Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório de Murphy e laboratório de Ross. Este trabalho é apoiado pela associação americana do coração (14SDG17790005) para Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e mérito de VA (BX003260) para R.S.R.

Para trabalho com ratos neonatais, por favor consulte a universidade local/Instituto conjunto de diretrizes adiante pelos programas de cuidados com animais e aderir a institucionais e outros regulamentos adequados. Todos os métodos descritos no presente protocolo tenham sido aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e UC San Diego institucional Cuidado Animal e aderirem aos regulamentos federais e estaduais.
1. preparação dos reagentes
<ol><li>Prepare-se 25 mL da solução de pré-dig...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

Neste estudo, nós estabelecemos um protocolo simples para isolar e cultivar cardiomyocytes neonatal do mouse. Usando estes cardiomyocytes, nós também Aperfeiçoamos as condições para medir a taxa de consumo de oxigênio por meio de um sistema analisador de fluxo extracelular. O protocolo permite que se use rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio nas células de trabalho principal do coração, semelhante ao que seria medido no órgã...

Para sustentar uma função contrátil cardíaca contínua, cardiomyocytes deve manter um fornecimento constante de energia celular, principalmente na forma de ATP1. No coração, aproximadamente 95% de ATP é gerado pela mitocôndria, principalmente através da fosforilação oxidativa, mostrando que as mitocôndrias desempenham um papel bioenergético crucial na função cardíaca2,3. Esta noção de apoio é que a desregulação da função mitocondrial pode levar a miocardiopatia e insuficiência cardíaca4,5. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial foi mostrado para melhorar a função cardíaca de falhar o coração6,7. Portanto, estudar o mecanismo de bioenergética mitocondrial e identificando novos reguladores da função mitocondrial em cardiomyocytes não revelarei apenas insights mecanicistas de produção de energia cardíaca, mas também poderiam fornecer uma visão que vai levar para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para tratar doenças cardíacas6,8.
Em comparação com todo o coração, que contém uma mistura de miócitos e miócitos não9, casos de culturas são extremamente puro, com contaminação mínima de non-miócitos do coração, como fibroblastos e células endoteliais10. Além disso, isolar cardiomyocytes de filhotes neonatais permite cultivo um grande número de células em uma pequena quantidade de tempo, em comparação com células isolantes de corações adultos10,11. Mais importante ainda, principal do rato adulto culto cardiomyocytes têm curta sobrevivência vezes (por exemplo, 24 h) e no tempo mais pontos de diferenciam. Cardiomyocytes rato neonatal pode sobreviver e ser manipulado por mais de 7 dias em cultura, tornando-os ideais para testar os efeitos dos compostos de drogas e manipulação genética sobre a função das mitocôndrias em cardiomyocytes10. Claro, existem significativas diferenças biológicas entre as células de adultas e Neonatais, mas a duração mais longa disponível para cultura de células neonatais fá-los apropriados para diversos tipos de estudos, incluindo os da função mitocondrial.
Até à data, principal culto neonatal camundongo e rato cardiomyocytes têm sido utilizados como modelos para estudar bioenergética cardíaca12,13. Nos últimos anos, estudos utilizados um analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e avaliar a capacidade oxidativa em camundongo e rato neonatal cardiomyocytes14,15. Enquanto comparado com ratos, a viabilidade celular de rato cardiomyocytes neonatal é mais baixa e tem maior variabilidade16. Também, a capacidade de estudar células de modelos do rato geneticamente o modelo de célula de rato faz muito importante. Dado que os estudos de OCR são tão sensíveis ao celular número e densidade de semeadura, desenvolvimento de um protocolo simples, confiável e reprodutível para alcançar a viabilidade e rendimento consistente da célula é necessário.
Aqui, nós relatamos um protocolo otimizado que tem sido desenvolvido que usa culta rato neonatal cardiomyocytes juntamente com um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato para análise de OCR. Este protocolo aumenta a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, o protocolo não só fornece um método reprodutível para análise de OCR e romance, mas também pode ser adaptado para uma cultura de tamanho maior para outros fins experimentais, como a que pode ser necessária para estudar funções miofibrilar e intracelular vias de sinalização.
Em particular, este protocolo descreve um procedimento de um dia para isolamento e cultura de rato neonatal cardiomyocytes em uma placa de cultura de células 96 poços. Além disso, ele descreve o procedimento para medir o consumo de oxigênio, usando um analisador de fluxo extracelular. Todas as soluções utilizadas são estéreis ou filtrado estéril. Todas as ferramentas são esterilizadas por 75% de etanol. Nós fornecemos uma Tabela de materiais para várias partes do processo. Para cultivo cardiomyocytes, todos os procedimentos e as etapas são executadas em uma capa de cultura de célula padrão. Este protocolo é desenvolvido para o isolamento de corações de rato neonatal de uma ninhada (aproximadamente 8-10 filhotes). No entanto, o protocolo também pode ser adaptado para isolar cardiomyocytes de várias ninhadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitocôndrias e metabolismo oxidativo são essenciais para manter a função do músculo cardíaco. A pesquisa mostrou que a disfunção mitocondrial é um importante fator contribuinte para insuficiência cardíaca encontrada na insuficiência cardíaca. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial defeituosa pode ter efeitos benéficos para melhorar a função cardíaca no coração falhar. Portanto, estudar os mecanismos de regulação e identificando novos reguladores de função mitocondrial poderiam fornecer uma visão que poderia ser usada para desenvolver novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças cardíacas. Aqui, a respiração mitocondrial miócito cardíaco é analisada usando um sistema de cultura de célula única. Primeiro, um protocolo foi otimizado para isolar rapidamente e cultura alta viabilidade neonatal do mouse cardiomyocytes. Então, um analisador de fluxo extracelular de 96 poços formato é usado para avaliar a taxa de consumo de oxigênio destas cardiomyocytes. Para este protocolo, nós otimizado semeadura condições e demonstrou que essa taxa de consumo de oxigênio de cardiomyocytes rato neonatal pode ser facilmente avaliada em um analisador de fluxo extracelular. Finalmente, notamos que nosso protocolo pode ser aplicado a um tamanho maior de cultura e outros estudos, tais como sinalização intracelular e contrátil função de análise.

Usando o protocolo descrito, corações foram isoladas de filhotes neonatal dia 0. 5 x 105 células/filhote foram obtidos, e cardiomyocytes foram semeadas em densidades de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço, em 96 placas bem (Figura 2A). Depois da cultura durante a noite, foram encontrados cardiomyocytes bem anexado à superfície revestida de plástico e havia muito poucas células solteira (as células n...

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Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Este protocolo nos permite isolar e cultivar alto bi-BBT, conhecido apenas pelos cardiomiócitos do rato. Para avaliar a função mitocondrial, a taxa de consumo de oxigênio dos cardiomiócitos pode ser analisada por um analisador de fluxo de prata real. Uma das vantagens dessa técnica é que o consumo de oxigênio de cardiomiócitos pode ser facilmente medido em seu estado de aderente em formato de 96 poços, o que permite o teste de múltiplas condições com um grande número de réplicas.Esta embarcação fornece importantes insights sobre a área de pesquisa da cardiologia. Além do consumo de oxigênio, também podemos estudar outros parâmetros metabólicos, como agrices cinza e a epóxida peraciada. Alcançar alta variabilidade de cardiomiócitos é fundamental para este experimento.Isso requer uma digestão eficiente dos corações. Uma vez que os cardiomiócitos neo-natal são muito frágeis, o manuseio suave de cardiomiócitos também é importante. Na capa de cultura celular, alíquota de 5ml de HBSS para cada poço de uma placa de cultura celular de 6 poços e colocá-lo no gelo.Além disso, aliquot 10ml de HBSS para um prato de cultura celular de 10cm, em seguida, preparar 20 ml de solução de Predigestion Trypsin em um tubo cônico estéril de 50ml. Mantenha todas as soluções no gelo. Em seguida, extraia o coração e transfira-o imediatamente para o prato de cultura celular estéril contendo HBSS.Remova qualquer tecido pulmonar residual e vasos maiores. Lave o coração no HBSS usando agitação suave. Posteriormente, corte o coração com uma tesoura fina em 8 pedaços e transfira o tecido cardíaco com fórceps em um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com HBSS.Usando uma colher de moria, lave o tecido cardíaco transferindo-o de poço para poço na placa de 6 poços cheia de HBSS. Em seguida, transfira o tecido cardíaco para um tubo cônico contendo 20ml de Trippsin e incubar com agitação suave a 4 graus celsius por 4 horas. Neste procedimento, pré-aquecimento a solução de digestão de colagenase em um banho de água a 37 graus celsius.Transfira o tubo cônico contendo tecido cardíaco e solução de predileção de 4 graus celsius para uma capa de cultura celular. Deixe o tecido cardíaco afundar até o fundo do tubo e remova a solução de predileção usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, adicione 10ml de HBSS no tubo.Resuspenja o tecido cardíaco com HBSS 2 a 3 vezes para lavar a Trippsin usando uma pipeta sorológica de 10ml. Aspire HBSS e adicione 10ml de solução de digestão de colagem pré-w armada no tubo com tecido cardíaco. Para a primeira digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água a 37 graus celsius por 10 minutos sem agitação.Depois, transfira o tubo para o capô da cultura celular. Triturar o tecido reutilizando-o suavemente 10 vezes usando uma pipeta sorológica de 10ml. Isso permitirá que o coração se disperse e as células sejam liberadas do tecido cardíaco.Deixe o tecido não digerido afundar. Transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico e adicione imediatamente uma quantidade igual de meio de cultura celular para parar a digestão da colagemnase. Em seguida, adicione 10ml de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido cardíaco não digerido restante.Para a segunda digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água de 37 graus celsius por 10 minutos. Repita os procedimentos da primeira digestão e transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico antes de parar a digestão da colagemnase. Em seguida, coloque um coador de células estéreis em um novo tubo cônico estéril de 50ml.Pré-molhar o coador celular com 2 a 3 ml de meio de cultura celular e passar as células através do coador celular. Posteriormente, enxágue o coador celular com meio de cultura celular. Em seguida, centrífuga o tubo cônico contendo cardiomiócitos por 5 minutos a 180 vezes a gravidade.Após 5 minutos, aspire o supernaspe e resuspense a pelota celular em 10ml de meio de cultura celular. Coloque as células em um prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por uma hora. Depois, agitar suavemente o prato.Lave as células não aderentes e resuspenja as células, encanar repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, transfira as células não aderentes para um novo prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por mais uma hora. Depois de uma hora, agitar suavemente a placa e lavar as células não aderentes.Transfira os cardiomiócitos para um novo tubo cônico de 50ml. Em seguida, prepare uma placa de cultura de 96 poços, aliquoting 50 microliters de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura celular de 96 poços. Se as bolhas estiverem presentes, remova-as usando uma pipeta de 20 microliter.Incubar a placa a 37 graus celsius por pelo menos uma hora para permitir a secagem do revestimento da matriz. Em seguida, conte as células usando um hemótmetro. Coloque as células na matriz extra-celular revestida de placa de cultura celular de 96 poços a uma densidade entre 10 a 30 mil células por poço.E coloque as células na incubadora. Para pré-formar o ensaio de consumo de oxigênio, hidrate um cartucho de sensor analisador de fluxo por pelo menos 3 horas, adicione 200 microliters de solução calibrante em cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor de volta na placa do utilitário e incubar em 37 graus celsius sem suplementação de CO2 ou O2 por pelo menos 3 horas.Uma hora antes do ensaio, remova suavemente o meio de cultura celular e lave as células com 200 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado duas vezes. Após a segunda lavagem, adicione 175 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado. Em seguida, cultura as células a 37 graus celsius sem dióxido de carbono ou suplementação de oxigênio.Prepare 3ml de cada um dos compostos de teste no meio de teste de estresse mitocondrial. Carregue 25 microliters de cada composto nas portas injetoras do cartucho do sensor usando uma pipeta multicanal. O estado das células e quaisquer pré-tratamentos podem afetar a restauração máxima provocada pela injeção de fccp desacoplador.A sensibilidade celular ao desacoplador também pode mudar, portanto, é fundamental otimizar a concentração de trabalho do FCCP para cada tratamento específico. Posteriormente, configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular e inicie o programa. Primeiro, coloque o sensor cartiridge na máquina para calibração.Substitua o calibrante para a placa de ensaio quando a etapa de calibração for feita. Se desejar, após o ensaio, descarte cuidadosamente todo o meio de ensaio usando uma pipeta multicanal. E armazene a cultura celular mircopolando a 20 graus celsius negativos para futura normalização celular usando ensaio proteico.Por meio do protocolo descrito, os corações foram isolados a partir do dia 0 filhotes neo-natal e cardiomiócitos foram semeados em densidades de 10, 20 ou 30 mil células por poço em placas de 96 poços. Após a cultura da noite para o dia, os cardiomiócitos foram encontrados bem ligados à superfície de plástico revestida e havia muito poucas células não ligadas. Neste ponto, cardiomiócitos que contraíam espontaneamente eram facilmente visíveis.Uma densidade de semeadura de 30.000 células por poço mostrou confluência um dia após a semeadura à medida que as células se espalhavam. Os cardiomiócitos foram imunossuados com um anticorpo contra a actina alfa sarcomerica, um marcador específico de cardiomiócito. Como mostrado aqui, a maioria das células mostrou coloração positiva de alfa actinin indicando a alta pureza do isolamento cardiomiócito.Um esquema de um típico teste de estresse mitocondrial é mostrado aqui. O teste de estresse mitocondrial começa com uma medição da linha base da taxa de consumo de oxigênio, seguida pela injeção de minosina Oligo que inibe atpa's. Em seguida, o agente de desacoplamento FCCP foi injetado para medir a taxa máxima de consumo de oxigênio.Finalmente, com a injeção de dois inibidores complexos de transporte de elétrons, a respiração mitocondrial pára completamente e o OCR diminui para seu nível mais baixo. Para obter resultados consistentes e reprodutíveis. É fundamental alcançar alta sobrevivência.Por isso, é importante usar recém-nascidos recém-nascidos e tecidos cardíacos manuseados suavemente em cardiomiócitos. Usando linhas de camundongos novas ou existentes geneticamente manipuladas, este método pode ser facilmente traduzido para dados que podem levar à compreensão de novos mecanismos para a regulação bioenergérica no coração. Mitocondrial desempenham papéis-chave na função cardíaca.Esperamos que este método ajude a identificar novos reguladores e caminhos que regulam o metabolismo oxidante e encontrem novos alvos terapêuticos para o tratamento da insuficiência cardíaca.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Medicina

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Função autonómica após concussão em jovens atletas: uma exploração da variabilidade da frequência cardíaca, usando a metodologia de gravação de 24 horas

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...