Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

我々 はすべてのロス ラボとマーフィー研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は NIH エンライテンメント (HL115933、HL127806) と R.S.R. に VA メリット (BX003260) アメリカ心臓協会 (14SDG17790005) によってサポートされて

新生仔マウスの仕事のためなど動物プログラムによってローカル大学のガイドラインのセットを参照してくださいして 1 つの機関およびその他適切な法律を遵守ください。このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは UC サンディエゴ機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、連邦および州の規制に準拠します。
1. 試薬の調製
<ol><li><stro...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

本研究では、分離すること、マウス新生児心筋細胞を培養するための単純なプロトコルを設けています。これらの心筋細胞を用いて、細胞フラックス アナライザー システムを用いた酸素消費量を測定するための条件も最適化されています。プロトコルでは、そのままの臓器で測定されるものに似ている、心の主作業セルの酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル ?...

連続的な心臓の収縮機能を維持するために、心筋細胞は ATP1の形で主に細胞のエネルギーの安定供給を維持しなければなりません。中心部には、ATP の約 95% はミトコンドリア酸化的リン酸化、ミトコンドリアが心機能2,3で重要な生体エネルギーの役割を再生表示を中心にによって生成されます。この概念を支えるは、ミトコンドリア機能の不全心筋症や心不全の4,5につながることができます。逆に、失敗の心機能を改善するために示されているミトコンドリアの機能を復元する6、7の心します。したがって、ミトコンドリアのエネルギー代謝のメカニズムを勉強して、心筋細胞のミトコンドリア機能の新しい調節を識別する心臓エネルギーの生産の機械論的な洞察力を明らかにはしない、またつながる洞察力を提供できます。心疾患6,8の治療に新しい治療上のターゲットの開発。
心臓全体と比較して、非常に純粋な非筋細胞線維芽細胞や血管内皮細胞10など、心の底からの雑菌は心筋細胞と非筋細胞9、心筋細胞文化の混合物が含まれています。さらに、新生児の子犬から心筋細胞を分離する大人の心10,11から分離する細胞と比較して時間の少量の細胞の数が多いを養殖できます。最も重要なは、一次培養アダルト マウス心筋細胞 (例えば 24 h) 回生存期間が短縮、長い時間でポイントが逆差別化します。新生児マウス心筋細胞は生き残ることができる、7 日間の培養、心筋細胞10薬剤化合物とミトコンドリアの機能に関する遺伝子操作の効果をテストに最適な上向きの操作します。もちろん、成人と新生児の細胞の重要な生物的違いがあるが、新生児の細胞の培養のため長い期間使用可能なため、ミトコンドリア機能のそれらを含む研究の多くの異なる種類の適切です。
までに、一次培養新生児マウスおよびラットの心筋細胞は、心臓の生体エネルギー12,13を研究するモデルとして使用されています。近年では、研究は酸素消費量 (OCR) を測定し、マウスおよびラット新生児心筋細胞14,15酸化能力を評価する細胞フラックス アナライザーを使用しました。一方、ラットと比較して、マウス新生児心筋細胞の細胞生存率が低い、大きい変動16です。また、遺伝子改変マウスのモデルから細胞を調査する機能はマウス細胞モデルを非常に重要ななります。OCR 研究が細胞数および播種密度に敏感、一貫性のある細胞収量および生存率を達成するために再現性のある、信頼性の高い、簡単なプロトコルの開発が必要です。
ここでは、OCR 解析 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザーと共に培養マウス新生児心筋細胞を使用して開発されている最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、アッセイの再現性を大きく向上します。また、プロトコルだけでなく小説や OCR 分析の再現性のある方法を提供がも、筋原繊維機能を研究するために必要と細胞内となるよう、他の実験目的のためはより大きいサイズの文化に適応することができます。シグナル伝達経路。
特に、このプロトコルは 96-well 細胞培養プレート新生仔マウスにおける心筋細胞の分離と培養の 1 日プロシージャを記述します。さらに、それは細胞外フラックス アナライザーを使用して酸素消費量を測定する手順を説明します。使用されるすべてのソリューションが滅菌、滅菌フィルタ リングします。すべてのツールは、75% エタノールで滅菌されています。プロシージャのさまざまな部分の材料のテーブルを提供します。心筋細胞を培養するためすべての手続きや手順は、標準セル文化フードで実行されます。このプロトコルは、1 リットル (約 8-10 子犬) から新生児マウス心を分離するため開発されています。ただし、プロトコルは、複数の仔から心筋細胞を分離するために適応させることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

ミトコンドリアおよび酸化的代謝心臓筋肉の機能を維持するために重要です。研究は、心不全、心臓機能障害の重要な要因のミトコンドリアの機能低下を示しています。対照的に、不良ミトコンドリア機能を復元すると、失敗した心における心機能の改善に有益な効果があります。したがって、調節のメカニズムを勉強して、ミトコンドリア機能の新しい調節の識別は、心臓病の治療のための新しい治療上のターゲットを開発するために使用可能性があります洞察力を提供できます。ここでは、ユニークな細胞培養系を用いた心筋細胞のミトコンドリア呼吸を分析します。まず、プロトコルは急速に分離し、高生存率新生児マウス心筋細胞の培養に最適化されています。その後、96-well 細胞フラックス アナライザーを使用してこれらの心筋の酸素消費量を評価します。このプロトコルの播種条件を最適化し、示した細胞フラックス アナライザーでその新生児マウス心筋酸素消費量を簡単に評価できます。最後に、我々 は大きく文化に私達のプロトコルを適用できるし、他の研究は、細胞内シグナル伝達などと収縮機能解析を注意してください。

説明されたプロトコルを使用して、心は 0 日目の新生児の子犬から分離されました。5 x 10 の5セル/子犬を入手し、心筋細胞が 10 x 10320 × 10 の3、または 30 x 103細胞/ウェル、96 ウェル プレート (図 2 a) の密度で播種しました。一晩培養後心筋細胞が発見されたコーティング プラスチック表面によく付着 (未接続の細...

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Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル システムとしてマウス新生児心筋細胞を使用する方法を説明するためにです。

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

このプロトコルは、マウス心筋細胞にのみ知られている高いバイBBTを分離し、培養することを可能にする。ミトコンドリア機能を評価するために、心筋細胞の酸素消費率を実際の銀フラックス分析装置で解析することができます。この技術の利点の1つは、心筋細胞の酸素消費量が96ウェル形式で付着状態で容易に測定できることであり、多数の複製を伴う複数の条件のテストを可能にする。この容器は心臓病学の研究分野に重要な洞察を提供する。酸素消費量に加えて、グレイグライスや過酸エポキシ化などの他の代謝パラメータも研究できます。心筋細胞の高いばらつきを達成することは、この実験にとって非常に重要です。これは、心の効率的な消化を必要とします。新生児心筋細胞は非常に脆弱であるため、心筋細胞の穏やかな取り扱いも重要です。細胞培養フードにおいて、6ウェル細胞培養板の各ウェルにHBSSのアリコート5mlを氷の上に置いた。さらに、10cm細胞培養皿に10mlのHBSSのアリコート10mlを、その後、50mlの滅菌円錐管に20mlのトリプシン前消化液を調製した。すべてのソリューションを氷の上に保管してください。次に、心臓を抽出し、HBSSを含む滅菌細胞培養皿に直ちに移す。残留肺組織および大きな血管を除去する。穏やかな攪拌を使用してHBSSで心臓を洗います。その後、微細なはさみで心臓を8個に切断し、鉗子で心臓組織をHBSSで6ウェル細胞培養板の1つのウェルに移します。モリアスプーンを使用して、HBSSで満たされた6ウェルプレートで心臓組織をよく移して心臓組織を洗います。その後、トリプシンの20mlを含む円錐形のチューブに心臓組織を移し、4°Cで穏やかな攪拌で4時間インキュベートする。この手順では、37°Cの水浴にコラゲレーター消化液を予熱する。心臓組織と消化前溶液を含む円錐管を摂氏4度から細胞培養フードに移す。心臓組織をチューブの底に沈め、10mlの血清ピペットを使用して前消化液を取り除きます。次に、チューブに10mlのHBSSを加えます。HBSSで心臓組織を2〜3回再中断し、10ml血清ピペットを使用してトリプシンを洗い流す。HBSSを吸引し、10mlのプレウォーム付きコラゲザーゼ消化液を心臓組織でチューブに加えます。最初の消化のために、37°Cの水浴で心臓組織とチューブを攪拌することなく10分間インキュベートします。その後、チューブを細胞培養フードに移します。10ml血清ピペットを使用して10回穏やかに再懸濁して組織をトリチュレートする。これにより、心臓が分散し、細胞が心臓組織から放出されます。未消化の組織を沈ませます。心筋細胞に富んだ消化溶液を新しい円錐形チューブに移し、即座に同量の細胞培養培地を加えてコラゲアーゼ消化を止める。その後、残りの未消化の心臓組織を含むチューブにコラゲターゼ消化液10mlを加える。第二の消化のために、10分間摂氏37度の水浴で心臓組織とチューブをインキュベート。最初の消化の手順を繰り返し、コラゲナーゼ消化を停止する前に、心筋細胞で濃縮された消化溶液を新しい円錐形チューブに移します。次に、新しい滅菌50ml円錐管に無菌細胞ストレーナーを入れる。細胞培養培地2〜3mlで細胞ストレーナーを予め湿潤し、細胞ストレーナーを通して細胞を通過させた。続いて、細胞培養培地で細胞ストレーナーをリンスする。次いで、心筋細胞を含む円錐管を180倍の重力で5分間遠心する。5分後、上清を吸引し、細胞ペレットを10mlの細胞培養培地に再懸濁した。細胞を10cmの細胞培養皿に盛り付け、1時間インキュベートします。その後、プレートを軽く攪拌します。非接着性細胞を洗い流し、10ml血清ピペットを使用して皿の上に細胞培養培地を繰り返しピペット化して細胞を再懸濁する。次に、非接着性細胞を新しい10cm細胞培養皿に移し、さらに1時間インキュベートする。1時間後、プレートを軽く攪拌し、非接着性細胞を洗い流します。心筋細胞を新しい50ml円錐形チューブに移します。次に、96ウェル細胞培養板の各ウェルに50マイクロリットルのコーティング液をアリクォートして96ウェル培養板を調製する。気泡が存在する場合は、20マイクロリットルのピペットを使用してそれらを除去します。マトリックスコーティングの乾燥を可能にするために、少なくとも1時間は摂氏37度でプレートをインキュベートします。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。細胞を細胞外マトリックスにプレートし、ウェルあたり10〜30,000個の細胞の密度で96ウェルの細胞培養プレートをコーティングします。そして、インキュベーターに細胞を置きます。酸素消費アッセイをプリフォームするには、フラックスアナライザのセンサカートリッジを少なくとも3時間水和し、200マイクロリットルのキャリブラント溶液をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、CO2またはO2の補充なしで37°Cで少なくとも3時間インキュベートします。アッセイの1時間前に、細胞培養培地を穏やかに除去し、200マイクロリットルのプリウォームミトコンドリアストレス試験培地で細胞を2回洗浄する。2回目の洗浄後、175マイクロリットルのプリウォームミトコンドリアストレステスト培地を加える。その後、二酸化炭素や酸素補給なしで摂氏37度で細胞を培養します。ミトコンドリアストレス試験培地で各試験化合物を3mlずつ調製した。マルチチャンネルピペットを使用して、各化合物の25マイクロリットルをセンサーカートリッジのインジェクタポートにロードします。細胞の状態および任意の前処理は、非結合性FCCPの注入によって引き出される最大の修復に影響を与える可能性がある。アンカプラに対する細胞感受性も変化し得るため、特定の治療ごとにFCCPの働き濃度を最適化することが重要である。その後、細胞外フラックスアッセイプロトコルを設定し、プログラムを開始します。まず、キャリブレーションのためにセンサーのカルティリッジを機械に入れます。キャリブレーションが完了したら、アッセイプレートのキャリブラントを交換します。必要に応じて、アッセイ後、マルチチャネルピペットを用いてすべてのアッセイ媒体を慎重に廃棄する。そして、タンパク質アッセイを用いた細胞正常化のために、細胞培養ミルコプレートをマイナス20°Cで保存します。記載されたプロトコルを用いて、心臓を0日目から単離した新生児の子犬および心筋細胞を、96ウェルプレートのウェルあたり10、20、または30千個の密度で播種した。一晩培養した後、心筋細胞はコーティングされたプラスチック表面によく付着していることが判明し、未結合の細胞はほとんどなかった。この時点で、自然収縮心筋細胞は容易に見えうる。1ウェルあたり30,000個の細胞の播種密度は、細胞が広がるにつれて播種した翌日に合流を示した。心筋細胞は、心筋細胞特異的マーカーである肉体αアクチニンに対する抗体で免疫染色した。ここに示すように、細胞の大部分は、心筋細胞単離の高純度を示すαアクチニンの陽性染色を示した。典型的なミトコンドリアストレステストのスキームがここに示されています。ミトコンドリアストレス試験は酸素消費率の基線測定から始まり、続いてATPAを阻害するオリゴミオシンの注入が続く。次いで、最大酸素消費率を測定するために、非結合剤FCCPを注入した。最後に、2つの電子輸送複合体阻害剤の注入により、ミトコンドリア呼吸は完全に停止し、OCRは最も低いレベルに低下する。一貫した再現性のある結果を得る。高い生存を達成することが重要です。したがって、新生児を使用し、心筋細胞で心臓組織を穏やかに処理することが重要です。新しいまたは既存の遺伝的に操作されたマウスラインを使用することにより、この方法は、心臓の生体エネルギー調節のための新しいメカニズムを理解することにつながる可能性のあるデータに簡単に変換することができます。ミトコンドリアは心臓機能において重要な役割を果たす。この方法は、新しい調節因子や、新しい代謝を調節する経路を特定し、心不全を治療するための新しい治療目標を見つけるのに役立つと期待しています。

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

非侵襲Mモード心エコー検査によるマウスでの心拍数の子宮内測定で

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

次のユース選手の脳震盪の自律神経機能: 24 時間録音手法を使用して心拍数の変化の調査

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

細胞外フラックスアナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析