Name: analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir

Yenidoğan fareler ile çalışmaları için lütfen yerel üniversite/Enstitü yönergeleri ileri hayvan bakımı programlar tarafından bakın ve kişinin kurumsal ve diğer uygun düzenlemeler için uygun. Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri UC San Diego kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve federal ve eyalet düzenlemelere uygun.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>25 mL öncesi sindirim çözeltisihazırlamak: t...

<ol>
	<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms.">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li><li>Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction,+growth,+and+survival+of+cardiomyocytes.">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure.">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice.">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116 (2015).</li><li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li><li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury.">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recounting+Cardiac+Cellular+Composition.">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li><li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges.">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li><li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+basal+metabolism.">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li><li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses.">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).</li><li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function.">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li><li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload.">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li><li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels.">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells:+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation.">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+(Drp1)-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission.">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li><li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li><li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart/muscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator.">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li><li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice.">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li><li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism.">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li><li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium.">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+extracellular+flux+(XF)+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function.">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria.">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li><li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+in+cardiomyopathy:+every+substrate+matters.">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li><li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation.">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li></ol>

Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önc...

Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95'i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3' te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5' e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.
Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11' den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.
Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.
Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.
Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı--dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:269px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">A8674</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cell strainer 100 &#956;m pores</td>
			<td style="width:187px;">FALCON</td>
			<td style="width:180px;">352360</td>
			<td style="width:288px;">To capture undigested tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS004176</td>
			<td style="width:288px;">To make collagenase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">11965-092</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">D5030-10X1L</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">C2920</td>
			<td style="width:288px;">Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26140-079</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">F1141-5MG</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">14060-10</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-1890</td>
			<td style="width:288px;">To make coating solution for tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HBSS (Hank&#39;s balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15630080</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Life technologies</td>
			<td style="width:180px;">26050-088</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">G-3126</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">M-199</td>
			<td style="width:187px;">Cellgro</td>
			<td style="width:180px;">10-060-CV</td>
			<td style="width:288px;">To make cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:269px;">Moria spoon</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">NC9190356</td>
			<td style="width:288px;">To wash hearts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">75351-5MG</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">89900</td>
			<td style="width:288px;">To lyse the cells for protein assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Rotenone</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">R8875</td>
			<td style="width:288px;">Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux 
			Analyzer</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">Device used to analyze oxygen consumption rate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:180px;">102601-100</td>
			<td style="width:288px;">Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">SIGMA</td>
			<td style="width:180px;">P2256</td>
			<td style="width:288px;">To make mitochodnrial stress test medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:187px;">Fine Sciences Tools</td>
			<td style="width:180px;">91401-12</td>
			<td style="width:288px;">For dissection of hearts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe filter 0.2 &#956;m size</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:288px;">For sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin</td>
			<td style="width:187px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:180px;">22715 25GM</td>
			<td style="width:288px;">To make pre-digestion solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxygen consumption rate in primary cultured mouse neonatal cardiomyocytes using an extracellular flux analyzer

Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi'nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalpleri gün 0 yenidoğan pups izole edildi. 5 x 105 hücreleri/yavru elde ve cardiomyocytes, yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi, 96 iyi tabak (Şekil 2A) numaralı seribaşı. Gecede kültür sonra cardiomyocytes bulundu iyi kaplı plastik yüzey için ekli vardı (ekli olmayan hücreleri hala görünür gibi yuvarlak ve parlak, dağılın ola...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer at JoVE.com

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Bu protokol bize izole ve kültür yüksek bi-BBT, sadece fare kardiyomiyositler bilinen sağlar. Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, kardiyomiyositlerin oksijen tüketim hızı gerçek bir gümüş akısı analizörü tarafından analiz edilebilir. Bu tekniğin avantajlarından biri, kardiyomiyositlerin oksijen tüketiminin 96-iyi formatında yapışık durumda kolayca ölçülebilmeleridir, bu da çok sayıda çoğaltma ile birden fazla koşulun test edilmesini sağlar.Bu damar kardiyoloji araştırma alanı içine önemli bilgiler sağlar. Oksijen tüketimine ek olarak, greygrices ve perasit epoksidasyon gibi diğer metabolik parametreleri de inceleyebiliriz. Kardiyomiyositlerin yüksek değişkenlik elde etmek bu deney için çok önemlidir.Bu kalplerin verimli sindirim gerektirir. Neo-natal kardiyomiyositler çok kırılgan olduğundan, kardiyomiyositlerin nazik kullanımı da önemlidir. Hücre kültürü başlık olarak, 6-iyi hücre kültür plaka her kuyuya HBSS 5ml aliquot ve buz üzerine yerleştirin.Buna ek olarak, 10cm hücre kültürü çanak HBSS aliquot 10ml, daha sonra, 50ml steril konik tüp trypsin Prehazus solüsyonu 20 ml hazırlamak. Tüm çözümleri buzda tutun. Sonra, kalp ayıklayın ve hbss içeren steril hücre kültür çanak hemen aktarın.Herhangi bir kalıntı akciğer dokusu ve büyük damarları çıkarın. Nazik ajitasyon kullanarak KALBI HBSS'de yıkayın. Daha sonra, 8 adet ince makas ile kalp kesmek ve HBSS ile 6-iyi hücre kültür plaka bir kuyu içine forceps ile kalp dokusu aktarın.Moria kaşığı kullanarak, HBSS ile dolu 6 kuyulu tabakta iyiden kuyuya aktararak kalp dokusunu yıkayın. Daha sonra kalp dokusunu 20ml Tripsin içeren konik bir tüpe aktarın ve 4 saat boyunca 4 derece santigrat derecede hafif ajitasyonla inkübün. Bu işlemde, 37 santigrat derece bir su banyosunda kollajenaz sindirim çözeltisi önceden ısıtın.Kalp dokusu ve sindirim öncesi solüsyon içeren konik tüpü 4 dereceden hücre kültürüne aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak kalp dokusu tüp altına lavabo ve presindirimi solüsyon kaldırmak sağlar. Daha sonra, tüp içine HBSS 10ml ekleyin.10ml serolojik pipet kullanarak Trypsin yıkamak için HBSS ile kalp dokusu nu 2-3 kez yeniden askıya alın. Aspire HBSS ve kalp dokusu ile tüp içine önceden ısıtılmış kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin. İlk sindirim için, ajitasyon olmadan 10 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka.Daha sonra, hücre kültürü başlık için tüp aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak 10 kez hafifçe resuusing tarafından doku triturate. Bu kalp dağıtmak ve hücrelerin kalp dokusundan serbest bırakılması sağlayacaktır.Sindirilmemiş dokunun batmasına izin ver. Kardiyomiyositlerle zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın ve kollajenaz sindirimini durdurmak için hemen eşit miktarda hücre kültürü ortamı ekleyin. Sonra kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüp içine kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin.İkinci sindirim için, 10 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka. Kollajenaz sindirimdurdurmadan önce ilk sindirim prosedürlerini tekrarlayın ve kardiyomiyositler zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın. Sonra, yeni bir steril 50ml konik tüp steril bir hücre süzgeci yerleştirin.Hücre süzgecinden 2-3 ml'lik bir ortam alabilmek için önceden ıslanın ve hücreleri hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, hücre kültürü ortamı ile hücre süzgeci durular. Daha sonra, 180 kez yerçekimi 5 dakika kardiyomiyosit içeren konik tüp santrifüj.5 dakika sonra, supernatant aspire ve hücre kültürü orta 10ml hücre pelet resuspend. 10cm hücre kültür çanak üzerine plaka hücreleri ve bir saat kuluçka. Daha sonra, yavaşça plaka ajite.Non-yapışık hücreleri yıkayın ve tekrar tekrar 10ml serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde hücre kültürü orta pipetting hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, yeni bir 10cm hücre kültürü çanak içine non-adherent hücreleri aktarın ve başka bir saat için kuluçka. Bir saat sonra, yavaşça plakaaj ve non-yapışık hücreleri yıkayın.Kardiyomiyositleri yeni bir 50ml konik tüpe aktarın. Ardından, 96 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuda 50 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyerek 96 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın. Kabarcıklar varsa, 20 mikrolitrelik pipet kullanarak çıkarın.Matris kaplamanın kurutulması için plakayı en az bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri hücre dışı matrisin içine, kuyu başına 10 ila 30 bin hücre arasında bir yoğunlukta 96 kuyulu hücre kültür plakasına yerleştirin.Ve hücreleri kuluçkaya yatırın. Oksijen tüketimi analizini azaltmak için, bir akı analizörlü kartuşunu en az 3 saat nemlendirin, yardımcı plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre kalibran çözeltisi ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakaya geri yerleştirin ve en az 3 saat boyunca CO2 veya O2 takviyesi olmadan 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın.Bir saat önce tisbym, yavaşça hücre kültürü orta kaldırmak ve önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta iki kez 200 mikrolitre ile hücreleri yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta 175 mikrolitre ekleyin. Sonra kültür karbondioksit veya oksijen takviyesi olmadan 37 santigrat derece hücreleri.Mitokondriyal stres testi orta test bileşikleri her 3ml hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak sensör kartuşu enjektör portlarına her bileşiğin 25 mikrolitresini yükleyin. Hücrelerin durumu ve herhangi bir ön tedavi uncoupler FCCP enjeksiyonu ile ortaya maksimum restorasyon etkileyebilir.Uncoupler hücre duyarlılığı da değişebilir, bu nedenle, her tedavi için FCCP çalışma konsantrasyonu optimize etmek önemlidir. Daha sonra, ekstra-hücresel akı test protokolü kurmak ve programı başlatın. İlk olarak, kalibrasyon için makineye sensör kartilik koyun.Kalibrasyon adımı yapıldıktan sonra, kalıtım plakası için kalikan değiştirin. İstenirse, teşbikten sonra, çok kanallı pipet kullanarak tüm teşbib ortamını dikkatlice atın. Ve protein testini kullanarak hücre normalleşmesi için hücre kültürünü negatif 20 santigrat derecede saklayın.Açıklanan protokol kullanılarak kalpler 0. Gece kültüründen sonra, kardiyomiyositler iyi kaplı plastik yüzeye bağlı bulundu ve çok az bekar hücreler vardı. Bu noktada, kendiliğinden kasıldıktan sonra kardiyomiyositler kolayca görülebiliyordu.Her kuyu başına 30.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu, hücreler yayıldıkça tohumlamadan bir gün sonra birleştiğiyer gösterdi. Kardiyomiyositler sarkoerik alfa aktin, bir kardiyomiyosit spesifik belirteç karşı bir antikor ile immünosiyon edildi. Burada gösterildiği gibi, hücrelerin çoğu kardiyomiyosit izolasyonu yüksek saflıkgösteren alfa aktin pozitif boyama gösterdi.Tipik bir mitokondriyal stres testi bir şema burada gösterilmiştir. Mitokondriyal stres testi oksijen tüketim oranının bir temel ölçü ile başlar, Bu ATPA inhibe Oligo miyozin enjeksiyonu takip eder. Daha sonra, ayırma maddesi FCCP maksimum oksijen tüketim oranını ölçmek için enjekte edildi.Son olarak, iki elektron taşıma kompleksi inhibitörlerinin enjeksiyonu ile mitokondriyal solunum tamamen durur ve OCR en düşük seviyesine düşer. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için. Yüksek hayatta kalma elde etmek çok önemlidir.Bu nedenle kardiyomiyositlerde yenidoğan yenidoğan ve hafifçe işlenmiş kalp dokularının kullanılması önemlidir. Yeni veya mevcut genetik olarak manipüle fare hatları kullanılarak, bu yöntem kolayca kalpbiyoenerjetik düzenleme için yeni mekanizmaları anlamak için yol açabilir verilere çevrilebilir. Mitokondriyal kalp fonksiyonunda kilit rol oynar.Bu yöntemin, metabolizmayı düzenleyen yeni düzenleyicilerin ve yolların belirlenmesine ve kalp yetmezliğinin tedavisinde yeni tedavi hedeflerinin bulunmasına yardımcı olmasını bekliyoruz.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Akut Hepatit Model Uygulama: Görselleştirme ve Hepatik Mikrosirkülasyon Kan Akış ve Oksijen Tüketimi Analizi

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Noninvaziv M-mod ekokardiyografi ile Fare Kalp Puan utero Ölçümünde

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology

Beyin sarsıntısı gençlik sporcular aşağıdaki otonomik fonksiyon: kalp hızı değişkenliği 24 saatlik kayıt metodoloji kullanarak bir keşif

Participation in organized sports makes a significant contribution to youth development, but places youth at a higher risk for sustaining a concussion. To ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...