Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех Росс лаборатории и лаборатории членов Мерфи. Эта работа поддерживается американской ассоциации сердца (14SDG17790005) клуба NIH (HL115933, HL127806) и заслуги ва (BX003260) для R.S.R.

Для работы с новорожденных мышей пожалуйста, обратитесь к набору руководящих принципов местного университета/института вперед программами ухода за животными и придерживаться своих институциональных и других соответствующих правил. Все методы, описанные в настоящем протоколе были о?...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

В этом исследовании мы создали простой протокол для изоляции и культивирования мыши неонатальной кардиомиоцитов. Используя эти кардиомиоцитов, мы также оптимизировали условий для измерения скорости потребления кислорода с помощью системы анализатора внеклеточного потока. Протокол ...

Для поддержания непрерывной сократительной функции сердца, кардиомиоцитов должны поддерживать постоянную поставку клеточной энергии в виде АТФ1. В самом центре около 95% АТФ генерируется митохондрий, главным образом через окислительное фосфорилирование, показаны, что митохондрии играть решающую роль биоэнергетический в сердечной функции2,3. Поддерживая это понятие, что dysregulation митохондриальной функции может привести к сердечной недостаточности и кардиомиопатия4,5. И наоборот, восстановление функции митохондрий было показано для улучшения сердечной функции неисправного сердце6,7. Таким образом изучая механизм митохондриальной биоэнергетики и выявления роман регуляторы митохондриальной функции в cardiomyocytes будет не только выявить механистический идеи производства сердечной энергии, но также может обеспечить понимание того, что приведет для развития новых терапевтических целей для лечения заболеваний сердца6,8.
По сравнению с всем сердцем, который содержит смесь миоцитов и не миоцитах9, cardiomyocyte культур очень чистый, с минимальным загрязнением не миоцитах от сердца, таких как фибробластов и эндотелиальных клеток10. Кроме того изоляция кардиомиоцитов из новорожденных щенков позволяет культивирование большое количество клеток в небольшом количестве времени, по сравнению с переключательным клетки от взрослых сердец10,11. Самое главное культивированный взрослых мыши кардиомиоцитов имеют короткие выживания раз (например, 24 ч) и на длительное время точек де продифференцируйте. Cardiomyocytes новорожденных мыши может выжить и манипулировать для свыше 7 дней в культуре, что делает их идеальными для тестирования воздействия наркотиков соединений и генные манипуляции на функцию митохондрий в cardiomyocytes10. Конечно Существуют значительные биологические различия между клетками взрослых и новорожденных, но дольше продолжительность культуре клеток новорожденных делает их подходящими для различных типов исследований, в том числе митохондриальной функции.
На сегодняшний день основной культурный новорожденных крыс и мышей кардиомиоцитов используются в качестве модели для изучения сердца Биоэнергетика12,13. В последние годы исследования используется анализатор внеклеточного потока для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и оценки окислительного потенциала в мышь и крыса неонатальной кардиомиоцитов14,15. Хотя по сравнению с крысами, жизнеспособность клеток новорожденных кардиомиоцитов мыши ниже и имеет большую изменчивость16. Кроме того возможность изучать клетки генетически модифицированные мыши модели делает ячеечная модель мыши очень важно. Учитывая, что OCR исследования настолько чувствительны к ячейке количество и плотность посева, необходима разработка воспроизводимых, надежной и простой протокол для достижения последовательного клеток урожайность и жизнеспособности.
Здесь мы приводим оптимизированный протокол, который был разработан, который использует культивировали мыши неонатальной кардиомиоцитов наряду с 96-хорошо формат внеклеточного потока анализатор для анализа OCR. Этот протокол значительно увеличивает воспроизводимость анализа. Кроме того протокол не только обеспечивает Роман и воспроизводимый метод для анализа OCR, но также могут быть адаптированы к культуре большего размера для других экспериментальных целей, например, которые могут быть необходимы для изучения миофибрилл функций и внутриклеточной сигнальные пути.
В частности этот протокол описывает один день процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов неонатальной мыши в пластине культуры 96-луночных клеток. Кроме того он описывает процедуру для измерения потребления кислорода с помощью анализатора внеклеточного потока. Все решения, используемые в стерильную или стерильной фильтрации. Все инструменты стерилизуются, 75% этанола. Мы предоставляем Таблицу материалов для различных частей процедуры. Для культивирования кардиомиоцитов, все процедуры и шаги выполняются в капюшоне культуры стандартной ячейки. Этот протокол разработан для изоляции сердца новорожденных мыши из одного помета (примерно 8-10 щенков). Однако протокол также может быть адаптирована для изоляции кардиомиоцитов из нескольких пометов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Митохондрии и окислительного метаболизма являются критическими для поддержания функции сердечной мышцы. Исследования показали, что митохондриальной дисфункции является важным фактором для нарушения функции сердца, в сердечной недостаточности. Контрастом восстановление дефектных митохондриальной функции может иметь благоприятные последствия для улучшения сердечной функции, в противном случае сердце. Таким образом изучая механизмы регулирования и выявления роман регуляторы для функции митохондрий может обеспечить понимание, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических целей для лечения болезни сердца. Здесь сердечной myocyte митохондриальное дыхание анализируется с использованием системы культуры уникальный клеток. Во-первых протокол был оптимизирован для быстро изолировать и культура высокой жизнеспособности новорожденного мыши кардиомиоцитов. Затем анализатор внеклеточного поток 96-луночных формат используется для оценки норма расхода кислорода этих кардиомиоцитов. Для этого протокола мы оптимизирована посева условий и продемонстрировал, что темпы потребления кислорода кардиомиоцитов неонатальной мыши можно легко оценивать внеклеточного потока анализатора. Наконец мы отмечаем, что наш протокол может быть применен к большим размером культуры и другие исследования, такие как внутриклеточной сигнализации и сократительной функции анализа.

С помощью протокола описаны, сердца были изолированы от день 0 новорожденных щенков. 5 x 105 клеток/щенка были получены, и кардиомиоцитов были осеменены на плотности 10 x 103, 20 x 103или 30 x 103 клеток/Ну, в 96 хорошо пластины (рис. 2A). После ноч?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Анализ скорости потребления кислорода в неонатальной кардиомиоцитов культивировали мыши с помощью анализатора внеклеточного потока

Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы проиллюстрировать использование мыши неонатальной cardiomyocytes как модель системы для изучения, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в самом сердце.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Этот протокол позволяет изолировать и культуры высокой би-BBT, известный только мыши кардиомиоцитов. Для оценки митохондриальной функции, уровень потребления кислорода кардиомиоцитов может быть проанализирован фактическим анализатором потока серебра. Одним из преимуществ этого метода является то, что потребление кислорода кардиомиоцитов можно легко измерить в их адептном состоянии в формате 96-колодец, что позволяет тестировать несколько условий с большим количеством репликаций.Это судно дает важное представление об исследовательской области кардиологии. В дополнение к потреблению кислорода, мы также можем изучить другие метаболические параметры, такие как серые сердики и перацидная эпоксидная эпоксидация. Достижение высокой изменчивости кардиомиоцитов имеет решающее значение для этого эксперимента.Это требует эффективного пищеварения сердца. Поскольку неонатные кардиомиоциты очень хрупкие, мягкое обращение с кардиомиоцитами также имеет важное значение. В капюшоне культуры клетки, aliquot 5ml HBSS к каждому наилучшим образом плиты культуры клетки 6-хорошо и поместите ее на лед.Кроме того, aliquot 10 мл HBSS к 10см клеточной культуры блюдо, то, подготовить 20 мл трипсина Predigestion раствор в 50 мл стерильной конической трубки. Храните все растворы на льду. Затем извлекайте сердце и немедленно перенесите его в стерильное блюдо клеточной культуры, содержащее HBSS.Удалите остатки легочной ткани и более крупных сосудов. Вымойте сердце в HBSS с помощью нежного возбуждения. Впоследствии разрежьте сердце мелкими ножницами на 8 частей и перенесите сердечную ткань с типсами в один колодец 6-хорошо клеточной культуры пластины с HBSS.Используя ложку мории, мыть ткани сердца, передавая его из хорошо хорошо в 6-хорошо пластины заполнены HBSS. Затем перенесите сердечную ткань в коническую трубку, содержащую 20 мл трипсина, и инкубировать с нежным возбуждением при 4 градусах цельсия в течение 4 часов. В этой процедуре, довоенная раствор пищеварения коллагеназы в водяной бане при 37 градусах по Цельсию.Перенесите коническую трубку, содержащую сердечную ткань и раствор для предварительного потребления, с 4 градусов по Цельсию на капюшон клеточной культуры. Пусть ткани сердца опускаются на дно трубки и удалить раствор предварительного потребления с помощью 10 мл серологического пипетки. Затем добавьте 10 мл HBSS в трубку.Повторное использование сердечной ткани с HBSS 2 до 3 раз, чтобы вымыть трипсин с помощью 10 мл серологической пипетки. Аспират HBSS и добавить 10 мл довоенной коллагеназы пищеварения раствор в трубку с сердечной ткани. Для первого пищеварения, инкубировать трубку с ткани сердца в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут без возбуждения.После этого перенесите трубку на капот клеточной культуры. Тритурировать ткани, повторно используя его осторожно 10 раз с помощью 10 мл серологического пипетки. Это позволит сердцу разойтись и клетки, которые будут освобождены от сердечной ткани.Пусть непереваренная ткань утонет. Перенесите переваренный раствор, обогащенный кардиомиоцитами, в новую коническую трубку и немедленно добавьте равное количество среды клеточной культуры, чтобы остановить пищеварение коллагеназы. Затем добавьте 10 мл раствора пищеварения коллагеназы в трубку, содержащую оставшуюся непереваренную сердечную ткань.Для второго пищеварения, инкубировать трубку с сердечной ткани в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 минут. Повторите процедуры первого пищеварения и перенесите усваиваемый раствор, обогащенный кардиомиоцитами, в новую коническую трубку перед остановкой пищеварения коллагеназы. Затем поместите стерильный клеточный ситечко в новую стерильную коническую трубку 50 мл.Предварительно влажный клеточный ситечко с 2 до 3 мл среды клеточной культуры и пройти клетки через ситечко клетки. Впоследствии, промойте ситечко клетки с средством культуры клетки. Затем центрифуга конической трубки, содержащей кардиомиоциты в течение 5 минут при 180-времени гравитации.Через 5 минут, аспирировать супернатант и повторное течение клеток гранулы в 10 мл клеточной культуры среды. Плита клетки на 10см клеточной культуры блюдо и инкубировать их в течение одного часа. После этого осторожно агитировать тарелку.Смойте непритеняемые клетки и resuspend клетки, неоднократно трубопроводов клеточной культуры среды над блюдом с помощью 10 мл серологической пипетки. Затем перенесите неприемные клетки в новое блюдо культуры клеток 10 см и инкубировать их еще на час. Через час осторожно агитировать тарелку и смыть неприемные клетки.Перенесите кардиомиоциты в новую коническую трубку 50 мл. Далее, подготовить 96-хорошо культуры пластины путем aliquoting 50 микролитров покрытия раствора в каждом хорошо из 96-хорошо пластины культуры клеток. Если пузырьки присутствуют, удалите их с помощью 20 микролитров пипетки.Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере один час, чтобы сушка матричного покрытия. Затем посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Плита клеток в экстра-клеточной матрицы покрытием 96-хорошо пластины клеточной культуры при плотности от 10 до 30 тысяч клеток на колодец.И поместите клетки в инкубационный. Чтобы предварительно проработать анализ потребления кислорода, увлажняйте картридж датчика датчика потока в течение не менее 3 часов, добавьте 200 микролитров раствора калибранта в каждую колодец полезной пластины. Поместите сенсорный картридж обратно на утилиту пластины и инкубировать в 37 градусов по Цельсию без CO2 или O2 добавок, по крайней мере 3 часа.За час до анализа аккуратно удалите среду клеточной культуры и дважды промыте клетки 200 микролитров предварительной митохондриальной стресс-тестовой среды. После второй стирки добавьте 175 микролитров довоенной митохондриальной среды стресс-теста. Затем культуры клеток при 37 градусов по Цельсию без углекислого газа или кислорода добавок.Подготовка 3 мл каждого из тестовых соединений в митохондриальной среде стресс-теста. Загрузите 25 микролитров каждого соединения в инжекторные порты сенсорного картриджа с помощью многоканарной пипетки. Состояние клеток и любые предварительные обработки могут повлиять на максимальное восстановление, вызванное инъекцией uncoupler FCCP.Чувствительность клеток к uncoupler также может измениться, поэтому крайне важно оптимизировать рабочую концентрацию FCCP для каждого конкретного лечения. Впоследствии найте протокол анализа внеклеточного потока и запустите программу. Во-первых, положить датчик cartiridge в машину для калибровки.Замените калибровку на анализную пластину после того, как будет сделан шаг калибровки. При желании, после анализа, тщательно отбросьте все анализы среды с помощью многоканаражной пипетки. И хранить миркоплат клеточной культуры при отрицательном 20 градусов по Цельсию для будущей нормализации клеток с использованием анализа белка.Используя описанный протокол, сердца были изолированы от 0-го дня неонатальные щенки и кардиомиоциты были посеяны при плотности 10, 20 или 30 тысяч клеток на колодец в 96-хорошо пластин. После ночной культуры, кардиомиоциты были найдены хорошо прикреплены к покрытой пластиковой поверхности и было очень мало непривязанных клеток. В этот момент, спонтанно контракт кардиомиоцитов были легко видны.Плотность посева 30 000 клеток на колодец показала слияние на следующий день после посева по мере распространения клеток. Кардиомиоциты были иммуноминистерами с антителом против саркомерного альфа актинина, кардиомиоцитов специфический маркер. Как показано здесь, большинство клеток показали положительное окрашивание альфа-актинина, указывающее на высокую чистоту изоляции кардиомиоцитов.Здесь показана схема одного типичного митохондриального стресс-теста. Митохондриальный стресс-тест начинается с измерения базовой линии скорости потребления кислорода, за этим следует инъекция миозин олиго, который подавляет ATPA. Затем для измерения максимальной скорости потребления кислорода был введен размежевающий агент FCCP.Наконец, с инъекцией двух ингибиторов электронного транспортного комплекса митохондриальное дыхание полностью прекращается, а OCR уменьшается до самого низкого уровня. Для получения последовательных и воспроизводимых результатов. Очень важно достичь высокой выживаемости.Поэтому важно использовать новорожденных новорожденных и аккуратно обрабатывать ткани сердца в кардиомиоцитах. Используя новые или существующие генетически манипулируемые линии мыши, этот метод можно легко перевести на данные, которые могут привести к пониманию новых механизмов биоэнергетического регулирования в сердце. Митохондриальные играют ключевую роль в функции сердца.Мы ожидаем, что этот метод поможет определить новые регуляторы и пути, регулирующие окисляющий метаболизм и найти новые терапевтические цели для лечения сердечной недостаточности.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Внутриутробное Измерение пульса у мышей с помощью неинвазивной М-режиме эхокардиографии

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Неонатальной спинного мозга мыши Сжатие Травма Модель

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как<em&gt; In Vitro</em&gt; Инструмент скрининга в исследованиях слуха

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Задняя полукружных канала подход для доставки генов внутреннего уха у новорожденных мышей

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Вегетативные функции, после сотрясения мозга в молодежных спортсменов: исследование вариабельности сердечного ритма, с использованием методологии, 24-часовая запись

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Биоэнергетика расследование Candida albicans с помощью реального времени внеклеточного потока анализа

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Оценка сердечной функции с использованием кожистого кардиомиоцита

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...