Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Vi vil gjerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbeidet er støttet av American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) og VA fortjeneste (BX003260) til R.S.R.

For arbeid med neonatal mus, henvises til lokale universitet/Institutt retningslinjer satt frem av dyr pleie programmer og følge sin institusjonelle og andre aktuelle bestemmelser. Alle metodene som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av UC San Diego institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og overholde føderale og statlige bestemmelser.
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>Forberede 25 mL før fordøyelsenløsning: HBSS (uten Ca2 + og Mg<s...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

I denne studien har vi etablert en enkel protokoll for å isolere og dyrking musen neonatale cardiomyocytes. Ved å bruke disse cardiomyocytes, optimalisert vi også betingelsene for å måle oksygen forbruksraten ved hjelp av en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gjør det mulig å bruke mus neonatale cardiomyocytes som et modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i de viktigste arbeider cellene av hjertet, som det skulle måles i intakt organ. Våre protokollen er fo...

For å opprettholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunksjon, må cardiomyocytes opprettholde en konstant tilførsel av cellular energi i form av ATP1. I hjertet genereres ca 95% av ATP mitokondriene, hovedsakelig gjennom oxidative fosforylering, viser at mitokondrier spiller en avgjørende rolle i bioenergetisk i hjertefunksjon2,3. Støtter denne forestillingen er at feilregulering mitokondrie funksjonen kan føre til kardiomyopati og hjertesvikt4,5. Omvendt, gjenopprette mitokondrie funksjonen har vist seg å forbedre hjertefunksjon av sviktende hjerte6,7. Derfor studerer mekanisme mitokondrie bioenergi og identifisere romanen regulatorer av mitokondrie funksjon i cardiomyocytes vil ikke bare avsløre mekanistisk innsikt i cardiac energiproduksjon, men også kunne gi innsikt som vil lede utviklingen av nye terapeutiske mål å behandle hjertesykdommer6,8.
Sammenlignet med hele hjerte, som inneholder en blanding av myocytter og ikke-myocytter9, cardiomyocyte kulturer er svært ren, med minimal forurensning av ikke-myocytter fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. I tillegg kan isolere cardiomyocytes fra neonatal pups dyrking et stort antall celler i en liten mengde tid, i forhold til skille celler fra voksen hjerter10,11. Viktigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse ganger (f.eks 24 h) og på lengre tid poeng de skille. Neonatal musen cardiomyocytes kan overleve og manipuleres opp 7 dager i kultur, noe som gjør dem ideelle for å teste effekten av stoffet forbindelser og gene manipulasjon funksjonen av mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, det er betydelige biologiske forskjeller mellom voksne og neonatal cellene, men lengre varighet tilgjengelig for kultur neonatal celler gjør dem passer for mange forskjellige typer studier, inkludert de av mitokondrie funksjon.
Hittil har primære kulturperler neonatal musen og rotten cardiomyocytes blitt brukt som modeller for å studere cardiac bioenergi12,13. De siste årene brukt studier en ekstracellulære flux analyserer å måle oksygen forbruksraten (OCR) og evaluere oksidativt kapasitet i musen og rotten neonatale cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, celle levedyktigheten til musen neonatale cardiomyocytes er lavere og har større variasjon16. Også gjør muligheten til å studere celler fra genmodifiserte musen modeller mus celle modell veldig viktig. Gitt at OCR studier er så følsom for tall og seeding tetthet, er utvikling av en reproduserbare, pålitelig og enkel protokoll konsekvent celle avkastning og levedyktighet nødvendig.
Her rapporterer vi et optimalisert protokollen som er utviklet som bruker kulturperler musen neonatale cardiomyocytes sammen med en 96-brønnen-format ekstracellulære flux analysator for OCR analyse. Denne protokollen øker sterkt reproduserbarhet til analysen. I tillegg protokollen ikke bare en roman og reproduserbar metode for OCR analyse, men også kan tilpasses til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, for eksempel det som kan være nødvendig å studere myofibrillære funksjoner og intracellulær signalveier.
Spesielt beskriver denne protokollen en dag fremgangsmåte for isolasjon og kultur neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønns celle kultur plate. I tillegg beskriver fremgangsmåten for å måle oksygenforbruk ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer. Alle løsningene som brukes er sterile eller sterilt filtrert. Alle verktøyene er steriliserte med 75% etanol. Vi tilbyr en Tabell for materiale for ulike deler av prosedyren. For dyrking cardiomyocytes, utføres alle prosedyrer og trinnene i standard celle kultur hette. Denne protokollen er utviklet for isolering av neonatal musen hjerter fra ett kull (ca 8-10 pups). Protokollen kan imidlertid også være tilpasset isolere cardiomyocytes fra mangfoldig søppel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitokondrier og oksidativt metabolisme er avgjørende for å opprettholde Hjertemuskel funksjon. Forskning har vist at mitokondrie dysfunksjon er en viktig medvirkende faktor til svekket cardiac funksjon i hjertesvikt. Derimot kan gjenopprette defekt mitokondrie funksjonen ha gunstige effekter å forbedre hjertefunksjon i sviktende hjertet. Derfor kan studere regulatoriske mekanismer og identifisere romanen regulatorer for mitokondrie funksjon gi innsikt som kan brukes til å utvikle nye terapeutisk mål for behandling av hjertesykdommer. Her, er hjerte myocyte mitokondrie åndedrett analysert ved hjelp av en unik celle kultur-systemet. Først er en protokoll optimalisert til å raskt finne og kultur høy levedyktighet neonatal musen cardiomyocytes. Deretter brukes en 96-brønns ekstracellulære flux analysator til å vurdere oksygen forbruksraten for disse cardiomyocytes. For denne protokollen, vi optimalisert seeding forhold og vist at neonatal musen cardiomyocytes oksygen forbruksraten lett kan vurderes i en ekstracellulære flux analyserer. Til slutt, vi oppmerksom på at våre protokollen kan brukes på større kultur og andre studier, som intracellulær signalering og kontraktile funksjon analyse.

Ved hjelp av protokollen beskrevet, ble hjerter isolert fra dag 0 neonatal pups. 5 x 105 celler/pup ble innhentet, og cardiomyocytes ble sådd i tettheter på 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/Vel, i 96 bra plater (figur 2A). Etter natten kultur, cardiomyocytes fant godt festet til belagt plast overflaten og det var svært få ledige celler (fristilt cellene vil fortsatt vises som runde og skinnende, sammenlig...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analysere oksygen forbruksraten i primære kulturperler musen neonatale Cardiomyocytes bruker en ekstracellulære Flux analyserer

Målet med denne protokollen er å illustrere hvordan du bruker musen neonatale cardiomyocytes som modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i hjertet.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Denne protokollen tillater oss å isolere og kultur høy bi-BBT, kjent bare for mus cardiomyocytes. For å evaluere mitokondriefunksjon kan oksygenforbruket av kardiomyocytter analyseres av en faktisk sølvfluksanalysator. En av fordelene med denne teknikken er at oksygenforbruk av kardiomyocytter lett kan måles i deres tilslutninger i 96-brønnsformat, noe som muliggjør testing av flere forhold med et stort antall repliker.Dette fartøyet gir viktig innsikt i forskningsområdet kardiologi. I tillegg til oksygenforbruk kan vi også studere andre metabolske parametere, som grågriser og peracid epoxidation. Å oppnå høy variasjon av kardiomyocytter er avgjørende for dette eksperimentet.Dette krever effektiv fordøyelse av hjerter. Siden nyfødte kardiomyocytter er svært skjøre, er skånsom håndtering av kardiomyocytter også viktig. I cellekulturhetten, aliquot 5ml HBSS til hver brønn av en 6-brønns celle kulturplate og legg den på is.I tillegg, aliquot 10ml hbss til en 10cm celle kultur parabolen, deretter forberede 20 ml Trypsin Predigestion løsning i en 50ml steril konisk rør. Hold alle løsningene på is. Deretter trekker du ut hjertet og overfører det umiddelbart til den sterile cellekulturfatet som inneholder HBSS.Fjern eventuelle gjenværende lungevev og større kar. Vask hjertet i HBSS med mild omrøring. Deretter skjærer du hjertet med fin saks i 8 stykker og overfører hjertevevet med tang til en brønn av en 6-brønns cellekulturplate med HBSS.Bruk en moria skje, vask hjertevevet ved å overføre det fra godt til godt i 6-brønnsplaten fylt med HBSS. Overfør deretter hjertevevet til et konisk rør som inneholder 20 ml Trypsin og inkubere med mild agitasjon ved 4 grader celsius i 4 timer. I denne prosedyren, prewarm collagenase fordøyelsesløsning i et vannbad på 37 grader celsius.Overfør det koniske røret som inneholder hjertevev og predigestion løsning fra 4 grader celsius til en cellekultur hette. La hjertevevet synke til bunnen av røret og fjern predigestionløsningen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Deretter legger du til 10 ml HBSS i røret.Resuspend hjertevevet med HBSS 2 til 3 ganger for å vaske ut Trypsin ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Aspirer HBSS og tilsett 10 ml prewarmed collagenase fordøyelsesløsning i røret med hjertevev. For første fordøyelse, inkuber røret med hjertevev i et vannbad ved 37 grader celsius i 10 minutter uten agitasjon.Etterpå overfører du røret til cellekulturhetten. Triturat vevet ved å gjenbruke det forsiktig 10 ganger ved hjelp av en 10ml serologisk pipette. Dette vil tillate hjertet å spre seg og cellene som skal frigjøres fra hjertevevet.La det ufordøyde vevet synke. Overfør den fordøyde løsningen beriket i kardiomyocytter til et nytt konisk rør og legg umiddelbart til en lik mengde cellekulturmedium for å stoppe kollagenasefordøyelsen. Tilsett deretter 10 ml kollagnasefordøyelsesløsning i røret som inneholder det gjenværende ufordøyde hjertevevet.For den andre fordøyelsen, inkuber røret med hjertevev i et 37 graders celsius vannbad i 10 minutter. Gjenta prosedyrene for den første fordøyelsen og overfør den fordøyde løsningen beriket i kardiomyocytter til et nytt konisk rør før du stopper kollagenasefordøyelsen. Deretter plasserer du en steril cellesil i et nytt sterilt 50 ml konisk rør.Før våt cellesilen med 2 til 3 ml cellekulturmedium og passerer cellene gjennom cellesilen. Skyll deretter cellesilen med cellekulturmedium. Deretter sentrifugerer det koniske røret som inneholder kardiomyocytter i 5 minutter ved 180 ganger tyngdekraften.Etter 5 minutter, aspirere det overnaturante og gjenoppusser cellepelleten i 10 ml cellekulturmedium. Plate cellene på en 10cm celle kultur rett og inkubere dem i en time. Etterpå, forsiktig agitate platen.Vask av de ikke-tilhengerne og gjenoppliv cellene ved gjentatte ganger å pipettere cellekulturmediet over parabolen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Deretter overfører du de ikke-tilhengerne til en ny 10cm cellekulturrett og inkuberer dem i en time til. Etter en time, forsiktig røre platen og vask av de ikke-tilhengerne celler.Overfør kardiomyocytter til et nytt 50 ml konisk rør. Deretter forbereder du en 96-brønns kulturplate ved å aliquoting 50 mikroliter belegg løsning i hver brønn av 96-brønner celle kultur plate. Hvis bobler er til stede, fjern dem ved hjelp av en 20 mikroliter pipette.Inkuber platen ved 37 grader celsius i minst en time for å tillate tørking av matrisebelegget. Deretter teller cellene ved hjelp av et hemocytometer. Plate cellene i den ekstra cellulære matrisebelagte 96-brønns cellekulturplaten med en tetthet mellom 10 og 30 tusen celler per brønn.Og plasser cellene i inkubateren. For å forhåndsforme oksygenforbruksanalysen, hydrere en fluxanalysatorsensorkassett i minst 3 timer, tilsett 200 mikroliter kalibrantløsning i hver brønn av nytteplaten. Plasser sensorkassetten tilbake på nytteplaten og inkuber i 37 grader celsius uten CO2- eller O2-tilskudd i minst 3 timer.En time før analysen fjerner du forsiktig cellekulturmediet og vask cellene med 200 mikroliter med forkrigede mitokondriestresstestmedium to ganger. Etter den andre vasken, legg til 175 mikroliter med forkrigede mitokondriestresstestmedium. Deretter kultur cellene på 37 grader celsius uten karbondioksid eller oksygen tilskudd.Forbered 3 ml av hver av testforbindelsene i mitokondriestresstestmedium. Legg 25 mikroliter av hver forbindelse i injektorportene på sensorkassetten ved hjelp av en flerkanals pipette. Tilstanden til cellene og eventuelle forbehandlinger kan påvirke maksimal restaurering fremkalt ved injeksjon av ukoupler FCCP.Cellefølsomhet for uncoupler kan også endres, derfor er det viktig å optimalisere arbeidskonsentrasjonen av FCCP for hver enkelt behandling. Deretter setter du opp ekstra cellulær fluksanalyseprotokoll og starter programmet. Først setter du sensorkartiridge inn i maskinen for kalibrering.Skift ut kalifaren for analyseplaten når kalibreringstrinnet er ferdig. Hvis ønskelig, etter analysen, forsiktig kaste alle analysemedier ved hjelp av en flerkanals pipette. Og lagre cellekulturen mircoplate ved negative 20 grader celsius for fremtidig celle normalisering ved hjelp av proteinanalyse.Ved å bruke protokollen som er beskrevet, ble hjerter isolert fra dag 0 neonatalvalper og kardiomyocytter ble seeded på tettheter på 10, 20 eller 30 tusen celler per brønn i 96-brønnplater. Etter overnattingskulturen ble kardiomyocytter funnet godt festet til den belagte plastoverflaten, og det var svært få ufestede celler. På dette tidspunktet var spontant kontraherende kardiomyocytter lett synlige.En såetetthet på 30 000 celler per brønn viste samløpet en dag etter såing da cellene spredte seg. Kardiomyocytter ble immunostained med et antistoff mot sarkomerisk alfa actinin, en kardiomyocytt spesifikk markør. Som vist her, de fleste av cellene viste positiv farging av alfa actinin indikerer den høye renheten av kardiomyocytt isolasjon.En ordning med en typisk mitokondriestresstest er vist her. Mitokondriestresstesten starter med en baselinjemåling av oksygenforbruket, dette etterfølges av injeksjonen av Oligo myosin som hemmer ATPAs. Deretter ble frakoblingsmiddelet FCCP injisert for å måle maksimal oksygenforbrukshastighet.Til slutt, med injeksjon av to elektron transport komplekse hemmere, mitokondrie respirasjon helt stopper og OCR reduseres til sitt laveste nivå. For å oppnå konsistente og reproduserbare resultater. Det er avgjørende å oppnå høy overlevelse.Derfor er det viktig å bruke nyfødte nyfødte og forsiktig håndtert hjertevev i kardiomyocytter. Ved å bruke nye eller eksisterende genetisk manipulerte muselinjer, kan denne metoden enkelt oversettes til data som kan føre til forståelse av nye mekanismer for bioenergetisk regulering i hjertet. Mitokondrie spiller sentrale roller i hjertefunksjonen.Vi forventer at denne metoden vil bidra til å identifisere nye regulatorer og veier som regulerer oksiderende metabolisme og finner nye terapeutiske mål for behandling av hjertesvikt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse av Blood Flow og oksygenforbruk i Nedsatt mikrosirkulasjonen: Søknad til akutt hepatitt Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I utero Måling av puls i Mouse av invasiv M-modus Ekkokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; I Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Bakre halvsirkelformet kanalen tilnærming for indre øret gen levering i Neonatal musen

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Autonome funksjon etter hjernerystelse i unge idrettsutøvere: en utforskning av hjertefrekvensen med 24-timers opptak metodikk

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetikk undersøkelse av Candida albicans bruker Real-time ekstracellulære Flux analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...