina in un tubo conico sterile da 50 ml. Tieni tutte le soluzioni sul ghiaccio. Quindi, estrarre il cuore e trasferirlo immediatamente nel piatto sterile di coltura cellulare contenente HBSS.Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare residuo e vasi più grandi. Lavare il cuore in HBSS usando un'agitazione delicata. Successivamente, tagliare il cuore con forbici fini in 8 pezzi e trasferire il tessuto cardiaco con le forcep in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con HBSS.Usando un cucchiaio moria, lavare il tessuto cardiaco trasfererlo da pozzo a bene nella piastra a 6 po 'piena di HBSS. Quindi trasferire il tessuto cardiaco in un tubo conico contenente 20 ml di tripside e incubare con agitazione delicata a 4 gradi Celsius per 4 ore. In questa procedura, prebelli la soluzione di digestione della collagenasi in un bagno d'acqua a 37 gradi celsius.Trasferire il tubo conico contenente tessuto cardiaco e soluzione di predigestione da 4 gradi celsius a una cappa di coltura cellulare. Lasciare che il tessuto cardiaco affondi sul fondo del tubo e rimuovere la soluzione di predigestione utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Quindi, aggiungere 10 ml di HBSS nel tubo.Resuspend il tessuto cardiaco con HBSS da 2 a 3 volte per lavare la tripina usando una pipetta sierologica da 10 ml. Aspirare l'HBSS e aggiungere 10 ml di soluzione di digestione della collagenasi prebellica nel tubo con tessuto cardiaco. Per la prima digestione, incubare il tubo con tessuto cardiaco in un bagno d'acqua a 37 gradi celsius per 10 minuti senza agitazione.Successivamente, trasferire il tubo nella cappa di coltura cellulare. Triturare il tessuto rimospenselo delicatamente 10 volte usando una pipetta sierologica da 10 ml. Ciò consentirà al cuore di disperdersi e alle cellule di essere rilasciate dal tessuto cardiaco.Lascia affondare il tessuto non digerito. Trasferire la soluzione digerita arricchita in cardiomiociti in un nuovo tubo conico e aggiungere immediatamente una quantità uguale di mezzo di coltura cellulare per fermare la digestione della collagenasi. Quindi aggiungere 10 ml di soluzione di digestione della collagenasi nel tubo contenente il tessuto cardiaco non digerito rimanente.Per la seconda digestione, incubare il tubo con tessuto cardiaco in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ripetere le procedure della prima digestione e trasferire la soluzione digerita arricchita in cardiomiociti in un nuovo tubo conico prima di interrompere la digestione della collagenasi. Quindi, posizionare un colino cellulare sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.Pre-bagnare il filtro cellulare con da 2 a 3 ml di terreno di coltura cellulare e passare le cellule attraverso il filtro cellulare. Successivamente, sciacquare il filtro cellulare con il mezzo di coltura cellulare. Quindi, centrifugare il tubo conico contenente cardiomiociti per 5 minuti a 180 volte la gravità.Dopo 5 minuti, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 ml di mezzo di coltura cellulare. Placcare le cellule su un piatto di coltura cellulare di 10 cm e incubarle per un'ora. Successivamente, agitare delicatamente il piatto.Lavare le cellule non aderenti e risosopendare le cellule pipettando ripetutamente il mezzo di coltura cellulare sul piatto utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Quindi, trasferire le cellule non aderenti in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 cm e incubarle per un'altra ora. Dopo un'ora, agitare delicatamente il piatto e lavare via le cellule non aderenti.Trasferire i cardiomiociti in un nuovo tubo conico da 50 ml. Successivamente, preparare una piastra di coltura di 96 porvili aliquotando 50 microlitri di soluzione di rivestimento in ogni pozzo della piastra di coltura cellulare da 96 porvili. Se sono presenti bolle, rimuoverle utilizzando una pipetta da 20 microliter.Incubare la piastra a 37 gradi celsius per almeno un'ora per consentire l'essiccazione del rivestimento della matrice. Quindi, conta le cellule usando un emocitometro. Placcare le cellule nella piastra di coltura cellulare extracellulare rivestita di 96 po 'ad una densità compresa tra 10 e 30 mila cellule per pozzo.E mettere le cellule nell'incubatore. Per preformare il saggio sul consumo di ossigeno, idratare una cartuccia del sensore dell'analizzatore di flusso per almeno 3 ore, aggiungere 200 microlitri di soluzione di calibante in ogni pozzo della piastra di utilità. Riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità e incubare in 37 gradi celsius senza integrazione di CO2 o O2 per almeno 3 ore.Un'ora prima del test, rimuovere delicatamente il mezzo di coltura cellulare e lavare le cellule con 200 microlitri di mezzo di prova di stress mitocondriale prebellico due volte. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 175 microlitri di mezzo di prova di stress mitocondriale prebellico. Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica o integrazione di ossigeno.Preparare 3 ml di ciascuno dei composti di prova nel mezzo di prova di stress mitocondriale. Caricare 25 microlitri di ciascun composto nelle porte dell'iniettore della cartuccia del sensore utilizzando una pipetta multicanale. Lo stato delle cellule e gli eventuali pretrattamenti possono influire sul massimo ripristino suscitato dall'iniezione di FCCP disaccoppiatore.Anche la sensibilità cellulare al disaccoppiatore può cambiare, pertanto è fondamentale ottimizzare la concentrazione di lavoro di FCCP per ogni particolare trattamento. Successivamente, impostare il protocollo di dosaggio del flusso extracellulare e avviare il programma. In primo luogo, mettere il cartiridge del sensore nella macchina per la calibrazione.Sostituire il calibrant per la piastra di dosaggio una volta eseguita la fase di calibrazione. Se lo si desidera, dopo il saggio, scartare accuratamente tutti i mezzi di dosaggio utilizzando una pipetta multicanale. E conservare la coltura cellulare mircoplato a -20 gradi celsius per la futura normalizzazione cellulare usando test proteici.Usando il protocollo descritto, i cuori erano isolati dai cuccioli neo-natali del primo giorno e i cardiomiociti venivano seminati a densità di 10, 20 o 30 mila cellule per pozzo in piastre da 96 pozzi. Dopo la coltura notturna, i cardiomiociti sono stati trovati ben attaccati alla superficie plastica rivestita e c'erano pochissime cellule non attaccate. A questo punto, i cardiomiociti che si contraevano spontaneamente erano facilmente visibili.Una densità di semina di 30.000 cellule per pozzo ha mostrato confluenza un giorno dopo la semina man mano che le cellule si diffondono. I cardiomiociti sono stati immunososteniati con un anticorpo contro l'alfa actinina sarcomerica, un marcatore specifico del cardiomiocita. Come mostrato qui, la maggior parte delle cellule ha mostrato una colorazione positiva dell'actina alfa che indica l'elevata purezza dell'isolamento cardiomiocita.Qui viene mostrato uno schema di una tipica prova di stress mitocondriale. La prova di stress mitocondriale inizia con una misurazione della linea di base del tasso di consumo di ossigeno, seguita dall'iniezione di miosina di Oligo che inibisce l'ATPA. Quindi, l'agente di disaccoppiamento FCCP è stato iniettato per misurare il tasso massimo di consumo di ossigeno.Infine, con l'iniezione di due inibitori complessi del trasporto elettronico, la respirazione mitocondriale si ferma completamente e l'OCR diminuisce al suo livello più basso. Per ottenere risultati coerenti e riproducibili. È fondamentale raggiungere un'elevata sopravvivenza.Pertanto, è importante utilizzare neonati neonati e tessuti cardiaci delicatamente maneggiati nei cardiomiociti. Utilizzando linee di topo geneticamente manipolate nuove o esistenti, questo metodo può essere facilmente tradotto in dati che possono portare a comprendere nuovi meccanismi per la regolazione bioenergetica nel cuore. I mitocondriali svolgono un ruolo chiave nella funzione cardiaca.Ci aspettiamo che questo metodo aiuti a identificare nuovi regolatori e percorsi che regolano il metabolismo ossidante e trovano nuovi obiettivi terapeutici per il trattamento dell'insufficienza cardiaca.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Ricerca

Medicina

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

La funzione autonoma dopo trauma cranico in giovani atleti: un'esplorazione della variabilità della frequenza cardiaca utilizzando la metodologia di registrazione 24 ore

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...