Name: applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

Ms. Audrey Thomas-Gahring er anerkjent for sin GC/MS fungerer. Vi vil også gjerne takke Massimo Marzorati for redigering manuskriptet.

1. materialer og preparater
Merk: Definerte mediet er kjøpt som et pulver (se Tabell for materiale). Sammensetningen av definerte mediet i finans er følgende: Arabinogalactan (1.2), pektin (2.0), Xylan (0,5), glukose (0,4), gjærekstrakt (3,0), spesielt pepton (1.0), Mucin (2.0), L-cystein-HCl (0,2).
<ol><li>
Forberede den definerte mediet
	<ol>
<li>Fyll en 4 L kolbe med 2 L dobbel destillert deionisert vann.</li>
		<li>Legg 29,2 g definer...

<ol>
	<li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin,+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions.">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li><li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honor+thy+symbionts.">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li><li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+normal+gut+microbiota.">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li><li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+intestinal+fermentation:+association+between+food+components,+delivery+systems,+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut.">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model.">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans,+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model.">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).</li><li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms:+a+novel+concept.">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli.">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li><li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease.">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).</li><li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems.">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microbial+community+reproducibility,+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model.">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li><li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+the+gut+microbiome.">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li><li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology.">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li><li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety,+Depression,+and+the+Microbiome:+A+Role+for+Gut+Peptides.">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li><li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota.">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li><li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats.">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li><li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+Versus+Phylogeny:+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species.">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth.">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4 (2018).</li><li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling.">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li><li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans.">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li><li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces.">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58 (2015).</li><li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs.">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li><li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro:+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract.">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li><li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota:+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites.">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li><li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus.">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li><li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+Database+Project:+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis.">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li><li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator.">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).</li><li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+The+Simulator+of+the+Human+Intestinal+Microbial+Ecosystem+(SHIME+&#174;).">Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME &#174;).</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model.">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li><li>Possemiers, S., Verth&#233;, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li><li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li><li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota:+a+key+regulator+of+metabolic+diseases.">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li><li>Sonnenburg, J., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism.">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li></ol>

In vitro dyrking systemer er utviklet for å studere tarmen bakterieflora i tykktarmen. De bruker apparatene for å simulere de fysiologiske forholdene av mage-tarmkanalen, fremme vekst av en moden gut mikrobielle samfunn for hver region av kolon33. Mens begrepet er logisk og forståelig, krever selve driften av i vitro dyrking systemer å studere tarmen bakterieflora presisjon og en forståelse av hva som kreves og forventet å produsere pålitelige resultater.
Nødven...

Tarmen bakterieflora er et fellesskap av mikroorganismer i den menneskelige mage-tarmkanalen (GIT).  Dette fellesskapet når maksimal konsentrasjon i tykktarmen, som anslås for å holde 1013-1014 bakterier, fra 500-1000 arter som lever i symbiose med kolon miljøet1,2. Sammensetningen og funksjonaliteten til tarmen bakterieflora endre romlig langs GIT, danner regionen grupper, med de fleste mangfoldet funnet distally2,3,4,5. For hver anatomiske region bor separat mikrobielle samfunn som i lumen og på slimhinnene slimhinnen6. Lumen samfunnet har mer direkte tilgang til næringsstoffer som underlag går gjennom den luminal kupeen7. Til tross for dette bor noen bakterier fortrinnsvis i Slim laget, bruker mucin produsert av kolon cellene som en energi kilde1,5,8. Forskjellen i microenvironments mellom luminal og mucosal resultatene i divergens og utvikling av fase grupper. Sammen gi disse samfunnene metabolske funksjoner som metabolisme til næringsstoff og produksjon av vitaminer og immunologiske funksjoner, som hindrer koloniseringen av mennesker1,3, 9. tarmen bakterieflora fungerer også funksjonelt i Bøyning med menneskelige kolon celler3.
Som en viktig del av menneskelig GIT er det ikke overraskende at tarmen bakterieflora er kjent for å bidra til både vert helse og sykdom status3,9,10,11,12. En endring i tarmen mikrobiell befolkningen er tilknyttet flere menneskelige sykdommer, inkludert GIT lidelser som intestinal tarmsykdom (IBD) og intestinal tarm (IBS), men også andre sykdommer, som fedme, sirkulasjons sykdom og autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolitter produsert fra tarmen bakterieflora ha en global effekt, nå steder langt fra tarmen12,13. For eksempel er gut-hjerne aksen forbundet med psykiske lidelser som angst og depresjon14. Derfor studerer tarmen bakterieflora er viktig for flere felt for forskning, og gjelder for mange sykdommer, selv de ikke ofte knyttet til GIT.
Det er allment anerkjent at studere tarmen bakterieflora er viktig, er det en komplisert oppgave. Flere dyr modeller er tilgjengelig, fra små dyr som sebrafisk, rotter og mus, større de som aper og griser15-19. Men anvendelsen av disse dyrene i menneskelige tarmen bakterieflora er ikke enkelt, siden disse dyrene har en unik bakterielle samfunnet som har utviklet seg basert på miljø og kosthold, og de er anatomisk forskjellige mennesker20 , 21. Bruk av mennesker fjerner spørsmålet om relevansen men introduserer et nytt sett med utfordringer. Menneskelige studier er dyrt, tidkrevende, og etisk begrenset11. Videre påvirker forvirrende faktorer tarmen bakterieflora i menneskelige studier, inkludert alder eller utviklingsstadiet, miljø, kosthold, medisiner og genetiske faktorer2,4,22.  Det er også begrensninger på hva kan testes i mennesker, og hvilken type prøver kan høstes hva ganger4.
Én viktig ulempe med å bruke en i vivo system for å studere tarmen bakterieflora er tilstedeværelsen av pattedyr komponenter. Tarmen bakterieflora og menneskelige celler samhandle med hverandre, og i en i vivo innstillingen, er det umulig å skille de to. Metabolitter produsert av tarmen bakterieflora er tatt av kolon celler, slik at målene ikke kan beregnes med presisjon. Derfor skal noen mekanistisk studier begrenses til sluttpunktet målinger11. En annen stor ulempe for i vivo studier er manglende evne til å høste prøver fra de ulike regionene i GIT langs23. Dette tillater ikke for vurdering av endringer som kan oppstå i microenvironments av kolon over tid12.  Mange i vivo studier, inkludert menneskelige studier, stole på analyse av fecal prøver å oppdage endringer i tarmen bakterieflora12. Mens dette er informativ, den gir ikke data på tarmen bakterieflora over GIT og skiller ikke mellom luminal og mucosal samfunn5,6,7,8.
For tarmen bakterieflora, er anvendelse av en i vitro metode nødvendig å studere dynamikken i den bakterielle samfunnet, uten innblanding fra pattedyr komponentene. Bruke en i vitro metoden tillater tett kontroll av miljøforhold10, testing av flere parametere samtidig og muligheten til å smake på langs, og i store mengder11. Siden en i vitro metoden benytter en mekanisk enhet og ikke en vert, kreves ingen hensyn for alder, miljø, diett eller genetisk bakgrunn. Disse systemene kan brukes til å teste enten hele gut microbiota samfunnet, bare valgt organismer, eller selv enkelt stammer. Viktigere, i vitro resultater er reproduserbare, men beholde et nivå av mangfold sammenlignbare i vivo studier11,22.
Avhengig av hypotesen aktuelle og de ønskede resultatene, jegn vitro studier kan utføres på flere måter.  Bruke én-fartøy systemer og enkle metoder, for eksempel rugende prøver med fekal homogenate24 eller utføre én satsvis kulturer i løpet av 24-48 h25. De kan også gjøres enkelt-fartøy systemer og mer kompliserte metoder, som bruker et chemostat system for å produsere en stabil gut mikrobielle samfunn11. Men kan bruk av en enkelt reaktoren over forenkle bakterieflora12 siden representerer den bare en del av kolon, selv om kolon består av regionene stigende tverrgående og synkende.
For å studere gut microbiota samfunnet som utvikler seg i de ulike regionene i tykktarmen (stigende tverrgående og synkende regionene), kan et komplisert flertrinns system anvendes. I disse systemene defineres flere fartøy å etterligne de ulike regionene i tykktarmen, så tarmen bakterieflora i stigende, tverrstilt og synkende er dyrket uavhengig. Disse fartøyene er tilkoblet, bruker pumper flytte underlag i rekkefølge, fra stigende til tverrstilt til den synkende tykktarm regioner, etterligne flyten av næringsstoffer gjennom GIT.
Målet med denne studien var å demonstrere hvordan et 5-trinns i vitro kultur-systemet (se Tabellen for materiale) kan brukes til å dyrke gut microbiota samfunnet, og å vise samfunnet dynamics stabilitet og komposisjon. I dette systemet, et kar representerer magen og en representerer tynntarmen. Kolon er delt i tre regioner (stigende, tverrstilt, synkende) med ett fartøy som representerer hver region26. I denne eksperimentelle oppsett, to komplette systemer var kjøre parallelt, med enhet 1 inneholder mucin flyselskapene representerer slimhinnen og enhet 2 inneholder ingen mucin bærere. Samfunnene som utviklet luminal og mucosal faser av hver region ble sammenlignet hverandre og fecal inoculum over tid med 16S rRNA genet sekvensering og SCFA analyse. Resultatene presenteres viser typen samfunnet, både i sammensetning og funksjonalitet, som kan produseres fra denne type i vitro system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWINSHIME</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing</td>
			<td>cole Parmer</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine Drainage bag</td>
			<td>Bard</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsorb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fecal sample</td>
			<td>Openbiome</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined medium</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxgall Bile</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass ware</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization pouches</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeadBug</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free, DNAse free, sterile water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25&#181;m</td>
			<td>Restek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mucin carriers</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota

Menneskelige tarmen bakterieflora spiller en viktig rolle i både helse og sykdom. Studere tarmen bakterieflora bruker en i vivo -modellen, er vanskelig på grunn av den komplekse naturen og variert tilknytningen pattedyr komponenter. Målet med denne protokollen er å kultur tarmen bakterieflora i vitro, som muliggjør studiet av gut microbiota dynamikken, uten å vurdere bidrag av miljøet pattedyr. Bruker i vitro dyrking teknologi, er de fysiologiske forholdene av mage-tarmkanalen simulert, inkludert for eksempel pH, temperatur, anaerobiosis og Transporttid. Intestinal overflaten av kolon simuleres ved å legge mucin-belagt bærere, opprette en mucosal fase og legge ytterligere dimensjon. Tarmen bakterieflora er introdusert av vaksinere med menneskelig avføring materiale. Ved vaksinasjon med dette kompleks blanding av bakterier, bestemte mikrober er beriket i forskjellige langsgående (stigende, tverrstilt og synkende kolon) og tverrgående (luminal og mucosal) miljøer i vitro modellen. Det er viktig å la systemet nå en steady-state, som samfunnet og metabolitter produsert forbli stabile. Eksperimentelle resultatene i dette manuskriptet demonstrere hvordan inokulerte gut microbiota samfunnet utvikler seg til en stabil samfunnet over tid. Når steady state er oppnådd, kan systemet brukes til å analysere bakteriell interaksjoner og community funksjoner eller for å teste effekten av tilsetningsstoffer på tarmen bakterieflora, som mat, mat komponenter eller legemidler.

Over protokollen beskriver satt opp, vaksinering og kjøring av en 5-trinns i vitro system å studere tarmen bakterieflora i tykktarmen. For å generere dataene som presenteres nedenfor etter DNA utvinning, ble 16S rRNA markør genet DNA sekvensering av regionen V1V2 utført ved hjelp av høy gjennomstrømning sekvensering (f.eks, MiSeq Illumina plattform) av Microbiome Center ved Children's Hospital Philadelphia27. QIIME (kvantitative innsikt Microbial Ec...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Bruke avansert In Vitro dyrking teknologi for å studere menneskelige tarmen bakterieflora

Her presenterer vi en protokoll for dyrking tarmen bakterieflora i tykktarmen i vitro, med en rekke bioreaktorer som simulere de fysiologiske forholdene av mage-tarmkanalen.

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Målet med denne protokollen er å kultur gut microbiota in vitro. Det vil tillate for studiet av mikrobiota dynamikk uten å måtte vurdere bidraget fra en moderne komponent. Ved hjelp av dette flertrinns in vitro-systemet teller vi mikrobiotasamfunnet for å utvikle seg i luminen og på slimhinnen i multi-regioner av tykktarmen kan startes samtidig.En visuell demonstrasjon av denne metoden er nyttig på grunn av kompleksiteten i dette in vitro-systemet. Begynn med å fylle det stigende tykktarmen med 500 milliliter definert medium, tverrgående kolon med 800 milliliter definert medium, og det synkende kolonet med 600 milliliter definert medium. Tilsett mucin agricarriers til kolonområdene i en mengde proporsjonal med volumet av reaktoren, og bruk prøverøret og sprøyten til å fjerne overflødig definert medium fra hver reaktor.Bruk pH-probene til å justere pH-en i hver reaktor. Og slå på nitrogenspylingen i 20 minutter. Deretter tine fecal homogenate i henhold til produsentens retningslinjer før du laster en 60 milliliter sprøyte med fekal homogenat prøve.Deretter inokulerer hver kolonreaktor gjennom prøveporten med en mengde homogenat lik 5% av hvert reaktorvolum for overnattingskultur med pH-kontroll. Neste morgen, rengjør luerlåsen på prøveporten til hver bioreaktor med alkohol. Når portene har tørket, kobler du 30 millilitersprøyten, ryddet av all luft, til en av prøveportene.Trekk stempelet tre til fem ganger for å sikre en grundig blanding av karkomponentene før du aspirerer 15 milliliter av kulturens supernate fra bioreaktoren. Overfør deretter armaturprøven til et sterilt Falcon-rør og legg på is. For DNA-analyse, samle en til tre milliliter luminalvæske ved hjelp av en fem milliliter sprøyte.Samle supernate danner de andre bioreaktorene på samme måte. For å sette til side prøvemateriale for kortkjedede fettsyreanalyser, sentrifuge 15 milliliter av luminalprøven av interesse, og sprøyte filtrerer supernatet gjennom et 0,2 mikrometerpofilter for minus 80 grader Celsius lagring. For å sette til side prøvemateriale for DNA-analyse, sentrifuge en milliliter luminalvæske og lagre pellet på minus 80 grader Celsius.For mucosal prøvehøsting, fjern de tilberedte mucinbærerne fra fire grader Celsius lagring og slå på nitrogenspylingen. Åpne reaktorlokket raskt og skift ut 50 % av bærerne i hver reaktor med nye. Når alle bærerne er skiftet ut, må du raskt lukke lokket og vedlikeholde nitrogenspylingen i ytterligere 20 minutter.Deretter aliquot 0,25 til 0,5 gram mucin carrier agar i individuelle to milliliter rør for minus 80 grader Celsius lagring til DNA ekstraksjon. Tre ganger om dagen går systemet automatisk. Dette begynner med 140 milliliter definert medium overført til magebioreaktoren etterfulgt av en times inkubasjon med pH-kontroll.På slutten av inkubasjonen overføres innholdet i magen til tynntarmen sammen med 60 milliliter bukspyttkjerteljuice. I tynntarmens bioreaktor justeres pH automatisk til 6,7 til 6,9, og innholdet inkuberer i 90 minutter. Under denne inkubasjonen er nitrogenspylingen for hvert system slått på i totalt 10 minutter.På slutten av denne inkubasjonen overføres innholdet fra tynntarmen til det stigende tykktarmen, fra det stigende tykktarmen til tverrgående kolon, fra tverrgående kolon til det synkende tykktarmen, og fra det synkende tykktarmen til avfallet. I denne representative hovedkoordinatanalysen endret samfunnet seg avskrivbart mellom dag én og syv. Men fra dag 11 post inokulasjon til slutten av eksperimentet, prøvene okkupert en liten region av de viktigste koordinater analyseplass for både prøve for å prøve avstand score basert på operasjonell taksonomisk enhet, tilstedeværelse til fravær, og overflod.Målingen av tre fremtredende kortkjedede fettsyrer avslører at propionsyre, butanosyre og eddiksyre svinger fra starten av eksperimentet til dag 15 etter inokulasjon. Etter dag 15 forble mengdene av disse syrene produsert i hvert kolonområde konstant med bare minimale endringer til slutten av eksperimentet. Analyse av det stabile samfunnet for luminal- og slimhinnefasen i hver kolonregion viser at samfunnene som utvikler seg i de enkelte kolonområdene i in vitro-systemet, ligner fekal inokulumsammensetning.Sammenligning av alfamangfoldet i in vitro-systemet avslører et lignende nivå av mangfold som inokulumet for alle regionene unntatt luminalprøvene fra den stigende regionen. Viser at in vitro kultursystemet er i stand til å produsere et samfunn som kan sammenlignes med fekal inokulum både når det gjelder sammensetning og mangfold. For å produsere et stabilt tarmmikrobiotafellesskap ved hjelp av denne protokollen, er det avgjørende å sikre at løsningene tilberedes nøyaktig og at aerobe forhold og pH-parametere opprettholdes gjennom hele eksperimentet.Etter denne prosedyren kan prøver analyseres for fellesskapssammensetning ved hjelp av neste generasjons DNA-sekvensering etterfulgt av bioinformatisk analyse og for funksjonalitet ved hjelp av metabolomikk.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Dyrking Mouse Cardiac Ventiler i miniatyr Tissue Culture System

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

TAPE: En biologisk nedbrytbart Hemostatic Lim Inspirert av en allestedsnærværende forbindelse i Anlegg for Kirurgisk Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur of Living mikrobiomer med mikro-oppbygd Menneskelig tarmtotter i en Gut-on-a-Chip mikrofluid Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

Å skape et strukturelt realistisk Finite Element geometriske modell av en Cardiomyocyte å studere rollen til mobilnettet arkitektur i Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...