Name: applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

Sig. ra Audrey Thomas-Gavioli sono riconosciuto per la GC/MS funziona. Vorremmo anche ringraziare Massimo Marzorati per il manoscritto di editing.

1. sostanze e preparati
Nota: Il medium definito viene acquistato sotto forma di polvere (Vedi Tabella materiali). La composizione del mezzo definito in g/L è la seguente: arabinogalattano (1.2), pectina (2.0), xilano (0,5), glucosio (0,4), Estratto di lievito (3.0), speciale peptone (1.0), mucina (2.0), L-cisteina-HCl (0,2).
<ol><li>
Preparare il medium definito
	<ol>
<li>Riempire una boccetta di 4L con 2 L di acqua distillata, demineraliz...

<ol>
	<li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin,+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions.">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li><li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honor+thy+symbionts.">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li><li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+normal+gut+microbiota.">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li><li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+intestinal+fermentation:+association+between+food+components,+delivery+systems,+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut.">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model.">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans,+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model.">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).</li><li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms:+a+novel+concept.">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli.">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li><li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease.">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).</li><li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems.">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microbial+community+reproducibility,+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model.">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li><li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+the+gut+microbiome.">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li><li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology.">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li><li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety,+Depression,+and+the+Microbiome:+A+Role+for+Gut+Peptides.">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li><li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota.">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li><li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats.">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li><li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+Versus+Phylogeny:+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species.">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth.">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4 (2018).</li><li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling.">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li><li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans.">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li><li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces.">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58 (2015).</li><li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs.">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li><li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro:+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract.">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li><li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota:+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites.">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li><li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus.">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li><li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+Database+Project:+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis.">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li><li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator.">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).</li><li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+The+Simulator+of+the+Human+Intestinal+Microbial+Ecosystem+(SHIME+&#174;).">Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME &#174;).</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model.">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li><li>Possemiers, S., Verth&#233;, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li><li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li><li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota:+a+key+regulator+of+metabolic+diseases.">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li><li>Sonnenburg, J., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism.">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li></ol>

Sistemi di coltura in vitro sono stati sviluppati per studiare il microbiota dell'intestino dell'intestino crasso. Essi utilizzano apparati progettati per simulare le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, promuovendo la crescita di una comunità microbica intestinale maturo per ogni regione del colon33. Mentre il concetto è logico e comprensibile, l'esecuzione effettiva di sistemi di coltura in vitro per studiare il microbiota dell'intestino richiede precisione e una comprensione...

Il microbiota dell'intestino è una comunità di microrganismi che risiedono nel tratto gastrointestinale umano (GIT).  Questa comunità raggiunge la massima concentrazione nel colon, che è stimato per contenere 1013-1014 batteri, da 500-1.000 specie, che vivono in simbiosi con il colon milieu1,2. La composizione e la funzionalità del microbiota cambiare nello spazio lungo il GIT, formando comunità specifiche di regione, con la maggior parte delle diversità trovata distalmente2,3,4,5. Per ogni regione anatomica, separata comunità microbiche risiedono nel lume e il rivestimento mucoso6. La comunità di lumen ha un accesso più diretto alle sostanze nutrienti come substrati spostare attraverso il vano luminal7. Nonostante questo, alcuni batteri risiedono preferenzialmente nello strato di muco, che utilizzano mucina prodotta dalle cellule del colon come un'energia fonte1,5,8. La differenza in microambienti tra i risultati di fasi luminal e delle mucose in divergenza e lo sviluppo di specifiche comunità di fase. Insieme, queste comunità forniscono funzioni metaboliche, come il metabolismo dei nutrienti e la produzione di vitamine e funzioni immunologiche, come prevenire la colonizzazione di agenti patogeni umani1,3, 9. il microbiota dell'intestino funziona anche funzionalmente in coniugazione con le cellule del colon umano3.
Come una parte importante di GIT umana, non è sorprendente che il microbiota dell'intestino è conosciuto per contribuire a entrambi host salute e malattia stato3,9,10,11,12. Un cambiamento nella popolazione microbica dell'intestino è stato associato con le malattie umane multiple, compreso i disordini GIT come malattia intestinale intestinale (IBD) e sindrome intestinale delle viscere (IBS), ma anche altre malattie, come l'obesità, malattie cardiovascolari e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metaboliti prodotti dal microbiota dell'intestino hanno un effetto globale, raggiungendo posizioni lontano il budello12,13. Ad esempio, l'asse cervello-intestino è associata con disturbi mentali come ansia e depressione14. Pertanto, studiando il microbiota dell'intestino è importante a più campi di ricerca ed è applicabile a molte malattie, anche quelli non spesso associato con GIT.
Mentre è ampiamente riconosciuto che è importante studiare il microbiota dell'intestino, è uno sforzo complicato. Più modelli animali sono disponibili, da piccoli animali come zebrafish, ratti e topi, a quelle più grandi come scimmie e maiali15-19. Tuttavia, l'applicazione di questi animali in termini del microbiota dell'intestino umano è non è semplice, poiché questi animali hanno una singolare comunità batterica che si è evoluta basata su ambiente e dieta, e sono anatomicamente distinti da esseri umani20 , 21. l'uso di soggetti umani rimuove la questione della rilevanza ancora introduce un'altra serie di sfide. Gli studi umani sono costosi, che richiede tempo e sono eticamente vincolata11. Inoltre, fattori di confondimento influenzano il microbiota dell'intestino negli studi umani, tra cui età o fase inerente allo sviluppo, ambiente, dieta, farmaci e fattori genetici2,4,22.  Ci sono anche restrizioni su ciò che può essere testato in esseri umani, e quale tipo di campioni può essere raccolto a cosa volte4.
Uno svantaggio critico dell'utilizzo di un sistema in vivo per studiare il microbiota dell'intestino è la presenza di componenti dei mammiferi. Il microbiota dell'intestino e le cellule umane interagiscono uno con l'altro, e in un in vivo l'impostazione, è impossibile distinguere i due. I metaboliti prodotti dal microbiota dell'intestino sono presi dalle cellule del colon, quindi misure non possono essere calcolate con precisione. Pertanto, qualsiasi studio meccanicistico deve limitarsi al punto finale misure11. Un altro grande svantaggio per studi in vivo è l'incapacità di raccogliere campioni provenienti da diverse regioni di GIT longitudinalmente23. Questo non consente per la valutazione dei cambiamenti che possono verificarsi in microambienti del colon nel tempo12.  Molti in vivo studi, compreso gli studi umani, si basano sull'analisi di campioni di feci per rilevare le modifiche al microbiota intestinale12. Mentre questo è informativo, esso non fornisce dati sul microbiota dell'intestino attraverso GIT e non distingue tra le comunità luminal e mucosa5,6,7,8.
Per il microbiota dell'intestino, è necessaria l'applicazione di un metodo in vitro per studiare la dinamica della comunità batterica, senza interferenze da parte dei componenti dei mammiferi. Utilizzando un metodo in vitro permette un controllo stretto di condizioni ambientali10, prova di più parametri simultaneamente e l'abilità di campionare longitudinalmente e in grandi volumi11. Poiché un dispositivo meccanico e non un host utilizza un metodo in vitro, considerazioni non sono necessarie per età, ambiente, dieta o background genetico. Questi sistemi può essere utilizzato per verificare sia la comunità di microbiota dell'intestino intero, solo selezionati organismi, o addirittura singoli ceppi. D'importanza, i risultati in vitro sono riproducibili, ancora mantenere un livello di diversità paragonabile a studi in vivo11,22.
Secondo l'ipotesi in questione e i risultati desiderati, ion vitro studi possono essere eseguiti in diversi modi.  Possono utilizzare sistemi del singolo-vaso e metodi semplici, quali incubando campioni con fecale omogeneato24 o l'esecuzione batch singolo colture nel corso di 24-48 h25. Essi può essere effettuate anche utilizzando sistemi del singolo-vaso e metodi più complessi, come l'utilizzo di un sistema di chemostat per produrre un intestino stabile comunità microbica11. Tuttavia, l'uso di un unico reattore può over-semplificare il microbiota12 poiché rappresenta solo una sezione del colon, anche se il colon è composto da regioni ascendente, trasversale e discendente.
Al fine di studiare la comunità di microbiota dell'intestino che si sviluppa nelle regioni differenti del colon (le regioni ascendente, trasversale e discendente), può essere impiegato un sistema complesso, multi-stadio. In questi sistemi, vasi multipli sono impostati per simulare le differenti regioni del colon, così il microbiota dell'intestino delle regioni ascendente, trasversale e discendente sono coltivati in modo indipendente. Questi vasi sono collegati, utilizzando pompe per spostare substrati in sequenza, dalla crescente a trasversale alle regioni del colon discendente, che imita il flusso delle sostanze nutrienti attraverso GIT.
L'obiettivo di questo studio era di dimostrare come un sistema di coltura in vitro di 5 stadi (Vedi Tabella materiali) può essere utilizzato per coltivare la comunità del microbiota dell'intestino e per dimostrare le dinamiche comunitarie in termini di stabilità e composizione. In questo sistema, una nave rappresenta lo stomaco e uno rappresentano l'intestino tenue. Il colon è diviso in tre regioni (ascendente, trasverso, discendente), con una nave che rappresenta ogni regione26. In questa messa a punto sperimentale, due sistemi completi sono stati eseguiti in parallelo, con l'unità 1 contenente i vettori di mucina a rappresenta la superficie mucosa e l'unità 2 non contenente nessun vettori di mucina. Le comunità che sviluppato nelle fasi di luminal e mucosa di ciascuna regione sono state confrontate a vicenda e per l'inoculo fecale nel tempo utilizzando analisi SCFA e gene del rRNA 16S. I risultati presentati dimostrano il tipo di comunità, sia in termini di composizione e funzionalità, che può essere prodotta da questo tipo di sistema in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWINSHIME</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing</td>
			<td>cole Parmer</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine Drainage bag</td>
			<td>Bard</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsorb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fecal sample</td>
			<td>Openbiome</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined medium</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxgall Bile</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass ware</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization pouches</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeadBug</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free, DNAse free, sterile water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25&#181;m</td>
			<td>Restek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mucin carriers</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota

Il microbiota dell'intestino umano svolge un ruolo vitale nella salute umana e la malattia. Studiare il microbiota dell'intestino utilizzando un modello in vivo , è difficile a causa della sua natura complessa e la sua associazione diversificata con componenti dei mammiferi. L'obiettivo del presente protocollo è alla cultura il microbiota dell'intestino in vitro, che consente lo studio delle dinamiche del microbiota intestinale, senza dover considerare il contributo del milieu dei mammiferi. Utilizzando in vitro coltura tecnologia, sono simulate le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, inclusi i parametri quali pH, temperatura, anaerobiosi e tempo di transito. La superficie intestinale del colon viene simulata aggiungendo elementi portanti rivestite con mucina, creazione di una fase della mucosa, e aggiungendo ulteriore dimensione. Il microbiota dell'intestino è stato introdotto inoculando con il materiale fecale umano. Al momento dell'inoculazione con questa complessa miscela di batteri, microbi specifici sono arricchiti in diversi longitudinale (ascendente, trasversale e discendente colon) e trasversali (luminal e mucosi) ambienti del modello in vitro. È fondamentale per consentire al sistema di raggiungere uno stato di costante, in cui la Comunità e i metaboliti prodotti rimangono stabili. I risultati sperimentali in questo manoscritto dimostrano come la comunità di microbiota inoculato intestino si sviluppa in una comunità stabile nel tempo. Una volta allo stato stazionario è raggiunto, il sistema può essere utilizzato per analizzare le interazioni batteriche e funzioni della community o per testare gli effetti di eventuali additivi sul microbiota dell'intestino, quali cibo, componenti alimentari o prodotti farmaceutici.

Il protocollo di cui sopra descrive la messa a punto, inoculazione e l'esecuzione di un sistema in vitro di 5 stadi per studiare il microbiota intestinale del colon. Per generare i dati presentati di seguito, dopo l'estrazione del DNA, gene del rRNA marcatore del DNA 16S della regione V1V2 è stato effettuato usando il sequenziamento (ad es., MiSeq Illumina piattaforma) dal centro di Microbiome presso l'ospedale pediatrico a resa elevata di Philadelphia27....

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Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

L'applicazione di avanzate In Vitro coltura tecnologia per studiare il Microbiota dell'intestino umano

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura del microbiota dell'intestino, del colon in vitro, , utilizzando una serie di bioreattori che simulano le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale.

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di coltura del microbiota intestinale in vitro. Consentirà lo studio della dinamica microbiota senza dover considerare il contributo di una componente moderna. Utilizzando questo sistema in vitro multistazione, contiamo che la comunità microbiota si sviluppi nel lumin e sulla mucosa di più regioni del colon può essere avviata contemporaneamente.Una dimostrazione visiva di questo metodo è utile a causa della complessità di questo sistema in vitro. Inizia riempiendo i due punti ascendenti con 500 millilitri di mezzo definito, il colon trasversale con 800 millilitri di mezzo definito e il colon decrescente con 600 millilitri di mezzo definito. Aggiungere gli agricarrier mucina alle regioni del colon in una quantità proporzionale al volume del reattore e utilizzare il tubo campione e la siringa per rimuovere qualsiasi mezzo definito in eccesso da ciascun reattore.Utilizzare le sonde di pH per regolare il pH in ogni reattore. E accendere il filo di azoto per 20 minuti. Successivamente, scongelare l'omogeneato fecale secondo le linee guida del produttore prima di caricare una siringa da 60 millilitri con il campione di omogenato fecale.Quindi, inoculare ogni reattore colon attraverso la porta del campione con una quantità di omogeneato pari al 5% di ogni volume del reattore per la coltura notturna con controllo del pH. La mattina dopo, pulire la serratura luer sulla porta del campione di ogni bioreattore con alcol. Quando le porte si sono asciugate, collegare la siringa da 30 millilitri, sgombrata da tutta l'aria, a una delle porte del campione.Ritirare lo stantuffo da tre a cinque volte per garantire un'accurata miscelazione dei componenti del recipiente prima di aspirare 15 millilitri del supernato della coltura dal bioreattore. Quindi trasferire il campione luminale in un tubo Falcon sterile e posizionare sul ghiaccio. Per l'analisi del DNA, raccogliere da uno a tre millilitri di liquido luminare usando una siringa da cinque millilitri.Raccogliere il supernato formare gli altri bioreattori allo stesso modo. Per mettere da parte il materiale campione per l'analisi degli acidi grassi a catena corta, centrifugare 15 millilitri del campione luminare di interesse e filtrare il supernato attraverso un filtro dei pori da 0,2 micrometri per una conservazione di meno 80 gradi Celsius. Per mettere da parte il materiale campione per l'analisi del DNA, centrifugare un millilitro di liquido luminare e conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius.Per la raccolta del campione di mucosa, rimuovere i portatori di mucina preparati dallo stoccaggio di quattro gradi Celsius e accendere il filo di azoto. Aprire rapidamente il coperchio del reattore e sostituire il 50% dei supporti di ciascun reattore con nuovi. Quando tutti i supporti sono stati sostituiti, risigillare rapidamente il coperchio e mantenere il filo di azoto per altri 20 minuti.Quindi aliquota da 0,25 a 0,5 grammi di agar trasportatore di mucina in singoli due tubi millilitro per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio fino all'estrazione del DNA. Tre volte al giorno il sistema cicli automaticamente. Questo inizia con 140 millilitri di mezzo definito trasferiti nel bioreattore dello stomaco seguito da un'incubazione di un'ora con controllo del pH.Alla fine dell'incubazione, il contenuto dello stomaco viene trasferito nell'intestino tenue insieme a 60 millilitri di succo pancreatico. Nel bioreattore dell'intestino tenue, il pH viene regolato automaticamente a 6,7 a 6,9 e il contenuto incuba per 90 minuti. Durante questa incubazione, il scarico dell'azoto per ogni sistema viene acceso per un totale di 10 minuti.Alla fine di questa incubazione, il contenuto dell'intestino tenue viene trasferito nel colon ascendente, dal colon ascendente al colon trasversale, dal colon trasversale al colon discendente e dal colon discendente ai rifiuti. In questa analisi delle coordinate principali rappresentative, la comunità è cambiata deprecabilmente tra i giorni uno e sette. Tuttavia, dal giorno 11 dopo l'inoculazione fino alla fine dell'esperimento, i campioni occupavano una piccola regione dello spazio di analisi delle coordinate principali per entrambi i punteggi di distanza del campione in base all'unità tassonomica operativa, alla presenza all'assenza e all'abbondanza.La misurazione di tre importanti acidi grassi a catena corta rivela che l'acido propionico, l'acido butanoico e l'acido acetico fluttuano dall'inizio dell'esperimento fino al giorno 15 dopo l'inoculazione. Dopo il giorno 15, le quantità di questi acidi prodotte in ogni regione del colon rimasero costanti con solo cambiamenti minimi fino alla fine dell'esperimento. L'analisi della comunità stabile per la fase luminale e mucosa di ogni regione del colon dimostra che le comunità che si sviluppano nelle singole regioni del colon del sistema in vitro sono simili alla composizione dell'inoculo fecale.Il confronto della diversità alfa del sistema in vitro rivela un livello di diversità simile a quello dell'inoculo per tutte le regioni ad eccezione dei campioni luminali della regione ascendente. Dimostrando che il sistema di coltura in vitro è in grado di produrre una comunità paragonabile all'inoculo fecale sia in termini di composizione che di diversità. Per produrre una comunità di microbiota intestinali stabile utilizzando questo protocollo, è fondamentale garantire che le soluzioni siano preparate con precisione e che le condizioni anerobiche e i parametri di pH siano mantenuti durante l'esperimento.Seguendo questa procedura, i campioni possono essere analizzati per la composizione della comunità utilizzando il sequenziamento del DNA di nuova generazione seguito dall'analisi bioinformatica e per la funzionalità utilizzando la metabolomica.

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