Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Vi vill tacka alla Ross lab och Murphy lab medlemmar. Detta arbete stöds av American Heart Association (14SDG17790005) till YC NIH (HL115933, HL127806) och VA Merit (BX003260) till R.S.R.

För arbete med neonatala möss, vänligen se lokala universitet/institut riktlinjer ställa fram av djurvård program och följa sin institutionella och andra lämpliga regler. Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av UC San Diego institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och följa federala och statliga förordningar.
1. beredning av reagens
<ol><li>Förbereda 25 mL före rötning lösning: HBSS (utan Ca2 + och Mg2 +<...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

I denna studie har vi etablerat ett enkelt protokoll för isolera och odla mus neonatal hjärtmuskelcellerna. Genom att använda dessa hjärtmuskelceller, optimerad vi också förutsättningar för att mäta syre materialåtgången genom att använda ett extracellulära flux analyzer system. Protokollet tillåter en att använda mus neonatal hjärtmuskelcellerna som modellsystem för att undersöka hur olika faktorer kan förändra syreförbrukning i huvudsakliga fungerande celler i hjärtat, besläktad med vad som skull...

För att upprätthålla en kontinuerlig kontraktila hjärtfunktion, måste hjärtmuskelceller upprätthålla en konstant tillförsel av cellulär energi främst i form av ATP1. I hjärtat genereras cirka 95% av ATP av mitokondrierna, främst genom oxidativ fosforylering, visar att mitokondrierna spelar en avgörande roll för bioenergetiska i hjärtfunktion2,3. Stödja detta begrepp är att dysreglering av mitokondriefunktion kan leda till kardiomyopati och hjärtsvikt4,5. Omvänt, återställa mitokondriefunktion har visat sig förbättra hjärtfunktionen av sviktande hjärta6,7. Därför studera mekanismen av mitokondriell Bioenergetik och identifiera nya regulatorer av mitokondriell funktion i hjärtmuskelcellerna avslöjar inte bara mekanistiska insikter av hjärtats energiproduktion men också kunde ge insikt som kommer att leda till utvecklingen av nya terapeutiska mål att behandla hjärtsjukdomar6,8.
Jämfört med hela hjärtat, som innehåller en blandning av myocyter och icke-myocyter9, hjärtmuskelcellen kulturer är extremt rent, med minimal nedsmutsning av icke-myocyter från hjärtat, såsom fibroblaster och endotelceller10. Dessutom isolera hjärtmuskelcellerna från neonatala valpar möjliggör odling ett stort antal celler i en liten mängd tid, jämfört med att isolera celler från vuxna hjärtan10,11. Viktigast av allt, primära odlade vuxen mus hjärtmuskelcellerna har kort överlevnad gånger (t.ex. 24 h) och på längre tid punkter de differentiera. Neonatal mus hjärtmuskelcellerna kan överleva och manipuleras för uppemot 7 dagar i kultur, vilket gör dem idealiska för att testa effekterna av läkemedelssubstanser och gen manipulation på funktionen av mitokondrier i hjärtmuskelcellerna10. Naturligtvis finns betydande biologiska skillnader mellan de vuxna och neonatal cellerna, men de längre varaktigheten som är tillgängliga för kultur av neonatal celler gör dem lämpliga för många olika typer av undersökningar, inbegripet de av mitokondriell funktion.
Hittills har primära odlade neonatal mus och råtta hjärtmuskelcellerna använts som modeller för att studera hjärt bioenergetik12,13. Under senare år har används studier en extracellulär flux analyzer att mäta syre materialåtgången (OCR) och utvärdera oxidativ kapacitet i mus och råtta neonatal hjärtmuskelcellerna14,15. Även jämfört med råttor, cell livskraft mus neonatal hjärtmuskelcellerna är lägre och har ökad variabilitet16. Dessutom gör möjlighet att studera celler från genetiskt modifierade musmodeller cellen musmodell mycket viktigt. Med tanke på att OCR studier är så känsliga för cell nummer och sådd densitet, behövs utveckling av en reproducerbar, tillförlitlig och enkel protokoll att uppnå konsekvent cell avkastning och lönsamhet.
Vi rapporterar här, ett optimerat protokoll som har utvecklats som använder odlade mus neonatal hjärtmuskelcellerna tillsammans med en 96-brunn-format extracellulära flux analyzer för OCR analys. Detta protokoll ökar kraftigt reproducerbarhet i analysen. Dessutom protokollet inte bara ger en roman och reproducerbar metod för OCR analys, men också kunde anpassas till en större storlek kultur för andra experimentella syften, såsom det som kan vara nödvändiga att studera myofibrillar funktioner och intracellulära signalvägar.
I synnerhet beskriver det här protokollet en endags-förfarande för isolering och kultur av neonatal mus hjärtmuskelcellerna i en platta med 96 brunnar cell i kultur. Dessutom, beskriver den förfarandet för att mäta syreförbrukning som använder en extracellulär flux analysator. Alla lösningar som används är sterila eller steril filtreras. Alla verktyg är steriliserade av 75% etanol. Vi ger en Tabell av material för olika delar av förfarandet. Odlingsskålar hjärtmuskelceller, för utförs alla förfaranden och åtgärder i en vanlig cell kultur huva. Detta protokoll är utvecklat för isolering av neonatal mus hjärtan från en kull (ca 8-10 ungar). Protokollet kan dock också anpassas för att isolera hjärtmuskelcellerna från flera kullar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitokondrier och oxidativ metabolism är kritiska för att upprätthålla hjärtmuskeln funktion. Forskning har visat att mitokondriell dysfunktion är en viktig bidragande faktor till nedsatt hjärtfunktion Funna i hjärtsvikt. Däremot kan återställa defekta mitokondriefunktion ha positiva effekter att förbättra hjärtfunktionen i sviktande hjärtat. Därför kan studerar regleringsmekanismerna och identifiera nya regleringsmyndigheter för mitokondriell funktion ge vägledning som kan användas för att utveckla nya terapeutiska mål för behandling av hjärtsjukdom. Här analyseras hjärt myocyt mitokondriell andning med en unik cellodlingssystem. Först, ett protokoll har optimerats för att snabbt isolera och kultur hög bärkraft neonatal mus hjärtmuskelcellerna. Sedan används en 96 brunnar format extracellulära flux analyzer för att bedöma andelen syre förbrukning av dessa hjärtmuskelcellerna. För detta protokoll, vi optimerad sådd villkor och visat att neonatal mus hjärtmuskelcellerna syre materialåtgången kan bedömas enkelt i en extracellulär flux analyzer. Avslutningsvis noterar vi att vårt protokoll kan tillämpas på en större kultur-storlek och andra studier, till exempel Intracellulär signalering och kontraktila fungera analys.

Med hjälp av protokollet beskrivs, var hjärtan isolerade från dag 0 neonatala valpar. 5 x 105 celler/pup erhölls, och hjärtmuskelceller var seedad vid tätheter av 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler per brunn, i plattor med 96 (figur 2A). Efter övernattning kultur, hjärtmuskelceller hittades väl fäst vid den belagda plastiska ytan och det fanns mycket få fria celler (okopplade cellerna visas fortfaran...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analysera syre materialåtgången i primära odlade mus Neonatal hjärtmuskelcellerna använder en extracellulär Flux Analyzer

Målet med detta protokoll är att illustrera hur man använda mus neonatal hjärtmuskelceller som modellsystem för att undersöka hur olika faktorer kan förändra syrgaskonsumtion i hjärtat.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Detta protokoll tillåter oss att isolera och kultur hög bi-BBT, känd endast för mus kardiomyocyter. För att utvärdera mitokondriell funktion, syreförbrukningshastigheten för kardiomyocyter kan analyseras av en faktisk silver flux analysator. En av fördelarna med denna teknik är att syreförbrukningen av kardiomyocyter lätt kan mätas i deras vidhäftande tillstånd i 96-brunnsformat, vilket möjliggör testning av flera tillstånd med ett stort antal replikat.Detta fartyg ger viktiga insikter i forskningsområdet kardiologi. Förutom syreförbrukning kan vi även studera andra metaboliska parametrar, som grågris och peracidepoxidation. Att uppnå hög variabilitet av kardiomyocyter är avgörande för detta experiment.Detta kräver effektiv matsmältning av hjärtan. Eftersom neonatal kardiomyocyter är mycket bräcklig, är skonsam hantering av kardiomyocyter också viktigt. I cellkulturhuven, aliquot 5ml av HBSS till varje brunn av en 6-väl cell kultur tallrik och placera den på is.Dessutom alikvot 10ml HBSS till en 10cm cellodling skålen, sedan, förbereda 20 ml Trypsin Predigestion lösning i en 50ml steril konisk rör. Håll alla lösningar på is. Därefter extraherar du hjärtat och överför det omedelbart till den sterila cellodlingsskålen som innehåller HBSS.Ta bort eventuell kvarvarande lungvävnad och större kärl. Tvätta hjärtat i HBSS med hjälp av mild agitation. Därefter skär hjärtat med fin sax i 8 stycken och överför hjärtvävnaden med tlyck i en brunn av en 6-väl cellkulturplatta med HBSS.Använd en moriasked, tvätta hjärtvävnaden genom att överföra den från brunn till brunn i 6-brunnsplattan fylld med HBSS. Överför sedan hjärtvävnaden i ett koniskt rör som innehåller 20 ml Trypsin och inkubera med mild agitation vid 4 grader celsius i 4 timmar. I detta förfarande, förkrigstiden den kollagenas matsmältningslösning i ett vattenbad vid 37 grader celsius.Överför det koniska röret som innehåller hjärtvävnad och predigestionlösning från 4 grader celsius till en cellkulturhuva. Låt hjärtvävnaden sjunka till botten av röret och ta bort predigestionlösningen genom att använda en 10 ml serologisk pipett. Lägg sedan till 10 ml HBSS i röret.Resuspend hjärtvävnaden med HBSS 2 till 3 gånger för att tvätta ut Trypsin med hjälp av en 10ml serologisk pipett. Aspirera HBSS och tillsätt 10 ml förvärmd kollagenas matsmältningslösning i röret med hjärtvävnad. För den första matsmältningen, inkubera röret med hjärtvävnad i ett vattenbad vid 37 grader celsius i 10 minuter utan agitation.Efteråt, överför röret till cellkulturens huva. Triturate vävnaden genom resuspending det försiktigt 10 gånger med hjälp av en 10ml serologisk pipett. Detta gör det möjligt för hjärtat att skingra och cellerna att släppas från hjärtvävnaden.Låt den osmälta vävnaden sjunka. Överför den smälta lösningen berikad i kardiomyocyter till ett nytt koniskt rör och tillsätt omedelbart en lika stor mängd cellkulturmedium för att stoppa kollagenas matsmältningen. Tillsätt sedan 10 ml kollagenas digestion lösning i röret som innehåller de återstående osmält hjärtvävnad.För den andra matsmältningen, inkubera röret med hjärtvävnad i en 37 grader celsius vattenbad i 10 minuter. Upprepa procedurerna i den första matsmältningen och överför den rötade lösningen berikad i kardiomyocyter till ett nytt koniskt rör innan du stoppar kollagenas matsmältningen. Därefter placerar du en steril cellsil i ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör.Förväta cellsilen med 2 till 3 ml cellodlingsmedium och för cellerna genom cellsilen. Därefter skölj cellsilen med cellodlingsmedium. Sedan centrifug det koniska röret som innehåller kardiomyocyter i 5 minuter vid 180 gånger gravitation.Efter 5 minuter, aspirera supernatanten och resuspend cell pelleten i 10ml av cellodling medium. Platta cellerna på en 10cm cell kultur skålen och inkubera dem i en timme. Efteråt, försiktigt agitera plattan.Tvätta bort de icke-vidhäftande cellerna och återanvänd cellerna genom att upprepade gånger pipettera cellodlingsmediet över skålen med en 10 ml serologisk pipett. Sedan överföra icke-anhängare celler till en ny 10cm cellkultur skålen och inkubera dem i en timme. Efter en timme, försiktigt agitera plattan och tvätta bort de icke-vidhäftande cellerna.Överför kardiomyocyterna till ett nytt 50 ml koniskt rör. Därefter förbereda en 96-brunns odlingsplatta genom aliquoting 50 mikroliter av beläggningslösning i varje brunn av 96-väl cellkulturplattan. Om bubblor finns, ta bort dem med hjälp av en 20 microliter pipett.Inkubera plattan vid 37 grader celsius i minst en timme för att tillåta torkning av matrisbeläggningen. Räkna sedan cellerna med hjälp av en hemocytometer. Platta cellerna i extra-cellulära matrisen belagda 96-väl cellodling plattan vid en densitet mellan 10 till 30 tusen celler per brunn.Och placera cellerna i inkubatorn. För att förforma syreförbrukningsanalysen, hydrate en fluxanalysatorsensorpatron i minst 3 timmar, tillsätt 200 mikroliter av calibrant-lösning i varje brunn av nyttoplattan. Placera tillbaka sensorkassetten på bruksplattan och inkubera i 37 grader celsius utan CO2 eller O2 tillskott i minst 3 timmar.En timme före analysen, försiktigt bort cellodlingsmediet och tvätta cellerna med 200 mikroliter av förvärmda mitokondriellt stresstest medium två gånger. Efter den andra tvätten, tillsätt 175 mikroliter av förvärmda mitokondriellt stresstest medium. Sedan odla cellerna på 37 grader celsius utan koldioxid eller syre tillskott.Förbered 3 ml av var och en av testföreningarna i mitokondriellt stresstestmedium. Ladda in 25 mikroliter av varje förening i injektorportarna på sensorkassetten med hjälp av en flerkanalspipett. Tillstånd av cellerna och eventuella förbehandlingar kan påverka maximal restaurering framkallas genom injektion av uncoupler FCCP.Cell känslighet för uncoupler kan också ändra, Därför är det viktigt att optimera arbetskoncentrationen av FCCP för varje särskild behandling. Därefter, ställa in extra-cellulära flux assay protokoll och starta programmet. Först, sätt sensorn cartiridge i maskinen för kalibrering.Byt ut calibranten för analysplattan när kalibreringssteget är gjort. Om så önskas, efter analysen, kassera noggrant allt analysmedium med hjälp av en flerkanalspipett. Och lagra cellkulturen mircoplate vid negativa 20 grader celsius för framtida cell normalisering med hjälp av protein assay.Genom att använda protokollet beskrivs, var hjärtan isolerade från dag 0 neo-natal ungar och kardiomyocyter var seedade vid tätheter av 10, 20 eller 30 tusen celler per brunn i 96-väl plattor. Efter natten kultur, kardiomyocyter hittades väl fäst vid belagda plast yta och det fanns mycket få unattached celler. Vid denna punkt, spontant upphandlande kardiomyocyter var väl synliga.En sådd densitet av 30, 000 celler per brunn visade sammanflödet en dag efter sådd som cellerna sprids. Kardiomyocyter var immunostained med en antikropp mot sarcomeric alpha aktinin, en cardiomyocyte specifik markör. Som visas här, de flesta av cellerna visade positiva färgning av alfa aktinin som anger hög renhet av kardiomyocyte isolering.Ett schema med ett typiskt mitokondriellt stresstest visas här. Mitokondriellt stresstest börjar med en baslinjemätning av syreförbrukningshastigheten, detta följs av injektion av Oligo myosin som hämmar ATPA:s. Sedan, den uncoupling agent FCCP injicerades för att mäta maximal syreförbrukning.Slutligen, med injektion av två elektrontransport komplexa hämmare, mitokondriell andning helt stopp och OCR minskar till sin lägsta nivå. För att erhålla konsekventa och reproducerbara resultat. Det är avgörande för att uppnå hög survivablity.Därför är det viktigt att använda nyfödda nyfödda nyfödda och försiktigt hanteras hjärtvävnader i kardiomyocyter. Genom att använda nya eller befintliga genetiskt manipulerade muslinjer kan denna metod enkelt översättas till data som kan leda till att man förstår nya mekanismer för bioenergetisk reglering i hjärtat. Mitokondriellt spela nyckelroller i hjärtfunktionen.Vi förväntar oss denna metod för att hjälpa till att identifiera nya tillsynsmyndigheter och vägar som reglerar oxiderande ämnesomsättning och hitta nya terapeutiska mål för behandling av hjärtsvikt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering och analys av blodflöde och syreförbrukning i Nedsatt Mikrocirkulationen: Ansökan om att en akut hepatit modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I livmodern Mätning av hjärtfrekvens i mus genom Noninvasive M-mode ekokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Bakre halvcirkelformade kanalen strategi för innerörat gen leverans i Neonatal mus

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Autonom funktion efter hjärnskakning i Ungdom idrottare: en utforskning av hjärtfrekvensvariationen med 24-timmars inspelning metod

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-Energetik utredning av Candida albicans använder Real-time extracellulära Flux analys

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Bedömning av hjärtfunktion Använda Skinned Kardiomyocyter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...