Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

우리는 모든 로스 연구소 및 머피 연구소 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 심 혼 협회 (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806)와 R.S.R. 버지니아 가치 (BX003260)에 의해 지원

신생아 쥐와 작품에 대 한 동물 보호 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학/연구소 지침 설정을 참조 하 고 하나의 기관 및 다른 적절 한 규정을 준수 하십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)을 승인 하 고 연방 및 주 규정 준수.
1입니다. 시 약의 준비
<ol><li>25 mL 사전 소화 솔루션의 준비: (캘리포니아2 +</...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

이 연구에서 우리는 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 경작에 대 한 간단한 프로토콜을 설립 했다. 사용 하 여 이러한 cardiomyocytes, 우리는 또한 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 산소 소비 속도 측정 하는 조건을 최적화. 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 얼마나 다양 한 요인이 그대로 기관 측정 될 것 이다 가까운 심장의 주 작업 세포에 산소 소비를 변...

지속적인 심장 수축 기능을 하려면 cardiomyocytes ATP1의 형태로 주로 세포 에너지의 지속적인 공급을 유지 해야 합니다. 에, ATP의 대략 95%는 미토 콘 드리 아 중요 한 역할 bioenergetic 심장 기능2,3에서 보여주는 산화 인 산화를 통해 주로 미토 콘 드리 아에 의해 생성 됩니다. 그는이 개념을 지 원하는 미토 콘 드 리아 기능의 dysregulation 심근과 심장 마비4,5이어질 수 있습니다. 반대로, 미토 콘 드리 아 기능을 복원 표시 되었습니다 실패의 심장 기능을 개선 하기 위해6,7심장. 따라서 미토 콘 드리 아 생체의 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능 cardiomyocytes에의 소설 레 귤 레이 터를 식별만 심장 에너지 생산의 기계 론 적인 통찰력을 공개 하지 않습니다 하지만 또한 이어질 것입니다 통찰력을 제공할 수 있습니다. 심장 질환6,8치료에 새로운 치료 목표의 개발.
온 마음에 비해, 매우 순수 하 고, 섬유 아 세포와 내 피 세포10같은 마음에서 비 myocytes의 최소한의 오염 있습니다 myocytes 및 비 myocytes9, cardiomyocyte 문화의 혼합물을 포함 하. 또한, 신생아 강아지에서 cardiomyocytes 격리 성인 마음10,11에서 고립 세포에 비해 시간의 작은 금액에 많은 수의 셀을 배양 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 기본 교양된 성인 마우스 cardiomyocytes 짧은 생존 시간 (예: 24 시간)와 장시간에 포인트 드 차별화. 신생아 마우스 cardiomyocytes 살아남을 수 그리고 문화, cardiomyocytes10마약 화합물 및 미토 콘 드리 아의 기능에 유전자 조작의 효과 테스트에 이상적에 7 일 이상에 대 한 조작. 물론, 성인 및 신생아 셀 사이의 중요 한 생물 학적 차이가 있다 하지만 미토 콘 드 리아 기능 포함 하는 연구의 다양 한 종류에 대 한 적절 한 게 신생아 셀의 문화에 대 한 사용할 수 있는 더 긴 기간.
날짜 하려면, 기본 교양된 신생아 마우스와 쥐 cardiomyocytes 심장 생체12,13연구 모델로 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 연구 산소 소비 속도 (OCR)을 측정 하 고 쥐와 쥐 신생아 cardiomyocytes14,15산화 용량을 평가 하는 세포 외 유출 분석기를 사용 합니다. 쥐에 비해, 하는 동안 마우스 신생아 cardiomyocytes의 세포 생존 능력 낮은 이며 더 큰 다양성16했다. 또한, 유전자 조작된 마우스 모델에서 세포를 공부 하는 능력 만드는 마우스 셀 모델 매우 중요 하다. 감안할 때 그 OCR 연구 세포 수 및 밀도 뿌리기에 너무 민감합니다, 일관 된 셀 생산량 및 생존 능력 달성을 재현 하 고 신뢰할 수 있는, 간단한 프로토콜의 개발이 필요 합니다.
여기, 우리는 최적화 된 프로토콜 개발 된 OCR 분석에 대 한 교양된 마우스 신생아 cardiomyocytes 함께 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 보고 합니다. 이 프로토콜은 매우 분석 결과의 재현성을 증가 한다. 또한, 프로토콜 소설 및 OCR 분석, 재현 방법 제공 뿐만 아니라 또한 필요한 myofibrillar 기능을 공부 하 고 세포내 있을 수 있습니다 같은 다른 실험적인 목적을 위한 큰 크기 문화에 적응 될 수 있습니다. 신호 경로.
특히,이 프로토콜 고립과 96 잘 셀 문화 접시에 신생아 마우스 cardiomyocytes의 문화에 대 한 일 절차를 설명합니다. 또한, 그것은 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 절차를 설명 합니다. 모든 솔루션에 사용 되는 살 균 또는 살 균 필터링. 모든 도구는 75% 에탄올에 의해 살 균. 우리는 절차의 다양 한 부분에 대 한 테이블의 자료 를 제공합니다. Cardiomyocytes 경작에 대 한 모든 절차 및 단계는 표준 셀 문화 후드에서 수행 됩니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스 마음 한 쓰레기 (약 8-10 새끼)에서 격리에 대 한 개발. 그러나, 프로토콜 또한 cardiomyocytes 여러 담가에서 분리 하는 데 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

미토 콘 드리 아 및 산화 대사는 심장 근육 기능을 유지 하기 위한 중요 합니다. 연구는 미토 콘 드 리아 기능 장애는 심장 마비에서 장애인된 심장 기능에 중요 한 기여 요인으로 나타났습니다. 대조적으로, 결함이 있는 미토 콘 드리 아 기능을 복원 하는 것은 실패에 심장 기능을 개선 하기 위해 유익한 효과 있을 수 있습니다. 따라서 규제 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능에 대 한 새로운 레 귤 레이 터를 식별 심장 질환 치료를 위한 새로운 치료 목표를 개발 하는 데 사용할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, 심장 myocyte 미토 콘 드리 아 호흡 독특한 셀 문화 시스템을 사용 하 여 분석 된다. 첫째, 프로토콜은 신속 하 게 격리 하 고 높은 생존 신생아 마우스 cardiomyocytes 문화 최적화 되었습니다. 다음, 96-잘 포맷 세포 외 유출 분석기는 이러한 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 평가 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 시드 조건을 최적화 하 고 그 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비 속도 세포 외 유출 분석기에서 쉽게 평가 될 수 있다 설명 했다. 마지막으로, 우리는 우리의 프로토콜 큰 문화 크기에 적용할 수 및 다른 연구, 세포내 신호 등 및 수축 성 기능 분석 주의.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 마음 하루 0 신생아 강아지에서 격리 했다. 5 x 105 셀/강아지 가져온, 그리고 cardiomyocytes 10 x 103, 20 x 103또는 잘/30 x 103 셀, 96 잘 접시 (그림 2A)에서 밀도에 씨를 뿌리고 있었다. 야간 문화, 후 cardiomyocytes 발견 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착 된 거의 연결 되지 않은 셀 (첨부 되지 않은 셀 ?...

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Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

이 프로토콜은 마우스 심근세포에만 알려진 높은 이중 BBT를 분리하고 배양할 수 있게 합니다. 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 심근세포의 산소 소비율은 실제 은 플럭스 분석기로 분석될 수 있다. 이 기술의 장점 중 하나는 심근세포의 산소 소비가 96웰 형식으로 그들의 부착 상태에서 쉽게 측정될 수 있다는 것입니다, 이는 많은 수의 복제와 함께 여러 조건의 테스트를 가능하게 합니다.이 혈관은 심장학의 연구 영역에 중요한 통찰력을 제공합니다. 산소 소비 이외에, 우리는 또한 다른 신진 대사 매개 변수를 연구할 수 있습니다., 그레이 그리스와 과산 편산화 등. 심근 세포의 높은 가변성을 달성하는 것은이 실험에 대 한 중요 한.이를 위해서는 마음의 효율적인 소화가 필요합니다. 신생아 심근세포는 매우 깨지기 때문에 심근세포의 부드러운 취급도 중요합니다. 세포 배양 후드에서, 6웰 세포 배양 판의 각 웰에 HBSS의 알리쿼트 5ml를 알리쿼트하고 얼음에 놓습니다.또한, 10cm 세포 배양 접시에 HBSS 10ml를 알리쿼트한 다음, 50ml멸균 원추형 튜브에 트립신 전소화식 용액 20ml를 준비한다. 모든 솔루션을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 심혼을 추출하고 HBSS를 포함하는 멸균 세포 배양 접시로 즉시 이송한다.잔류 폐 조직과 더 큰 혈관을 제거하십시오. 부드러운 동요를 사용하여 HBSS에서 심장을 씻으시면 됩니다. 그 후, 미세 한 가위로 심혼을 8개로 자르고, HBSS를 가진 6웰 세포 배양 판의 한 우물로 집게로 심장 조직을 전송합니다.모리아 숟가락을 사용하여 HBSS로 채워진 6 웰 플레이트에서 잘 전달하여 심장 조직을 씻어 내보도록 하십시오. 그런 다음 심장 조직을 트립신 20ml를 포함하는 원추형 튜브로 옮기고 4 시간 동안 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 배양하십시오. 이 절차에서 콜라게나아제 소화 용액을 섭씨 37도에서 수조에 미리 데우겠습니다.심장 조직과 소화 전 용액을 함유 한 원적 튜브를 섭씨 4도에서 세포 배양 후드로 옮는다. 심장 조직이 튜브의 바닥에 가라 앉게하고 10ml 세로지 피펫을 사용하여 소화 전 용액을 제거하십시오. 다음으로, 튜브에 10ml의 HBSS를 추가합니다.10ml 세로지피펫을 사용하여 트립신을 씻어 내기 위해 HBSS2 에서 3 번 심장 조직을 다시 중단합니다. HBSS를 흡인하고 심장 조직으로 튜브에 미리 따뜻해지는 콜라게나아제 소화 용액 10ml를 추가합니다. 첫 번째 소화를 위해, 동요없이 10 분 동안 37 섭씨 37도에서 수조에 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오.그 후, 튜브를 세포 배양 후드로 이송한다. 10ml 세로지 피펫을 사용하여 10회 부드럽게 다시 페일링하여 조직을 트리투레이합니다. 이것은 심장이 분산하고 세포가 심장 조직에서 풀어 놓일 수 있게 합니다.소화되지 않은 조직이 가라앉도록 하십시오. 심근세포에 농축된 소화된 용액을 새로운 원내 튜브로 옮기고 즉시 동일한 양의 세포 배양 배지를 추가하여 콜라게나아제 소화를 막습니다. 그런 다음 10ml의 콜라게나아제 소화 용액을 나머지 소화되지 않은 심장 조직을 포함하는 튜브에 추가합니다.두 번째 소화를 위해 10 분 동안 37섭씨 수조로 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오. 첫 번째 소화의 절차를 반복하고 콜라게나아제 소화를 중지하기 전에 심근 세포에 농축 된 소화 된 용액을 새로운 원적 튜브로 옮춥시다. 다음으로 멸균 세포 스트레이너를 새로운 멸균 50ml 원문 튜브에 놓습니다.세포 배양 배지의 2 ~ 3 ml로 세포 스트레이너를 미리 적시고 세포 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 이어서, 세포 배양 배지로 세포 스트레이너를 헹구는다. 그런 다음, 180배의 중력에서 5분 동안 심근세포가 함유된 원심관을 원심분리합니다.5 분 후, 슈퍼 내수를 흡인하고 세포 배양 배지의 10ml에서 세포 펠릿을 재놓습니다. 세포를 10cm 세포 배양 접시에 접시에 접시를 매고 1 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 부드럽게 접시를 동요.10ml 세로지피펫을 사용하여 접시 위에 세포 배양 배지를 반복적으로 피펫하여 비 부착 세포를 씻어 내고 세포를 재차단합니다. 그런 다음, 비 부착 세포를 새로운 10cm 세포 배양 접시로 옮기고 다른 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 부드럽게 접시를 동요하고 비 부착 세포를 씻어.심근세포는 새로운 50ml 원내 튜브로 옮킨다. 다음으로, 96웰 세포 배양판의 각 웰에 50마이크로리터의 코팅 용액을 알리싱하여 96웰 배양판을 준비한다. 거품이 있는 경우 20 마이크로리터 파이펫을 사용하여 제거합니다.매트릭스 코팅의 건조를 허용하기 위해 적어도 한 시간 동안 37섭씨에서 플레이트를 배양한다. 그런 다음 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 초세포 매트릭스로 플레이트하여 96웰 세포 배양판을 웰당 10~30,000개의 밀도로 코팅한다.그리고 인큐베이터에 세포를 배치합니다. 산소 소비 분석을 제거하려면 플럭스 분석기 센서 카트리지를 최소 3시간 동안 수화하고, 200마이크로리터의 교정용액을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 놓고 CO2 또는 O2 보충 없이 섭씨 37도에 적어도 3시간 동안 배양하십시오.분석 1시간 전에, 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고 전동미토콘드리아 응력 시험 배지의 200 마이크로리터로 세포를 세척한다. 두 번째 세척 후, 미리 따뜻해진 미토콘드리아 응력 테스트 배지의 175 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이산화탄소 나 산소 보충제없이 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.미토콘드리아 응력 시험 배지에서 각 시험 화합물 3ml를 준비한다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 화합물의 25 마이크로리터를 센서 카트리지의 인젝터 포트에 로드합니다. 세포의 상태 와 모든 전처리는 비커플러 FCCP의 주입에 의해 유도 된 최대 복원에 영향을 미칠 수 있습니다.분리제에 대한 세포 민감도도 변경될 수 있으므로 각 특정 치료에 대해 FCCP의 작업 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 그 후, 여분의 세포 플럭스 분석 프로토콜을 설정하고 프로그램을 시작합니다. 먼저 센서 카테리리지를 장비에 넣어 교정합니다.교정 단계가 완료되면 분석 플레이트의 교정판을 교체하십시오. 원하는 경우, 분석 후, 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 모든 분석 매체를 폐기. 그리고 단백질 분석체를 사용하여 향후 세포 정상화를 위해 세포 배양 미코플레이트를 음수 20도에 저장합니다.설명된 프로토콜을 사용하여, 심혼은 96웰 플레이트에서 웰 당 10, 20 또는 30,000세포의 밀도에서 종자 및 심근세포0일로부터 분리되었다. 하룻밤 배양 후, 심근세포는 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착되어 있고 부착되지 않은 세포가 거의 없었다. 이 시점에서, 자발적으로 수축 심근 세포 쉽게 볼 수 있었다.잘 당 30, 000 세포의 파종 밀도는 세포가 퍼지면서 파종 후 하루 만에 합류를 보였다. 심근세포는 육종 알파 액틴, 심근세포 특이적 마커에 대한 항체로 면역염색되었다. 여기에 도시된 바와 같이, 대부분의 세포는 심근세포 분리의 높은 순도를 나타내는 알파 액틴의 양성 얼룩을 보였다.하나의 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트의 계획은 여기에 표시됩니다. 미토콘드리아 스트레스 테스트는 산소 소비율의 기본 선 측정으로 시작하여 ATPA를 억제하는 올리고 묘신의 주입에 따른다. 이어서, 분리제 FCCP는 최대 산소 소비속도를 측정하기 위해 주입되었다.마지막으로, 두 개의 전자 수송 복합 억제제의 주입으로, 미토콘드리아 호흡은 완전히 중지하고 OCR은 가장 낮은 수준으로 감소. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면. 높은 생존을 달성하는 것이 중요합니다.따라서 신생아를 사용하고 심근세포에서 심장 조직을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 새로운 또는 기존 유전자 조작 마우스 라인을 사용 하 여, 이 방법은 쉽게 심장에 생물 에너지 조절에 대 한 새로운 메커니즘을 이해로 이어질 수 있는 데이터로 번역 될 수 있습니다. 미토콘드리아는 심장 기능에서 중요한 역할을 합니다.우리는 이 방법이 신진대사를 산화하고 심부전 을 치료하기 위한 새로운 치료 목표를 찾는 새로운 규제 기관 및 통로를 식별하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

연구

의학

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

비 침습 M-모드 초음파 심장 검진 법에 의한 마우스의 심장 박동의 자궁 측정

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

자율 기능 청소년 선수에 뇌 진 탕을 다음: 24 시간 녹화 방법론을 사용 하 여 심장 박동의 변화 탐구

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...