Name: applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

MS. Audrey Thomas-Gahring wordt erkend voor haar GC/MS werken. Wij zouden ook willen bedanken Massimo Marzorati voor het bewerken van het manuscript.

1. stoffen en preparaten
Opmerking: Het beschreven medium wordt gekocht als een poeder (Zie Tabel van materialen). De samenstelling van het beschreven medium in g/L is de volgende: Arabinogalactan (1.2), pectine (2.0), Xylaan (0.5), Glucose (0.4), gistextract (3.0), speciale pepton (1.0), Mucin (2.0), L-cysteïne-HCl (0.2).
<ol><li>
Voorbereiden van de beschreven medium
	<ol>
<li>Vul een 4 L-kolf met 2 L dubbel gedestilleerd, gedeïoniseerd ...

<ol>
	<li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin,+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions.">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li><li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honor+thy+symbionts.">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li><li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+normal+gut+microbiota.">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li><li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+intestinal+fermentation:+association+between+food+components,+delivery+systems,+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut.">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model.">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans,+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model.">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).</li><li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms:+a+novel+concept.">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli.">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li><li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease.">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).</li><li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems.">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microbial+community+reproducibility,+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model.">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li><li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+the+gut+microbiome.">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li><li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology.">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li><li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety,+Depression,+and+the+Microbiome:+A+Role+for+Gut+Peptides.">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li><li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota.">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li><li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats.">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li><li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+Versus+Phylogeny:+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species.">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth.">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4 (2018).</li><li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling.">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li><li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans.">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li><li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces.">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58 (2015).</li><li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs.">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li><li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro:+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract.">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li><li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota:+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites.">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li><li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus.">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li><li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+Database+Project:+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis.">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li><li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator.">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).</li><li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+The+Simulator+of+the+Human+Intestinal+Microbial+Ecosystem+(SHIME+&#174;).">Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME &#174;).</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model.">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li><li>Possemiers, S., Verth&#233;, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li><li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li><li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota:+a+key+regulator+of+metabolic+diseases.">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li><li>Sonnenburg, J., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism.">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li></ol>

In vitro kweken systemen zijn ontwikkeld om te bestuderen van de darmflora van de dikke darm. Zij maken gebruik van toestellen die zijn ontworpen om te simuleren de fysiologische omstandigheden van de gastro intestinal traktaat, bevordering van de groei van een volwassen gut microbiële Gemeenschap voor elke regio van de dubbele punt33. Terwijl het concept logisch en begrijpelijk is, vereist het werkelijke verloop van in vitro kweken systemen te bestuderen van de darmflora precisie en een begrip v...

De darmflora is een Gemeenschap van micro-organismen die zich in de menselijke maag-darmkanaal (GIT bevinden).  Deze Gemeenschap bereikt maximale concentratie in de dikke darm, die wordt geschat op 10-10-14 13bacteriën, uit 500-1.000 soorten, die in symbiose met de dikke darm milieu1,2 levente houden. De samenstelling en de functionaliteit van de darmflora veranderen ruimtelijk langs het GIT, vorming van regio specifieke communities, met de meeste diversiteit distally2,3,4,5. Voor iedere anatomische regio, aparte microbiële gemeenschappen bevinden zich in het lumen en over de mucosal voering6. De lumen-Gemeenschap heeft meer directe toegang tot voedingsstoffen zoals substraten de luminal compartiment-7 doorlopen. Ondanks dit, bevinden sommige bacteriën zich bij voorkeur in de laag van slijm, gebruik makend van de mucin geproduceerd door de cellen van de dikke darm als een energie bron1,5,8. Het verschil in microenvironments tussen de luminal en mucosale fasen leidt tot divergentie- en de ontwikkeling van fase specifieke communities. Deze gemeenschappen bieden samen metabole functies, zoals nutriënten metabolisme en de productie van vitaminen, en immunologische functies, zoals het voorkomen van de kolonisatie van menselijke pathogenen1,3, 9. de darmflora werkt ook functioneel in conjugatie met de menselijke Colón cellen3.
Als een belangrijk onderdeel van de menselijke GIT is het niet verwonderlijk dat de darmflora is bekend bij te dragen aan beide host gezondheid en ziekte status3,9,10,11,12. Een verschuiving in de darm microbiële populatie is gekoppeld aan meerdere ziekten bij de mens, met inbegrip van GIT stoornissen zoals intestinale bowel disease (IBD) en intestinale darmsyndroom (IBS), maar ook andere ziekten, zoals zwaarlijvigheid, bloedsomloop ziekte en autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolieten geproduceerd uit de darmflora hebben een globaal effect, locaties ver van de darm12,13te bereiken. De gut-brain-as is bijvoorbeeld gekoppeld aan mentale stoornissen, zoals angst en depressie14. Dus, het bestuderen van de darmflora is belangrijk voor meerdere velden van onderzoek, en is van toepassing op vele ziekten, zelfs degenen die niet vaak geassocieerd met het GIT.
Terwijl het wordt algemeen erkend dat het bestuderen van de darmflora belangrijk is, is het een ingewikkeld inspanning. Meerdere dierlijke modellen zijn beschikbaar, van kleine dieren zoals zebrafish, ratten en muizen, naar grotere schijven als apen en varkens15-19. Echter, de toepassing van deze dieren in termen van de menselijke darmflora is niet eenvoudig, aangezien deze dieren hebben een unieke bacteriële-Gemeenschap die geëvolueerd gebaseerd op milieu en voeding, en ze zijn anatomisch onderscheiden van mensen20 , 21. het gebruik van menselijke proefpersonen Hiermee verwijdert u de vraag van belang nog introduceert een andere set van uitdagingen. Menselijke studies zijn duur, tijdrovend, en ethisch beperkte11. Bovendien, storende factoren beïnvloeden de darmflora in menselijke studies, met inbegrip van leeftijd of ontwikkelingsstadium, milieu, voeding, medicatie en genetische factoren2,4,22.  Er zijn ook beperkingen op wat kan worden getest bij de mens, en welk type van monsters kan worden geoogst op welke tijden4.
Een kritische nadeel van het gebruik van een in vivo systeem te bestuderen van de darmflora is de aanwezigheid van zoogdieren onderdelen. De darmflora en menselijke cellen communiceren met elkaar, en in een in vivo instelt, is het onmogelijk om te onderscheiden van de twee. De metabolieten geproduceerd door de darmflora worden genomen door de cellen van de dikke darm, zodat de metingen kunnen niet worden berekend met precisie. Daarom moet een mechanistisch onderzoek worden beperkt tot eindpunt metingen11. Een ander groot nadeel voor in vivo onderzoek is het onvermogen om te oogsten van monsters van de verschillende regio's van het GIT lengterichting23. Dit staat niet toe voor de beoordeling van veranderingen die na verloop van tijd12in de microenvironments van de dikke darm kunnen optreden.  Veel in vivo studies, met inbegrip van menselijke studies, vertrouwen op analyse van fecale monsters om wijzigingen aan de gut microbiota12te herkennen. Terwijl dit informatief is, het biedt geen gegevens op de darmflora over de GIT en maakt geen onderscheid tussen de luminal en mucosale gemeenschappen5,6,7,8.
Voor de darmflora moet de toepassing van een in vitro studie van de dynamiek van de bacteriële Gemeenschap, zonder inmenging van de zoogdieren componenten. Met behulp van een in vitro -methode zorgt voor de strakke controle van milieuomstandigheden10, testen van meerdere parameters tegelijk, en de mogelijkheid om te proeven overlangs, en met grote volumes11. Aangezien een in vitro methode maakt gebruik van een mechanisch apparaat en niet een host, zijn geen overwegingen nodig voor leeftijd, milieu, voeding of genetische achtergrond. Deze systemen kunnen worden gebruikt om te testen of de gehele gut microbiota Gemeenschap, alleen geselecteerde organismen, of zelfs enkele stammen. Nog belangrijker is, in vitro resultaten reproduceerbaar zijn, toch behouden een mate van diversiteit vergelijkbaar met in vivo onderzoek11,22.
Afhankelijk van de hypothese in kwestie en de gewenste resultaten, ikn vitro studies kunnen op verschillende manieren worden uitgevoerd.  Zij kunnen gebruik maken van single-schip systemen en eenvoudige methoden, zoals de incubatie van monsters met fecale homogenaat24 of het uitvoeren van één partij culturen in de loop van de 24-48 h25. Ze kunnen ook worden bereikt met behulp van één-schip systemen en complexere methoden, zoals het gebruik van een chemostat-systeem voor de productie van een stabiele gut microbiële Gemeenschap11. Echter kan het gebruik van een interne reactor overdreven vereenvoudigen de microbiota12 omdat het vertegenwoordigt slechts een deel van de dikke darm, hoewel de dikke darm uit de oplopende, transversale en aflopende regio's bestaat.
Om te kunnen studeren de gut microbiota Gemeenschap dat zich in de verschillende regio's van de dikke darm (de oplopende, aflopende en transversale gebieden ontwikkelt), kan een complex, meerdere fasen systeem worden gebruikt. In deze systemen, worden meerdere schepen ingesteld om na te bootsen van de verschillende regio's van de dikke darm, zodat de darmflora van de oplopende, transversale en aflopende regio's worden geteeld onafhankelijk. Deze vaartuigen zijn verbonden, met behulp van de pompen te verplaatsen van substraten in volgorde, van de oplopend in de dwarse aan de dalende dikke darm-regio's, het nabootsen van de stroom van voedingsstoffen door het GIT.
Het doel van deze studie was om aan te tonen hoe een 5-traps in-vitro cultuur-systeem (Zie Tabel van materialen) kan worden gebruikt om te cultiveren de gut microbiota Gemeenschap, en om aan te tonen van de communautaire dynamiek in termen van stabiliteit en samenstelling. In dit systeem, één vaartuig vertegenwoordigt de maag en een vertegenwoordigen de dunne darm. De dikke darm is onderverdeeld in drie regio's (oplopend, dwarse, aflopend), met één bak elke regio26vertegenwoordigen. In deze experimentele opzet, twee complete systemen werden parallel lopen, met eenheid 1 de mucosal oppervlakte en eenheid 2 met geen mucin vervoerders bevattende mucin luchtvaartmaatschappijen vertegenwoordigt. De Gemeenschappen die in de luminal en mucosale fasen van elke regio ontwikkeld werden vergeleken aan elkaar en aan de fecale entmateriaal na verloop van tijd met behulp van het 16S rRNA gen sequencing en SCFA analyse. De resultaten tonen het soort Gemeenschap, zowel in termen van samenstelling en functionaliteit, die kan worden geproduceerd uit dit soort in vitro systeem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWINSHIME</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing</td>
			<td>cole Parmer</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine Drainage bag</td>
			<td>Bard</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsorb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fecal sample</td>
			<td>Openbiome</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined medium</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxgall Bile</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass ware</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization pouches</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeadBug</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free, DNAse free, sterile water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25&#181;m</td>
			<td>Restek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mucin carriers</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota

De menselijke darmflora speelt een vitale rol in zowel de menselijke gezondheid en ziekte. Het bestuderen van de darmflora met behulp van een in vivo -model, is moeilijk vanwege de complexe aard, en haar gevarieerd connectie met zoogdieren onderdelen. Het doel van dit protocol is om de cultuur van de darmflora in vitro, die het mogelijk voor de studie van de gut microbiota dynamiek, maakt zonder te hoeven nadenken over de bijdrage van de zoogdieren milieu. Met behulp van in vitro kweken van technologie, worden de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus gesimuleerd, met inbegrip van parameters zoals pH, temperatuur, anaerobiosis en transittijd. De intestinale oppervlak van de dikke darm wordt gesimuleerd door toevoegen van mucin beklede vervoerders, maken een mucosal fase, en het toevoegen van extra dimensie. De darmflora is geïntroduceerd door het enten met de menselijke fecaal materiaal. Na inoculatie met dit complexe mengsel van bacteriën, specifieke microben zijn verrijkt met de verschillende longitudinale (oplopend, dwars- en aflopende dubbele punten) en transversale (luminal en mucosale) omgevingen van het in vitro model. Het is cruciaal om het systeem te bereiken van een stabiele toestand, waarin de Gemeenschap en de geproduceerde metabolieten stabiel blijven. De experimentele resultaten in dit manuscript aantonen hoe de geënte gut microbiota Gemeenschap zich ontwikkelt tot een stabiele Gemeenschap na verloop van tijd. Zodra stationaire toestand is bereikt, kan het systeem worden gebruikt om bacteriële interacties en gemeenschap functies te analyseren of om te testen van de gevolgen van eventuele toevoegingen voor de darmflora, zoals eten, voedingsbestanddelen of farmaceutische producten.

Het bovenstaande protocol beschrijft instellen, inenting, en de werking van een 5-traps in-vitro systeem te bestuderen van de darmflora van de dikke darm. Voor het genereren van de gegevens hieronder, op basis van DNA-extractie, werd 16S rRNA marker gene DNA sequencing van de V1V2-regio uitgevoerd met behulp van de hoge doorvoer sequencing (b.v., MiSeq Illumina platform) door het Microbiome Center op het Children's Hospital van Philadelphia27. QIIME (kwant...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de darmflora van de dikke darm in vitro, met behulp van een reeks van bioreactoren die de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus simuleren.

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Het doel van dit protocol is om de cultuur gut microbiota in vitro. Het zal de studie van de dynamiek van microbiota mogelijk maken zonder rekening te houden met de bijdrage van een moderne component. Met behulp van dit multi-stage in vitro systeem tellen we de microbiota gemeenschap te ontwikkelen in de lumin en op het slijmvlies van multi-regio's van de dikke darm kan gelijktijdig worden gestart.Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig vanwege de complexiteit van dit in vitro systeem. Begin met het vullen van de opgaande dikke darm met 500 milliliter gedefinieerd medium, de dwarse dikke darm met 800 milliliter gedefinieerd medium, en de dalende dikke darm met 600 milliliter gedefinieerd medium. Voeg mucin agricarriers toe aan de colongebieden in een bedrag dat evenredig is met het volume van de reactor, en gebruik de monsterbuis en spuit om overtollig gedefinieerd medium uit elke reactor te verwijderen.Gebruik de pH-sondes om de pH in elke reactor aan te passen. En zet de stikstof flush voor 20 minuten. Ontdooi vervolgens het fecale homogenaat volgens de richtlijnen van de fabrikant voordat u een spuit van 60 milliliter laadt met het fecale homogenaatmonster.Dan, inenting elke dikke darm reactor door de monsterpoort met een hoeveelheid homogenaat gelijk aan 5% van elke reactor volume voor 's nachts cultuur met pH-controle. De volgende ochtend, reinig de luer slot op de monsterpoort van elke bioreactor met alcohol. Wanneer de havens zijn opgedroogd, sluit u de 30 milliliter spuit, vrijgekomen van alle lucht, aan op een van de monsterpoorten.Trek de zuiger drie tot vijf keer om een grondige vermenging van de onderdelen van het vat te garanderen voordat 15 milliliter van de cultuur supernate uit de bioreactor. Breng het luminale monster vervolgens over in een steriele Falcon-buis en plaats op ijs. Voor DNA-analyse, verzamel een tot drie milliliter luminale vloeistof met behulp van een vijf milliliter spuit.Verzamel de supernate vormen de andere bioreactoren op dezelfde manier. Om monstermateriaal opzij te zetten voor de analyse van het korte ketenvetzuur, centrifugeren 15 milliliter van het luminale monster van belang, en spuit filtert de supernate door een 0,2 micrometer poriefilter voor min 80 graden Celsius opslag. Om monstermateriaal opzij te zetten voor DNA-analyse, een milliliter luminale vloeistof te centrifugeren en de pellet op te slaan bij min 80 graden Celsius.Voor mucosale monster oogst, verwijder de bereide mucin dragers uit vier graden Celsius opslag en zet de stikstof flush. Open snel het reactordeksel en vervang 50% van de dragers in elke reactor door nieuwe. Wanneer alle dragers zijn vervangen, snel opnieuw het deksel en onderhouden van de stikstof flush voor nog eens 20 minuten.Dan aliquot 0,25 tot 0,5 gram mucin drager agar in individuele twee milliliter buizen voor min 80 graden Celsius opslag tot DNA-extractie. Drie keer per dag fietst het systeem automatisch. Dit begint met 140 milliliter gedefinieerd medium overgebracht naar de maag bioreactor gevolgd door een een uur incubatie met pH-controle.Aan het einde van de incubatie wordt de inhoud van de maag overgebracht naar de dunne darm, samen met 60 milliliter alvleeskliersap. In de kleine darmbioreactor wordt de pH automatisch aangepast tot 6,7 tot 6,9 en de inhoud gedurende 90 minuten inbroed. Tijdens deze incubatie wordt de stikstofspoeling voor elk systeem in totaal 10 minuten ingeschakeld.Aan het einde van deze incubatie wordt de inhoud van de dunne darm overgebracht naar de opgaande dikke darm, van de opgaande dikke darm naar de dwarse dikke darm, van de dwarse dikke darm naar de dalende dikke darm en van de dalende dikke darm naar het afval. In deze representatieve hoofdcoördinatenanalyse veranderde de gemeenschap afschrijfbaar tussen dag één en zeven. Vanaf dag 11 na de inenting tot het einde van het experiment bezetten de monsters echter een klein gebied van de belangrijkste coördinatenanalyseruimte voor zowel steekproefsamples op basis van operationele taxonomische eenheid, aanwezigheid tot afwezigheid en overvloed.De meting van drie prominente kortgeketende vetzuren blijkt dat propionzuur, butanoïnezuur en azijnzuur fluctueren vanaf het begin van het experiment tot dag 15 post-inenting. Na dag 15 bleven de hoeveelheden van deze zuren die in elke colonregio worden geproduceerd constant met slechts minimale veranderingen tot het einde van het experiment. Analyse van de stabiele gemeenschap voor de luminale en mucosale fase van elke colon regio toont aan dat de gemeenschappen die zich ontwikkelen in de individuele dikke darm regio's van het in vitro systeem zijn vergelijkbaar met de fecale entmateriaal samenstelling.Vergelijking van de alfadiversiteit van het in vitro systeem toont een vergelijkbaar niveau van diversiteit aan als dat van het entmateriaal voor alle regio's, behalve de luminale monsters uit het opgaande gebied. Aantonen dat het in vitro cultuursysteem in staat is om een gemeenschap te produceren die vergelijkbaar is met het fecale entmateriaal, zowel qua samenstelling als diversiteit. Om een stabiele darmmicrobiota gemeenschap te produceren met behulp van dit protocol, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat oplossingen nauwkeurig worden voorbereid en dat anerobic voorwaarden en pH-parameters worden gehandhaafd tijdens het experiment.Na deze procedure kunnen monsters worden geanalyseerd op gemeenschapssamenstelling met behulp van next gen DNA-sequencing, gevolgd door bio-informatica-analyse en voor functionaliteit met behulp van metabolomics.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Kweken Muis hartkleppen in de Miniature Tissue Culture System

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

TAPE: een biologisch afbreekbaar Hemostatische Glue Geïnspireerd door een alomtegenwoordige Compound in Installaties voor chirurgische toepassing

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

Creëren van een structureel realistische eindige elementen geometrische Model van een Cardiomyocyte te bestuderen van de rol van cellulaire architectuur in Cardiomyocyte systeembiologie

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...